Важным компонентом формирования и созревания системы мать-плацента-плод является фетоплацентарный ангиогенез. Согласно современным представлениям, процесс ангиогенеза подразделяется на два обширных этапа: васкулогенез и собственно ангиогенез. При этом васкулогенез представляет собой процесс образования кровеносных сосудов de novo из мезодермальных клеток-предшественников, тогда как ангиогенез – развитие новых сосудов из тех, которые сформировались во время васкулогенеза.
Следует подчеркнуть, что васкуляризация ворсин плаценты первой генерации является результатом васкулогенеза, а не врастания эмбриональных сосудов в плаценту. При этом формирование сосудистой сети происходит под воздействием множества регулирующих медиаторов – так называемых ангиогенных и антиангиогенных факторов [1]. Важная роль принадлежит представителям семейства сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF). Данное семейство представлено несколькими секреторными гликопротеинами, в частности VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D и VEGF-E. Все представители семейства VEGF могут связываться со специфическими VEGF-тирозинкиназными рецепторами 1, 2 и 3-го типа (VEGFRs 1, 2, 3).
VEGF-A – один из важнейших регуляторов ангиогенеза, особенно ранних его этапов. Существует множество изоформ VEGF-A, большая часть которых в организме человека представлена полипептидами, содержащими в составе своей молекулы 121, 165 или 189 аминокислотных остатков [18]. Для всех изоформ VEGF-A характерно высокое сродство к рецепторам VEGFR-1 и VEGFR-2.
VEGF-B существует в виде двух альтернативно связанных форм: VEGF-B167 и VEGF-B186. Инактивация VEGF-B в экспериментах на мышах приводит к нарушению сердечной проводимости и увеличению числа клеток воспалительного ответа в крови, однако не влияет на процесс формирования сосудистой системы [9, 33].
VEGF-C и VEGF-D изначально синтезируются в виде предшественников с удлиненными N- и C-концевыми фрагментами полипептидной цепи. Протеолитическое отщепление C-сегмента ферментом конвертазой ведет к образованию поли-пептида массой 30 кД, обладающего промежуточной аффинностью по отношению к рецептору VEGFR-3 [36]. Повторный протеолиз, опосредованный плазмином, приводит к образованию изоформы медиа-тора массой 21 кД, высокоаффинной по отношению к рецепторам VEGFR-2 и VEGFR-3 [32].
Гиперэкспрессия VEGF-C и VEGF-D у трансгенных мышей приводит к гиперплазии лимфатических сосудов. Напротив, подавление этих медиаторов, вызванное гиперэкспрессией растворимой формы VEGFR-3 кератиноцитами базального слоя эпидермиса трансгенных мышей, ведет к остановке роста лимфатических сосудов [24]. При этом лимфатические капилляры формируются из эндотелиоцитов и не происходит образования первичных лимфатических мешков из вен. Подобные изменения способствуют избыточному накоплению в тканях межклеточной жидкости. Мыши, гетерозиготные по указанной аллели, жизнеспособны, однако у них развивается лимфедема вследствие гипоплазии лимфатической системы [25].
В исследованиях на животных [19] показано, что VEGFR-1 (flt-1) регулирует активность VEGF-A в предшественниках эндотелиальных клеток. При иммуногистохимическом исследовании положительная экспрессия VEGFR-1 выявлена в эндотелиоцитах, а также в макрофагах и трофобласте ворсин плаценты человека. Установлено, что трофобласт плаценты человека и мышей очень богат растворимым VEGFR-1 [20]. В то же время делеция тирозинкиназы, кодирующей часть гена VEGFR-1, не влияет на формирование сосудистых структур [21]. Эти данные позволяют предположить, что существует внеклеточная часть молекулы (растворимый антагонист VEGF, sflt-1), необходимая для развития сосудов плаценты.
Несколько лет назад был открыт новый фактор роста, выделяемый клетками эндокринных желез. По своей структуре он оказался очень близок к семейству VEGF и поэтому был назван сосудистым эндотелиальным фактором роста, выделенным из эндокринных желез (ED-VEGF). Этот фактор также известен как прокинетицин-1 (PK-1) [25]. В организме человека ED-VEGF воздействует на клетки посредством двух связанных с белком G рецепторов, названных PKR1 и PKR2 [31]. Экспрессия ED-VEGF выявлена в клетках яичек, надпочечников, яичников и плаценты, а его эффекты ограничены эндотелиоцитами этих органов [30].
