Окислительный стресс лежит в основе молекулярных механизмов, ответственных за развитие многих воспалительных и инфекционных заболеваний, в частности атеросклероза, сахарного диабета (СД), системной красной волчанки, ревматоидного артрита, онкологических заболеваний и болезней, связанных с процессами старения [1, 2]. Многие ферменты выполняют функции прооксидантов и антиоксидантов для поддержания окислительного гомеостаза в клетках и тканях [3]. Понимание функционирования таких ферментов может проложить путь к созданию принципиально новых терапевтических препаратов для борьбы с воспалительными заболеваниями, в том числе с атеросклерозом.
Генетическое семейство ферментов параоксоназ включает три представителя: PON1, PON2 и PON3 [4]. По данным эпидемиологических исследований, экспрессия генов всех трех ферментов негативно коррелирует с множеством воспалительных заболеваний, включая атеросклероз [4]. Гены параоксоназ расположены в длинном плече 7 хромосомы человека и в 6 хромосоме мышей [5]. Считается, что фермент PON2 является наиболее древним представителем семейства, из которого, вероятно, путем генной дупликации возникли PON3 и PON1 [4, 5]. Фермент PON1 является не только первым описанным представителем семейства, способным гидролизовать параоксон – активный метаболит инсектицида паратиона, но и преобладающим в плазме крови ферментом из всех трех параоксоназ [6]. Большинство ранних исследований было сосредоточено на роли фермента PON1 в токсикологии [7]. После открытия того, что фермент PON1 связан в плазме крови с липопротеинами высокой плотности (ЛПВП) и его причастности к обеспечению ЛПВП антиоксидантными и противовоспалительными свойствами, возникла новая область исследований роли PON1 в патогенезе заболеваний и его физиологических функций [8, 9]. В отличие от PON1, ферменты PON2 и PON3 находятся преимущественно внутри клеток (однако в небольших количествах фермент PON3 также обнаружен в плазме, в связанном с ЛПВП состоянии) и регулируют окислительный стресс, запускаемый внутриклеточными механизмами в ответ на внеклеточные стимулы. Группа ученых во главе с T. Bhattacharyya [9] доказала связь между генетическими детерминантами и активностью фермента PON1 и развитием системного окислительного стресса и дальнейшим риском сердечно-сосудистых осложнений, что указывает на потенциальную роль PON1 в защите сосудов от атеросклероза. Stevens R.S. и соавт. [10] в своем исследовании показали, что рекомбинантный человеческий фермент PON1 защищает организм от отравления фосфорорганическими соединениями. Stoltz D.A. и соавт. [11] продемонстрировали на модели in vivo, что параоксоназы нарушают «чувство кворума» бактерий, и выдвинули гипотезу о роли параоксоназ в регуляции нормальной микрофлоры организма и о связи инфекции и воспаления с развитием сердечно-сосудистых заболеваний. Witte I. и соавт. [12] обнаружили, что фермент PON2 стабилизирует и защищает опухолевые клетки от апоптоза. Schweikert E.M. и соавт. [13] выявили повышенный уровень фермента PON3 в раковых клетках и доказали, что PON3 защищает раковые клетки от гибели. Каждое из приведенных исследований доказывает, что параоксоназы играют важную роль в патогенезе воспалительных процессов, токсикологических, инфекционных и онкологических заболеваний.
Воспаление и атеросклероз
Определяющим доказательством антиатерогенной роли генов, кодирующих параоксоназы, стало наблюдение, что трансгенные мыши с дефицитом PON1 более восприимчивы к интоксикациям фосфорорганическими соединениями и атеросклерозу по сравнению со здоровыми особями [7, 8]. Позднее было обнаружено, что дефицит фермента PON2 также связан с повышенным риском развития атеросклероза [14]. Напротив, суперэкспрессия человеческого PON3 и других генов, кодирующих параоксоназы, защищала мышей от атеросклероза. Таким образом, все три представителя семейства параоксоназ продемонстрировали антиатерогенные свойства на мышиной модели атеросклероза.
