С современных позиций синдром поликистозных яичников (СПКЯ) относят к генетически детерминированным нарушениям функции репродуктивной системы [2, 5, 18] и рассматривают как наиболее распространенную форму гиперандрогении у женщин.
На молекулярном уровне эффекты андрогенов опосредуются через активацию андрогеновых рецепторов (АР). АР относятся к семейству лиганд-активированных транскрипционных факторов, которые регулируют рост, дифференциацию,пролиферациюиапоптозклеток-мишеней [17]. Ген АР локализуется на Х-хромосоме (Хq11.2-q12) в относительной близости с областью ее инактивации (Хq13). Первый экзон гена кодирует N-концевой домен (участок транскрипции и активации) и содержит различное количество триплетов цитозин-аденин-гуанин (CAG), которые формируют полиглутаминовую цепь [17]. Число CAG-повторов в норме варьируется от 8 до 35 [17]. Во многих исследованиях была обнаружена обратная зависимость между числом CAG-повторов в гене АР и его активностью [3, 4, 22]. При обследовании мужчин выявлено, что короткие CAG-повторы увеличивают
риск развития рака предстательной железы [26], а длинные – риск мужского бесплодия, связанного с низким уровнем андрогенов [6]. Схожая закономерность была обнаружена у женщин: короткие аллели ассоциировались с гирсутизмом [12], с раннним пубархе, гиперандрогенией яичникового генеза [10], а также с андрогенозависимыми дермопатиями как у женщин, так и у мужчин [20]. В некоторых работах была обнаружена более частая встречаемость короткого аллеля у больных СПКЯ, чем у здоровых женщин [21, 25]. Хотя имеются и противоположные данные об ассоциации классической формы СПКЯ с
длинными (более 22 повторов) вариантами аллелей гена AР [8].
Ген AР находится на Х-хромосоме вблизи центра ее инактивации, в связи с этим имеет значение определение неслучайной инактивации Х-хромосомы. Женщины обычно не страдают Х-сцепленными заболеваниями, одна из Х-хромосом случайным образом инактивируется для обеспечения одинакового количества функционирующих Х-сцепленных генов у обоих полов [19]. Однако, если происходит неслучайная инактивация нормальной Х-хромосомы, экспрессия аномальных аллелей повышается [16]. В частности, высокая представленность неслучайной инактивации Х-хромосомы была обнаружена при различных патологических состояниях репродуктивной системы: преждевременной недостаточности
яичников, раке молочной железы и яичников, привычном невынашивании беременности [1].
Исследование на моно-и дизиготных близнецах с разными фенотипами СПКЯ показало, что многообразие форм может быть обусловлено различной экспрессией Х-сцепленных генов [23].
В 2006 г. T.E. Hickey с группой ученых изучали неслучайную инактивацию Х-хромосомы среди сестер [9]. Сестры с одинаковым CAG генотипом и одинаковой представленностью инактивации Х-хромосомы имели в 30 раз чаще схожие проявления заболевания (фенотип СПКЯ), чем сестры с одинаковым генотипом, но разной представленностью инактивации Х-хромосомы [9]. Это косвенно указывает на участие неслучайной инактивации Х в патогенезе СПКЯ. В исследовании A.S. Nissar было выявлено частое сочетание неслучайной инактивации Х-хромосомы с более длинными CAG-повторами [15]. Неоднозначность результатов проведенных ранее работ и отсутствие аналогичных данных на популяции российских женщин послужило основанием для проведения данного исследования.
Цель исследования – изучение представленности неслучайной инактивации Х-хромосомы, полиморфизма гена АР по CАG-повторам у пациенток с СПКЯ и оценка их роли в формировании
синдрома.
Материал и методы исследования
Были исследованы 117 женщин: основную группу составили 53 пациентки с СПКЯ, группу контроля – 64 здоровые женщины с регулярным менструальным циклом. Средний возраст по группам: 27,3±5,74 и 25,6±4,28 года, индекс массы тела: 24,2±5,47 и 22,4±0,11 кг/м² соответственно. СПКЯ диагностировали в соответствии с Роттердамскими критериями [18]. Нарушения менструального цикла по типу олигоменореи выявлены у 45 (84,9%) пациенток, по типу аменореи – у 3 (5,7%). Жалобы на отсутствие беременности предъявляли 13 (24,5%) женщин.