Процесс васкуляризации ворсин у человека начинается примерно на 21-й день гестации на стадии 4-сомитного эмбриона. У близкородственных макак-резусов с продолжительностью беременности 166 дней процессы васкулогенеза в плаценте начинаются на 19-й день беременности. Примечательно, что на этой стадии ворсинчатое дерево представлено первичными (солидный трофобласт) и вторичными ворсинами, в центре которых имеется рыхлая мезенхимальная строма, исходящая из экстраэмбриональной целомической полости.
Наряду с этим тяжи гемангиобластов, которые расцениваются в качестве первых предшественников фетального эндотелия, выявляются в строме ворсин уже на 15-й день беременности при иммуногистохимическом изучении моноклональных антител к CD34 [26]. Гемангиобласты формируют струновидные скопления полигональных клеток, так называемые angiogenic cell cords, которые отличаются от их мезенхимальных предшественников меньшим количеством органелл и отсутствием выростов цитоплазмы. Сами клетки соединяются между собой посредством десмосом или дископодобных соединений, напоминающих плотные контакты. Межклеточные пространства узкие. Достаточно часто к скоплениям гемангиобластов подходят отростки рядом лежащих мезенхимальных клеток.
Установлено, что VEGF-A, отвечающий за формирование, рост и агрегацию предшественников эндотелиальных клеток при образовании ангиогенных тяжей, начинает экспрессироваться на ранних сроках беременности; основными источниками этого фактора являются трофобласт и стромальные макрофаги ворсин [7]. Предположение, что продуцируемый макрофагами ангиогенный фактор роста, каковым является VEGF-A, участвует в васкулогенезе, подтверждает и тот факт, что макрофаги локально дифференцируются в строме ворсин еще до развития ангиогенных тяжей.
Примечательно, что при отсутствии VEGF-A у эмбриона не формируются кровяные островки, эндотелиоциты и первичные кровеносные сосуды. Делеция же даже одной аллели гена, ответственного за синтез VEGF-A, приводит к гибели эмбриона [37]. Трансгенная инактивация обеих аллелей VEGF-C также ведет к внутриутробной гибели плода.
Иммуноферментный анализ сыворотки крови беременных женщин показал, что уровень VEGF практически не меняется в течение беременности, но резко возрастает в послеродовом периоде (3–5-е сутки) [5]. Подобные изменения, видимо, связаны с тем, что в течение беременности VEGF связывается со специфичным белком, подавляющим его иммунореактивность при проведении иммуноферментного анализа [38].
В свою очередь при иммуногистохимических исследованиях установлено, что экспрессия VEGF-A и VEGFR-2 наиболее интенсивна на ранних сроках беременности. С течением беременности выраженность их уменьшается [8, 29].
Наряду с этим методом гибридизации in situ в плаценте овец было выявлено постоянное увеличение содержания м-РНК VEGF в течение беременности [12]. Эти данные еще раз подчеркивают опасность чисто механического переноса полученных экспериментальных данных о развитии плаценты на человека. Баланс между секрецией VEGF-A и плацентарным фактором роста (PlGF) может регулироваться напряжением кислорода. Так, экспрессия VEGF и его рецепторов как in vivo, так и in vitro возрастает в условиях гипоксии. Противоположное влияние оказывает гипоксия на экспрессию PlGF [27].
Низкой концентрацией кислорода в тканях плаценты обусловлена и высокая экспрессия ED-VEGF в I триместре беременности. Более того, его экспрессия повышается при гипоксии [22]. Установлено, что ED-VEGF подавляет процессы миграции и инвазии вневорсинчатого трофобласта путем снижения синтеза и активности матриксных металлопротеиназ 2-го и 9-го типа (MMP-2 и MMP-9) – ведущих ферментов, синтезируемых клетками цитотрофобласта в I триместре беременности [11].
В исследованиях на норках установлено, что в начале беременности отмечается достаточно высокая экспрессия как VEGFR-1, так и VEGFR-2 [40]. На более поздних сроках экспрессия VEGFR-2 снижается, а VEGFR-1 – не изменяется [8, 29].