Параоксоназа 1
Фермент PON1 защищает липопротеины низкой плотности (ЛПНП) от окисления и наделяет функциями ЛПВП [9]. Исследования, проведенные на PON1-нокаутных и PON1-трансгенных мышах, подтверждают гипотезу о том, что фермент PON1 играет защитную роль в процессах атерогенеза и наделяет ЛПВП антиоксидантными свойствами [8]. В in vivo исследованиях антиоксидантных и антиатерогенных свойств PON1 было показано, что PON1 может стать потенциальным терапевтическим агентом профилактики атеромы [6]. Совместное функционирование PON1 с ЛПВП подтверждает причинно-следственную связь между уровнем PON1, сердечно-сосудистой патологией и связанными с ней воспалительными процессами.
Проведено несколько исследований in vitro на животных и на людях, в которых продемонстрированы противовоспалительные и антиоксидантные свойства фермента PON1. Например, PON1-нокаутные мыши оказались более восприимчивыми к процессам перекисного окисления липидов, воспалению, атеросклерозу, жировому гепатозу, а PON1-трансгенные мыши с повышенной экспрессией человеческого гена PON1 показали более высокую устойчивость к воспалению и атеросклерозу [8]. В in vitro исследованиях доказано, что фермент PON1 защищает ЛПНП от перекисного окисления, и снижение уровня фермента PON1 в плазме крови связано с повышенным риском сердечно-сосудистых заболеваний у людей [9].
В последних биохимических исследованиях было изучено, каким образом фермент PON1 оказывает противовоспалительное и антиоксидантное действие. Группа ученых во главе с Besler C. [15] в своем исследовании описали роль фермента PON1, связанного с ЛПВП, в поддержании эндотелиального атерозащитного эффекта ЛПВП, названного ЛПВП-зависимой стимуляцией эндотелиальной продукции NO. Ученые доказали, что фермент PON1 предотвращает образование в ЛПВП продукта перекисного окисления липидов – малонового диальдегида (MDA). Повышенный уровень MDA в ЛПВП приводит к активации эндотелиального лектин-подобного рецептора 1 окисленного ЛПНП (LOX-1), активации эндотелиальной изоформы βII протеинкиназы С (PKCβII), которая, в свою очередь, ингибирует пути активации eNOS и eNOS-зависимой продукции NO. Авторы продемонстрировали, что ЛПВП у PON1-нокаутных мышей не стимулируют продукцию NO в эндотелиальных клетках аорты. Добавление ЛПВП PON1-нокаутным мышам очищенного фермента PON1 улучшило способность ЛПВП к стимуляции продукции эндотелиального NO. Huang Y. и соавт. [16] в исследовании показали, что при воспалительных процессах миелопероксидаза (MПO), PON1 и ЛПВП связываются друг с другом, образуя тройной комплекс, где ферменты МПО и PON1 частично ингибируют активность друг друга. MПO представляет собой гемсодержащий белок, который находится в лейкоцитах и способствует окислению белков и липидов. При развитии воспалительного процесса MПO связывается с ЛПВП, усиливает окислительный стресс и способствует развитию атеросклероза. Окислитель, образованный МПО, вызывает местную специфическую окислительную модификацию тирозиновых и метиониновых остатков фермента PON1, что приводит к снижению активности PON1. И наоборот, PON1 связывает и частично ингибирует активность MПO. Таким образом, последние данные свидетельствуют о том, что фермент PON1 осуществляет противовоспалительные и антиоксидантные функции, в частности, посредством предотвращения образования MDA, приводя к опосредуемой ЛПВП активации eNOS в эндотелиальных клетках, и ингибирования активности МПО воспалительных ЛПВП. Фермент PON1 был и продолжает оставаться кандидатом на роль нового терапевтического агента для лечения воспалительных и токсикологических заболеваний.