В протокол исследования входило определение уровней лютеинизирующего гормона (ЛГ), фолликулостимулирующего гормона (ФСГ), эстрадиола (Е2), тестостерона общего (Тобщ), тестостерона свободного (Тсв), андростендиона (АС), тестостерон-эстрадиол связывающего глобулина (ТЭСГ), дигидротестостерона (ДГТ), дигидроэпиандростерона сульфата (ДГЭАС), 17-оксипрогестерона (17-ОП) с использованием наборов «DРС» США, «Immunotech» Чехия, «DBC» Канада, «DSL» США на приборе Immulite (США). Индекс свободных андрогенов (ИСА) рассчитывали по формуле Тобщ × 100%/ТЭСГ. Проводилось ультразвуковое исследование органов малого таза трансвагинальным датчиком на аппарате фирмы Aloka-SSD 650 (Япония).
Гиперинсулинемию и нарушения углеводного обмена диагностировали на основе результатов перорального 2-часового глюкозотолерантного теста с 75 г глюкозной нагрузки. Уровни глюкозы
и иммунореактивного инсулина (ИРИ) определяли натощак, а также каждые 30 мин в течение
последующих2чисследования.Нарушениятолерантности к глюкозе диагностировали, согласно
рекомендациям Международной Диабетической Федерации 2005 г. О наличии инсулинорезистентности судили по индексам HOMA и Caro. Определение ИРИ проводили при помощи набора ИБОХ (Беларусь).
Выявление неслучайной инактивации Х-хромосомы осуществляли с помощью методов, основанных на определении дифференциального метилирования активной и неактивной Х-хромосомы. При этом маркерами инактивации служили полиморфизмы Х-сцепленных генов. Для определения неслучайной инактивации Х-хромосомы применяли метод анализа полиморфизма CAG-повтора в первом экзоне гена АР с использованием метилчувствительной полимеразной цепной реакции. Критерием положительной
оценки неслучайной инактивации Х-хромосмы служило отношение высоты большего пика к сумме высот обоих пиков при анализе продуктов рестрикции HpaII, что повышало точность порогового уровня более чем на 30% от аналогичного отношения при анализе нативной ДНК.
Определение полиморфизма гена АР с подсчетом количества CAG-повторов в 1 экзоне осуществляли с помощью фрагментного анализа продуктов полимеразной цепной реакции. Выделение ДНК из образцов периферической крови пациенток проводили с помощью набора DNAprep100 («Dnalab», Россия) в соответствии с прилагаемой инструкцией по применению. Продукты амплификации подвергались детекции на генетическом анализаторе ABI 3130 Genetic Analyzer («Applied Biosystems», США). Для определения размеров амплифицированных фрагментов использовали внутренний стандарт молекулярных весов GeneScan 500 LIZ Size Standard («Applied Biosystems», США). Для оценки информативности анализируемого локуса проводили определение доли гетерозигот в исследуемой выборке. Анализу подлежали только гетерозиготные варианты гена. Помимо определения частоты распространения аллелей гена АР, была исследована частота SBM, показателя среднего биаллельного значения (simple biallelic mean) – среднее арифметическое число CAG-повторов обоих аллелей; частота
XWBM (X weighted biallelic mean) – показателя средней длины аллелей всех пациенток в группах АА и контрольной с учетом преимущественной инактивации аллелей (оба аллеля «взвешены»).
Статистический анализ экспериментальных данных проводился с использованием ПСП Statistica
8.0, GraphPad InStat v.3.06, GraphPad Prism 5, MedCalc и программы Excel. Достоверность различий средних оценивали с помощью t-теста или методом Манн-Уитни. При сравнении частотных показателей для оценки достоверности использовали χ2 (с поправкой Йейтса для таблиц 2×2)
или точный критерий Фишера. Для выявления и оценки связей между исследуемыми показателями
применялся непараметрический корреляционный анализ по методу Спирмена и регрессионный
анализ.
Результаты исследования
Изучение гормонального профиля выявило различия между группами по основным показателям (табл. 1). Среднее значение уровня ЛГ у пациенток с СПКЯ было в 3 раза выше аналогичного показателя в контрольной группе, существенно различались уровни Тобщ и его метаболитов. В сыворотке крови больных СПКЯ отмечалось снижение концентрации ТЭСГ на 80%, что отразилось на показателе ИСА, который был в 9 раз выше по сравнению с таковым у здоровых женщин.
Рисунок 1. Частота аллельных вариантов CAG-повторов гена AP в группах СПКЯ и контроля.
Таблица 1. Средние значения концентраций гормонов и производных от них показателей.