Специфическая инактивация гена VEGFR-1 ведет к активации и дифференцировке гемангиобластов, что в свою очередь вызывает усиленный рост эндотелиоцитоподобных клеток и дезорганизацию кровеносных сосудов [19]. Потеря только одного, внутриклеточного, домена VEGFR-1 не ведет к нарушению ангиогенеза, однако снижает активность опухолевого ангиогенеза [21]. Это подтверждается результатами ряда исследований, свидетельствующими о том, что сигнальная система VEGFR-1 играет важную роль в патологическом ангиогенезе путем мобилизации эндотелиальных клеток-предшественников из костного мозга [13, 36].
Рецептор VEGFR-2 первоначально экспрессируется гемангиогенными клетками латеральной пластинки мезодермы, но в последующем он выявляется только в клетках кровяных островков. В экспериментах на мышах установлена роль VEGFR-2 в ранней дифференцировке гемангиобластов фетоплацентарных капилляров. Специфическая инактивация гена этого рецептора ведет к нарушению формирования кровяных островков и эмбриональных кровеносных сосудов, вызывая гибель эмбриона [35]. Активация рецептора VEGFR-2 усиливает пролиферацию и миграцию эндотелиоцитов, а также повышает проницаемость кровеносных сосудов [18].
Рецептор VEGFR-3 изначально экспрессируется клетками всех эмбриональных сосудов. Однако по мере развития эмбриона его экспрессия ограничивается эндотелиоцитами лимфатических сосудов и капилляров фенестрированного типа. Реэкспрессия VEGFR-3 клетками других сосудов отмечается, как правило, при патологическом ангиогенезе [24]. Эмбрионы мышей, у которых отсутствует ген VEGFR-3, погибают на ранних сроках гестации вследствие дефекта процесса ремоделирования первичной сосудистой сети, ведущего к невозможности нормального развития сердечно-сосудистой системы еще до начала формирования лимфатических сосудов [17].
На 21-й день беременности начинается формирование эндотелиальных каналов с локального расширения центрально расположенных межклеточных щелей, которые в дальнейшем преобразуются в широкий просвет. В отличие от других органов в плаценте никогда не наблюдается формирование просвета путем слияния интраэндотелиальных вакуолей [26]. Наоборот, просвет фетоплацентарных капилляров в большинстве случаев формируется путем замещения ограниченных участков внеклеточного вещества тяжами гемангиобластов. Следует отметить, что образование таких, еще не связанных между собой капилляров знаменует превращение вторичных ворсин в третичные.
В этот период дифференцировки вторичных ворсин в третичные в макрофагах их стромы отмечается выраженная экспрессия VEGF-A и его рецептора – VEGFR-2 (KDR/flk-1). На более поздних сроках беременности VEGFR-2 локализуется в эндотелии ворсин [26].
К 28-му дню гестации гемангиобластные тяжи сформированы уже в большинстве ворсин. Они представлены скоплениями уплощенных эндотелиальных клеток вокруг удлиненных полигональных просветов. Вплотную к эндотелию прилежат мезенхимальные клетки, отростки которых проникают между эндотелиальными клетками. Эти «юкстагемангиобластные» клетки характеризуются хорошо развитой гранулярной эндоплазматической сетью и рассматриваются в качестве предшественников перицитов. Кроме того, обсуждается участие этих клеток в увеличении пула эндотелиальных клеток [14].
В этот период в просвете капилляров отмечаются гемопоэтические стволовые клетки. Однако в циркуляции они не участвуют, поскольку отсутствует связь между капиллярами плаценты и сосудами пуповины. Позже, между 32-м и 35-м днем гестации, происходит слияние отдельно лежащих капилляров ворсин друг с другом [10]. Затем начинаются процессы васкулогенеза в аллантоисе, после чего устанавливается связь между интраэмбриональными и плацентарными сосудами [16].
Последующие стадии ангиогенеза (с 32-го дня по 25-ю неделю беременности) могут быть подразделены на 3 частично перекрывающихся периода:
Формирование капиллярной сети в срок с 32-го дня до 25-й недели беременности с преобладанием разветвленных сосудов.
Регрессия периферических капиллярных мембран и формирование центральных стволовых сосудов в течение 15–32 нед беременности.
Образование терминальных капиллярных петель с преобладанием неразветвленного ангиогенеза c 25-й недели до конца срока беременности.
Примерно с 32-го дня беременности до конца I триместра эндотелиальные трубочки трансформируются в примитивные капиллярные сети путем сбалансированного взаимодействия двух параллельных механизмов: удлинения предсуществующих трубочек (неразветвленный ангиогенез) и разветвления этих трубочек посредством отхождения боковых почек (разветвленный ангиогенез). Возможен также микрососудистый рост путем инвагинаций.