Параоксоназа 2
Дефицит фермента PON2 уменьшает активность дыхательного комплекса и приводит к митохондриальному окислительному стрессу в печени, перитонеальных макрофагах и аорте [17]. На модели in vivo продемонстрированы антиатерогенные свойства фермента PON2 путем модуляции окисления липопротеинов и уменьшения внутриклеточного окислительного стресса. Активные формы кислорода (АФК), синтезируемые в митохондриях, являются основным источником образования внутриклеточных свободных радикалов и возникновения окислительного стресса. АФК играют фундаментальную роль во многих сигнальных путях, способствуя развитию сердечно-сосудистой патологии. Devarajan A. и соавт. [18] предположили, что дефицит фермента PON2 может быть вызван митохондриальным окислительным статусом. Авторы оценили активность митохондриальных комплексов дыхательной цепи переноса электронов (ЭТЦ) в гепатоцитах PON2-нокаутных и здоровых мышей линии C57BL/6J, находящихся на атерогенной диете. По результатам проведенного исследования обнаружено, что у PON2-нокаутных мышей активность митохондриального комплекса I и комплекса III ЭТЦ оказалась более чем на 50% ниже по сравнению с контрольной группой. Кроме того, уровень митохондриальной продукции супероксида оказался значительно выше у мышей с дефицитом PON2, получавших атерогенную диету, а уровень аденозинтрифосфата (АТФ) был снижен по сравнению с группой контроля. Перитонеальные макрофаги мышей с дефицитом фермента PON2 показали значительное уменьшение базального потребления митохондриального кислорода, чем в контрольной группе. Уровень митохондриального супероксида в перитонеальных макрофагах мышей с дефицитом PON2 были значительно выше (р<0,05), а уровень АТФ был значительно ниже по сравнению с группой контроля. Кроме того, уровень супероксида (с использованием MitoSOX) в супернатантах лизатов аорт у PON2-дефицитных мышей оказался значительно выше по сравнению с группой контроля. Значительно большие атеросклеротические поражения аорты и более высокие уровни иммунореактивности макрофагов в разных отделах аорты выявлены у мышей с дефицитом фермента PON2, апопротеина Е и гиперлипидемией по сравнению с группой контроля. Данные результаты продемонстрировали, что антиатерогенная активность PON2 может быть связана с митохондриальной функцией.
Фермент PON2, связанный с митохондриями, эндоплазматическим ретикулумом и плазматическими мембранами
Чтобы определить, вызваны ли изменения в митохондриальном окислительном стрессе прямым или косвенным действием фермента PON2 на функционирование митохондрий, Devarajan A. [18] и соавт. изолировали митохондрии из клеток HeLa и исследовали в них уровень PON2. Ученые обнаружили, что фермент PON2 присутствовал в очищенных митохондриях из клеток HeLa. С целью определения точной субмитохондриальной локализации PON2 были использованы внутренние и наружные мембраны митохондрий из гепатоцитов мышей линии C57BL/6J. Доказано, что PON2 связан с внутренней мембраной митохондрий. Кроме того, по результатам исследования каждого комплекса ЭТЦ выявлено, что PON2 связан с комплексом III. Вестерн-блоттинг фермента COX IV, связанного с внутренней мембраной митохондрий и фермента VDAC, связанного с наружной мембраной, показал незначительное перекрестное загрязнение данных препаратов в проведенных экспериментах. Аналогичные результаты наблюдались с митохондриями, изолированными из ткани сердца мыши. Altenhöfer S. и соавт. [19] доказали, что фермент PON2 уменьшает высвобождение супероксида из внутренней митохондриальной мембраны, независимо от функционирования комплекса I или комплекса III ЭТЦ, регулируемых хинонами.
Суперэкспрессия фермента PON2 защищает клетки от митохондриальной дисфункции
HeLa-клетки со сверхэкспрессией человеческого PON2, регулируемой тетрациклин-индуцируемым промотором, обрабатывались антимицином – соединением, способным высвобождать убисемихинон из ЭТЦ и увеличивать продукцию митохондриального супероксида, или олигомицином – соединением, ингибирующим синтез АТФ. В данных клетках уровень супероксида оказался значительно ниже, а уровень АТФ значительно выше, чем в группе контроля [17].