Для генетического исследования были отобраны 53 образца ДНК больных СПКЯ, информативность ДНК-маркера (доля гетерозигот в исследуемой выборке) составила 94,3%. Длина CAG-повтора варьировалась от 7 до 30 CAG-тринуклеотидов. Контрольная группа была представлена 64 образцами ДНК, информативность составила 87,5% (56/64). Минимальная длина CAG-повтора равна 15, максимальная – 34. Распределение аллельных вариантов представлено на рисунке. В группе СПКЯ наиболее распространенным являлся аллель 23 (CAG) – 13% (14/106), в группе контроля – 19 (CAG) – 18,8% (24/128).
Для определения влияния длины CAG-повтора на риск развития СПКЯ проводили сравнительный анализ длины аллелей в обеих группах, использовали показатель SBM. Установлено, что в группе СПКЯ наиболее часто встречались значения SBM, равные 23 (12,9%), 20 и 21 (CAG) (по 12%), в группе контроля – 19 (CAG) – 18,9% (см. рисунок). Средние значения SBM в основной и контрольной группах не различались: 22,02±2,77 и 21,42±2,26 соответственно.
Неслучайная инактивация Х-хромосомы была определена в 54% (27/50) случаев среди больных СПКЯ и в 16,1% (9/56) – среди здоровых женщин. Сравнительный анализ выявил статистически значимые различия представленности неслучайной инактивации Х-хромосомы между основной и контрольной группами (p<0,0001, ОШ=6,844, 95% ДИ 2,817–16,63). Частота неслучайной инактиавации Х-хромосомы не позволяет определить, какие аллели преимущественно экспрессируются – более длинные или более короткие, в связи с чем был использован показатель, характеризующий как длину CAG-повтора, так и инактивацию несущего его аллеля – XWBM (X weighted biallelic mean).
Несмотря на то что анализ полиморфизма CAG-повтора AР является общепринятым методом оценки инактивации X-хромосомы, способы рассчета и критические значения показателей, вычисленных по аллелям этого повтора, могут отличаться у разных авторов. В данном исследовании за критическое было принято значение повторов, равное 22. Учитывались только информативные случаи (гетерозиготы). В контрольной группе с CAG-повторами более 22 оказались 26% обследованных, в группе пациенток с СПКЯ – 27%. В группе контроля генотип с обоими короткими аллелями выявлен в 39% случаев, в группе СПКЯ – в 23% (p=0,07, ОШ=2,2, 95% ДИ 0,97– 4,95).
Проведена оценка взаимосвязи неслучайной инактивации Х-хромосомы и длин CAG-повторов в гене АР с характером нарушений менструального цикла и гормональным фоном больных (табл. 2).
Таблица 2. Клиническая характеристика женщин с СПКЯ в зависимости от наличия (XCI+) или
отсутствия (XCI-) неслучайной инактивации Х-хромосомы.
Как видно из представленных данных, имелись различия в частоте и тяжести овуляторной дисфункции в группах с наличием и отсутствием неслучайной инактивации Х-хромосомы. Объединение более тяжелых нарушений менструального цикла (олигоменореи с менархе, аменореи) показало, что эти состояния достоверно чаще встречаются в группе с неслучайной инактивацией X-хромосомы (р=0,0285). В этой же группе была выявлена зависимость между длинным аллелем АР и аменореей (р=0,042). Клинические проявления гиперандрогении (алопеция и гирсутизм) от генотипа не зависели.
В группе пациенток с неслучайной инактивацией обнаружена взаимосвязь длин САG-повторов
в гене АР с уровнем Тсв. При длинных аллелях АР (CAG-повторы ≥22) и низкой его активности средний уровень Тсв примерно в 3 раза превышал таковой в группе пациенток с короткими аллелями (7,49±5,79 против 2,27±1,81 пг/мл; р=0,0017). Корреляционной зависимости уровней других гормонов с генотипом больных не выявлено. Сравнительный анализ состояния углеводного обмена в группах с XWBM≥22
и XWBM<22 не показал достоверных различий по уровням глюкозы, инсулина, индекса НОМА (5,13±0,3 и 5,22±1,46 ммоль/мл, 9,41±3,45 и 10,87±4,67 мкЕД/мл, 2,12±0,7 и 2,45±1,1 соответственно), хотя отмечалась тенденция к повышению значений этих показателей у пациенток с короткими аллелями AR.