В строме самых молодых ворсин мелкого калибра (так называемые мезенхимальные ворсины) разветвленный ангиогенез встречается реже, чем неразветвленный ангиогенез. В связи с этим капиллярная сеть в них слабо выражена. С увеличением срока беременности и диаметра ворсин происходит стимуляция разветвленного ангиогенеза, вследствие чего умеренно выраженная капиллярная сеть трансформируется в плотную двухмерную сеть преимущественно вблизи поверхности ворсин. Этот процесс особенно выражен в незрелых промежуточных ворсинах, которые развиваются из мезенхимальных ворсин на 9-й неделе беременности [26].
Изучая роль факторов роста в развитии архитектоники ворсинчатого дерева, авторы [26] высказали предположение, что окончательная геометрия ворсин плаценты определяется в какой-то степени сбалансированным взаимодействием VEGF-A и PIGF с их рецепторами. Преобладание VEGF-A обеспечивает формирование разветвленной капиллярной сети с низким сопротивлением в мезенхимальных и незрелых промежуточных ворсинах, которые превалируют в течение первых двух триместров беременности. Отсутствие же хорошо развитой капиллярной сети и наличие неразветвленных капиллярных петель в последнем триместре объясняются преобладанием PIGF и его рецептора VEGFR-1.
В экспериментах in vitro с хориоаллантоисной мембраной цыплят показано, что связывание VEGF с обоими его рецепторами (VEGFR-1 и -2) стимулирует ангиогенез с ветвлением сосудов и, следовательно, приводит к формированию разветвленной капиллярной сети [39]. Наиболее интенсивная экспрессия VEGF-A и VEGFR-2 отмечается на ранних сроках беременности, с течением беременности она заметно снижается [29].
На 6-й неделе беременности начинается и к 10-й неделе заканчивается формирование базальной мембраны вокруг эндотелиальных трубочек и перицитов.
В течение третьего месяца беременности часть центрально расположенных эндотелиальных каналов промежуточных ворсин достигает крупного диаметра (100 нм и более). В их структуре начинает определяться тонкая медия, а также подобие адвентициальной оболочки, представленной концентрическими фиброзными волокнами. Определяются предшественники гладкомышечных клеток, которые, кроме виментина и десмина, экспрессируют α- и γ-гладкомышечный актин. Несколько позже эти клетки начинают экспрессировать гладкомышечный миозин. Данные сосуды являются предшественниками артерий и вен ворсин. В наиболее крупных проксимальных незрелых промежуточных ворсинах адвентиция центрально расположенных предшественников артерий и вен также формирует фиброзный стромальный стержень этой ворсины. С этого момента такие ворсины называются стволовыми [26].
При изучении культуры клеток было показано, что эндотелиоциты и клетки вневорсинчатого трофобласта образуют капилляроподобные структуры. Причем данным свойством обладали только клеточные линии, выделенные в течение первых двух триместров беременности [15, 28]. В эксперименте ED-VEGF препятствовал образованию таких капилляроподобных структур и приводил к уменьшению количества капилляров в ворсинах [23]. Из вышесказанного следует, что ED-VEGF является одним из основных негативных регуляторов развития фетоплацентарной системы и в нормальных условиях предупреждает преждевременную инвазию незрелого трофобласта.
Дифференцировка трофобласта и особенно псевдоваскулогенез на ранних стадиях беременности расцениваются в качестве критических этапов для последующего нормального функционирования фетоплацентарного барьера [34].
Во второй половине беременности в строме стволовых ворсин прогрессируют процессы фиброгенеза, выраженные в большей степени в радиальном направлении по отношению к трофобласту ворсин. Поверхностно расположенная субтрофобластическая капиллярная сеть трансформируется в разреженную параваскулярную капиллярную сеть. Параллельно процессам прогрессирования фиброза стволовых ворсин и трансформации центральных капилляров в артерии и вены наблюдается постепенная регрессия поверхностной капиллярной сети. К концу гестации в крупных стволовых ворсинах выявляется лишь несколько параваскулярно расположенных капилляров. Механизмы, посредством которых происходит регрессия капиллярной сети в стволовых ворсинах, к сожалению, до конца не изучены. Представляет интерес тот факт, что регрессия капиллярной сети в развивающихся стволовых ворсинах сочетается с утратой трофобласта на поверхности ворсин и редукцией макрофагов в фиброзной строме [10], которые, как известно, богаты VEGF-A.