Фермент PON2 защищает клетки от стресса эндоплазматического ретикулума
Horke S. и соавт. [19] первыми доказали, что фермент PON2 уменьшает вызванный активацией каспаз стресс эндоплазматического ретикулума. Фермент PON2 был обнаружен на ядерных мембранах и мембране эндоплазматического ретикулума. Данный фермент индуцировал промотор и регулировал уровень белка через стресс эндоплазматического ретикулума. Ученые пришли к выводу, что фермент PON2 является эндогенным защитным механизмом от сосудистого окислительного стресса и ферментом, вырабатываемым в ответ на гибель клеток. Horke S. и соавт. [19] продемонстрировали, что PON2 защищает клетки от стресса эндоплазматического ретикулума, вызывающего гибель клеток, путем изменения гомеостаза кальция. Devarajan A. и соавт. [18] сообщили, что PON2 регулирует гомеостаз кальция в макрофагах и выживаемость клеток в условиях стресса эндоплазматического ретикулума и является необходимым компонентом для предотвращения прогрессирования атеросклероза у мышей с дефицитом PON2 и apoE, находящихся на западной диете. Ученые предполагают, что макрофагальный PON2 регулирует общие механизмы развития стресса эндоплазматического ретикулума, митохондриальной дисфункции и развития атеросклероза. Все приведенные исследования доказывают, что PON2 играет важную защитную антиоксидантную роль в развитии воспалительных заболеваний.
Параоксоназа 3
В настоящее время PON3 является наименее изученным представителем семейства параоксоназ [4]. Несмотря на то что ферменты PON2 и PON3 должны быть схожи по функциям и внутриклеточному расположению, последние исследования показали, что их локализация внутри клеток и роль в патогенезе воспалительных заболеваний, вероятно, будут отличаться.
PON3 защищает мышей от развития сахарного диабета и атеросклероза
Reddy S.T. и соавт. [20] первыми продемонстрировали на модели in vitro, что фермент PON3 предотвращает окисление ЛПНП. Чтобы проверить роль PON3 в патогенезе атеросклероза и связанных с ним процессов, группа ученых во главе с Shih D.M. [20] создала две независимые линии трансгенных (Tg) мышей на C57BL/6 J (B6), наделенных геном человеческого PON3, и показала, что при содержании мышей на атерогенной диете область атеросклеротического поражения была значительно меньше в обеих линиях Tg-мышей мужского пола, по сравнению с группой контроля. При удалении рецепторов к ЛПНП у PON3 Tg-мышей также уменьшалась область атеросклеротического поражения. Кроме того, в обеих мужских линиях PON3 Tg-мышей наблюдались похудение и снижение уровня лептина в плазме крови по сравнению с группой контроля. Ученые продемонстрировали, что при повышении уровня экспрессии гена, кодирующего PON3, у мышей-самцов значимо уменьшается образование атеросклеротических поражений и ожирение. Интересно отметить, что нарушалось функционирование митохондрий, выделенных из гепатоцитов PON3-дефицитных мышей, по сравнению с диким типом митохондрий. Предположительно, дефицит фермента PON3, подобно ферменту PON2, нарушает нормальное функционирование митохондрий.
Инфекция и «чувство кворума»
Все три фермента параоксоназ обладают липолактоназной активностью и способны гидролизовать ацилгомосеринлактоны, которые опосредуют бактериальные кворум-чувствительные (QS) сигналы [11, 21]. «Чувство кворума» сильно выражено у некоторых штаммов патогенных бактерий, включая P. aeruginosa, что приводит к тяжелым затяжным инфекциям у иммунокомпрометированных хозяев с кистозным фиброзом, онкологическими заболеваниями и тяжелыми ожогами. Около 10 лет назад в лаборатории Гринберга было доказано, что белки PON обладают способностью инактивировать ацилгомосеринлактоны, что положило фундамент для изучения роли параоксоназ в патогенезе инфекционных заболеваний. Stoltz D.A. и соавт. [11] изучили в эпителиальных клетках дыхательных путей роль ферментов PON1, PON2 и PON3 в инактивации N-(3-оксододеканоил)-1-гомосеринлактонов (3OC12-HSL) – молекул «чувства кворума», продуцируемых грамотрицательными микробными патогенами, такими, как P. aeruginosa. В лизатах эпителиальных клеток трахеи, полученных от PON2-дефицитных мышей, выявлено нарушение инактивации 3OC12-HSL по сравнению с лизатами, полученными от дикого типа мышей. Суперэкспрессия PON2 усиливает деградацию 3OC12-HSL в лизатах эпителиальных клеток дыхательных путей человека.