Обсуждение
В результате проведенного исследования установлено, что в группе пациенток с СПКЯ длина CAG-повторов АР варьируется от 7 до 30, в группе контроля – от 15 до 34. Достоверных различий в распределении длин CAG-повторов между группами не выявлено. Возможно, это связано с малой выборкой больных, а также с особенностью формирования группы СПКЯ, в которую были включены пациентки не только с классической формой, но и с неполными формами или фенотипами синдрома. Отсутствие статистически значимой разницы длин CAG-повторов между СПКЯ и контрольной группой отмечено также в ряде зарубежных исследований [7, 11, 13, 14, 24]. Хотя имеются научные публикации с противоположными данными, указывающими как на бóльшую представленность коротких аллелей CAG-повторов при СПКЯ [25], так и на превалирование длинных вариантов аллелей гена AР при классической форме синдрома [8]. Предположительно такая разница в результатах связана с использованием разных диагностических критериев СПКЯ, а также с включением в исследования различных этнических групп населения с разными длинами CAG-повторов гена АР.
Результаты генетического анализа показали, что неслучайная инактивация Х-хромосомы имеется у каждой второй пациентки с СПКЯ. Это в 3,4 раза чаще, чем в группе здоровых женщин (p<0,0001, ОШ=6,844, 95% ДИ 2,817– 16,63). Наличие неслучайной инактивации Х-хромосомы ассоциируется с более ранними и более тяжелыми нарушениями функции яичников в виде аменореи и олигоменореи с менархе. Полученные данные косвенно подтверждают мнение, что процесс неслучайной инактивации
X-хромосомы является ранним событием онтогенеза, а не возрастным нарушением, как считают некоторые авторы [9]. Полученные данные позволяют думать о роли неслучайной инактивации Х-хромосомы в формировании СПКЯ. Уместно отметить, что неслучайная инактивация Х-хромосомы нередко выявляется при ряде других нарушений репродуктивной функции, к которым относят преждевременную недостаточность яичников и бедный ответ на стимуляцию овуляции [1]. В связи с этим можно полагать, что неслучайная инактивация Х-хромосомы является маркером заболеваний репродуктивной системы, обусловленных нарушениями фолликулогенеза. Предположительно это связано с тем, что неслучайная инактивация хромосомы Х приводит к недостаточному функционированию генов, задействованных в формировании и развитии фолликулярного пула яичников. Поэтому женщины с неслучайной инактивацией Х-хромосомы, вероятно, должны входить в группу риска по овуляторной дисфункции, нарушению ритма менструаций и бесплодию.
В одной из публикаций, посвященной полиморфизму гена АР и ановуляторному бесплодию у пациенток с СПКЯ [24], были представлены данные о взаимосвязи коротких аллелей гена АР, сопряженных с его высокой активностью, с нормальными уровнями тестостерона. Подобная закономерность прослеживалась и в нашем исследовании в группе пациенток с неслучайной инактивацией Х-хромосомы. Это дает основание предположить, что избыточное влияние андрогенов при СПКЯ может быть связано не только с их повышенной продукцией и гиперандрогенемией, но и с активацией АР при нормальных уровнях тестостерона в сыворотке крови. Подобный механизм может лежать в основе формирования так называемого неандрогенного фенотипа СПКЯ, который является одной из четырех форм синдрома [18].
Выводы
1. У каждой второй пациентки с СПКЯ выявлена неслучайная инактивация Х-хромосомы, установлена взаимосвязь с выраженностью нарушений менструального цикла.
2. Неслучайная инактивация Х-хромосомы ассоциируется с более высокой частотой коротких аллелей гена АР и его трансактивационной активностью.
3. Не выявлено различий между группой СПКЯ и здоровыми женщинами по средним длинам
CAG-повторов АР.
4. Установлена прямая корреляционная зависимость между уровнями Тсв. и длиной CAG-повторов АР у пациенток с СПКЯ и неслучайной инактивацией Х-хромосомы.
В целом можно сделать заключение, что необходимы дальнейшие исследования на выборках бóльшего объема для решения вопроса о роли полиморфизма гена АР в генезе СПКЯ и дальнейшего понимания клинико-прогностического значения неслучайной инактивации Х-хромосомы. Полученные результаты дают основание рассмотреть вопрос о целесообразности включения в алгоритм обследования определение неслучайной инактивации Х-хромосомы и полиморфизма АР как молекулярно-генетических предикторов формирования заболеваний, ассоциированных с нарушениями фолликулогенеза, к числу которых относят СПКЯ.