В отличие от вышеописанных процессов дифференцировки и регрессии в проксимальных участках ворсинчатого дерева на периферии плаценты происходит разрастание ворсин (мезенхимальных и незрелых промежуточных) с новой капиллярной сетью посредством как неразветвленного, так и разветвленного ангиогенеза. В течение нескольких недель в этих ворсинах также про-исходят сосудистые перестройки, аналогичные описанным выше, в результате чего они дифференцируются в стволовые ворсины. Таким путем происходит распространение ворсинчатого дерева на периферию.
С 25-й недели до конца беременности рост ворсинчатого дерева переключается с разветвленного ангиогенеза на неразветвленный. Подобное происходит из-за развития ворсин нового типа – зрелых промежуточных ворсин – в наиболее отдаленных участках имеющегося ворсинчатого дерева. Зрелые промежуточные ворсины – это тонкие (диаметром 80–120 нм), вытянутые (длиной более 1000 нм) ворсины, содержащие одну или две длинные капиллярные петли. При анализе пролиферативных маркеров на этой стадии установлено относительное снижение уровня пролиферации трофобласта и повышение уровня пролиферативной активности эндотелия по всей длине этих капилляров, что и обусловливает неразветвленный ангиогенез. Рост капилляров в длину также может осуществляться методом вставки циркулирующих клеток-предшественников эндотелия между уже существующими эндотелиальными клетками. Окончательная длина периферической капиллярной петли превышает 4000 нм [26]. При этом рост капиллярной петли опережает рост ворсины, в результате чего происходит ее скручивание. Петли капилляров ориентированы по направлению к поверхности ворсины, покрытой трофобластом.
Таким образом, формируется терминальная ворсина. Каждая петля образована одним или двумя витками капилляра и покрыта очень тонким (менее 2 нм) слоем трофобласта. Данная структура носит название сосудисто-синцитиальной (васкулосинцитиальной) мембраны. Эти мембраны являются основным местом газообмена между кровью матери и плода. В норме капиллярные петли 5–10 терминальных ворсин соединяются друг с другом в один длинный капилляр центральной зрелой промежуточной ворсины.
С увеличением срока гестации в терминальных капиллярах формируются локальные расширения с образованием крупных синусоидов диаметром более 40 нм. Такие синусоиды, видимо, уравновешивают негативное влияние длинных, мало ветвящихся капиллярных петель на внутрисосудистое сопротивление. На поздних сроках беременности одной из основных функций VEGF является обеспечение повышенной жизнеспособности эндотелиоцитов и стабилизации сосудистого русла. При иммуногистохимическом исследовании плаценты в 38–40 нед гестации VEGF выявляется примерно в 60% клеток вневорсинчатого цитотрофобласта и в таком же количестве эндотелиоцитов сосудов [6]. В обстоятельном исследовании [3] показано, что экспрессия VEGF в нормальной плаценте (38–40 нед) определяется только в тех структурах, которые граничат с межворсинчатым пространством, и это свидетельствует о направленном его транспорте в кровеносную систему материнского организма. Наиболее выраженная иммуногистохимическая реакция выявляется в свободных симпластах, расположенных в межворсинчатом пространстве и представляющих собой отделившиеся от синцитиотрофобласта комплексы, а также в активных синцитиальных «почках». При этом более высокая экспрессия отмечалась в эпителии терминальных и промежуточных типов ворсин по сравнению с таковой в опорных ворсинах I, II и III порядка. Установлено [2], что в зрелой плаценте (39–40 нед) содержание VEGF в 2,2 раза выше, чем в раннем хорионе (6–10 нед). В свою очередь экспрессия VEGF-R3 клетками синцитиотрофобласта и эндотелиоцитами ворсин плаценты при нормальной беременности в 1,57 раза больше (площадь экспрессии 4,88±1,1%), чем экспрессия VEGF [4].
Таким образом, полноценный васкулогенез и ангиогенез в плаценте зависят от сбалансированного взаимодействия ангиогенных факторов, основное место среди которых отводится семейству сосудистого эндотелиального фактора роста. Знание молекулярных основ фетоплацентарного ангиогенеза дает исследователям возможность не только изучить причины и механизмы развития ряда нарушений последа и плода, но и разработать новые, более эффективные методы лечения заболеваний этой группы.