Devarajan A. и соавт. [22] исследовали восприимчивость PON2-дефицитных мышей к P. aeruginosa (PAO1) и показали, что как в интактных клетках, так и в перенесенных на мембраны белковых лизатах, полученных из PON2-дефицитных макрофагов, выявлено значительное снижение их способности к гидролизу 3OC12-HSL. После введения 1,6×107 КОЕ PAO1 выявлено снижение бактериального клиренса в селезенке, в легких и в печени соответственно в 2,5, 5,7 и 14,8 раза. На модели ex vivo макрофагов PON2-дефицитных мышей после инфицирования PAO1 показано значительное ухудшение фагоцитарной функции по сравнению с группой контроля. Данные результаты указывают на то, что на модели PAO1-инфекции фермент PON2 регулирует врожденный иммунный ответ организма.
Kim D.S. и соавт. [23] исследовали провоспалительные пути, активируемые атерогенными липидами и лактонами «чувства кворума», в PON2-дефицитных эндотелиальных клетках. В ходе исследования было показано, что гены клеточного цикла и активированный митогенами протеинкиназа-сигнальный путь в значительной степени участвуют в ответе человеческих эндотелиальных клеток аорты на внедрение 3OC12-HSL. Авторы пришли к выводу, что антиатерогенные эффекты PON2 могут проявляться разрушением чувствительных к кворуму молекул, таких как 3OC12-HSL, которые способствуют проатерогенному эффекту хронической инфекции.
В одном из последних исследований Schweiker E.-M. и соавт. [24] доказали, что антиоксидантные и противовоспалительные функции PON2 и PON3 являются важной частью врожденного иммунитета к инфекции P. aeruginosa. По результатам приведенных выше исследований можно сделать вывод о том, что ферменты PON являются естественными ингибиторами «чувства кворума» бактерий. Подобно PON2, фермент PON3 не только гидролизует 3OC12-HSL, а также уменьшает окислительный стресс и ингибирует активацию NF-κb пиоцианином – фактором вирулентности P. aeruginosa. Эти исследования подтверждают участие семейства генов, кодирующих параоксоназы, во врожденном иммунитете.
Онкологические заболевания
Witte I. и соавт. выдвинули гипотезу о том, что, поскольку стресс эндоплазматического ретикулума также приводит к развитию рака и обладает резистентностью к противоопухолевым препаратам, PON2 может играть роль в туморогенезе [12]. Опухоли человека, состоящие из PON2-нокаутных клеток, подвергаются апоптозу. Schweikert E.-M. и соавт. [13] в своем исследовании показали, что в опухолях человека происходит избыточная экспрессия PON3, что уменьшает митохондриальное образование супероксида путем секвестрации убисемихинона в раковых клетках и приводит к увеличению выживаемости раковых клеток. Авторы предполагают, что фермент PON3, подобно PON2, может способствовать росту опухолевых клеток. По данным обзора Witte I. и соавт., несмотря на то, что PON2 и PON3 играют защитную роль в патогенезе сердечно-сосудистых заболеваний, они также защищают раковые клетки от гибели [12, 25]. Шахпаронов М.И. и соавт. [26] в 2017 г. впервые проанализировали экспрессию и мутации гена PON2 в злокачественных опухолях 31 типа, а также изучили связь между экспрессией PON2 и выживаемостью пациентов. Наибольшая экспрессия PON2 была выявлена в солидных опухолях, особенно при раке головного мозга и печени. Для этих опухолей также характерна амплификация гена PON2 и корреляция его экспрессии с плохим прогнозом для выживаемости пациентов.
До настоящего времени не проводилось in vivo исследований, подтверждающих канцерогенную роль ферментов PON2 и PON3. Будут проведены дальнейшие исследования на моделях животных по изучению возможных канцерогенных свойств параоксоназ.
Заключение
Экспрессия ферментов параоксоназ снижается при развитии ряда воспалительных заболеваний, в том числе при атеросклерозе и онкологических заболеваниях. По данным опубликованных исследований очевидно, что все три представителя семейства играют важную роль в воспалительных, инфекционных, токсикологических и онкологических заболеваниях. В настоящее время недостаточно изучены механизмы действия и функции параоксоназ. Последующие исследования в данной области, направленные на изучение молекулярных механизмов параоксоназ, позволят внедрить в практику новые диагностические маркеры и терапевтические препараты для лечения воспалительных заболеваний, связанные с развитием стресса эндоплазматического ретикулума и окислительного стресса, включая атеросклероз, бактериальные инфекции и онкологические заболевания.
