В физиологических условиях аргинин является полузаменимой аминокислотой, выполняющей пластические и многочисленные регуляторные функции. Однако при различных патологических
состояниях он может расцениваться как незаменимая аминокислота, особенно при осложненной беременности, когда имеет место повышенная нагрузка на все функциональные системы организма матери. Утилизация L-аргинина в клетках, помимо использования в синтезе белков, особенно белков хроматина, в накоплении клеточной энергии в виде креатинфосфата с участием уникальной гуанидиновой группы этой аминокислоты, происходит под действием двух основных ферментных
систем, включающих семейство изоферментов NO-синтаз и аргиназу. Активность именно данных ферментов определяет направленность биологических эффектов аргинина. Аргиназный путь превращения аргинина приводит к образованию орнитина, который в последующем, в зависимости
от включения дополнительных ферментативных реакций, служит субстратом для синтеза пролина (важного структурного компонента сосудистой стенки) или биоактивных полиаминов, играющих
значительную роль в регуляции роста и дифференцировки клеток. Действие NO-синтазы приводит к генерации из аргинина оксида азота – мощного эндогенного вазодилататора и медиатора различных биохимических и физиологических процессов. Указанные компоненты метаболизма аргинина определяют важность поддержания его свободного пула на адекватном уровне. Дисбаланс продукции и использования аргинина в обменных реакциях может сопровождаться нарушением функционального состояния органов и тканей.
Известно, что уровень аргинина в сыворотке крови изменяется в течение беременности, значительно возрастая к ее середине и возвращаясь к исходным величинам перед родами [6, 11], что, очевидно, обусловлено неодинаковыми потребностями развивающегося плода в этой аминокислоте. Важным поставщиком аргинина при беременности является плацента [8], обеспечивающая пополнение аминокислоты не только для собственных нужд (регуляции процессов клеточной дифференцировки, пролиферации, состояния сосудистой стенки и кровотока), но и для поддержания роста и развития плода, для которого аргинин является практически незаменимой аминокислотой [5]. Однако сведения о плацентарном обмене аргинина весьма малочисленны, в то же время они могут расширить наши представления о механизмах развития осложненной беременности.
Целью настоящей работы явилось изучение содержания аргинина, пролина, продукции оксида азота и его производных, активности NO-синтазы и аргиназы в плаценте при физиологической беременности и плацентарной недостаточности (ПН).
Материал и методы исследования
Настоящее исследование проводили на базе клинических и научных подразделений ФГУ Ростовский НИИ акушерства и педиатрии Росмедтехнологий (консультативная поликлиника, отделение патологии беременных, родильное отделение, отдел медико-биологических проблем). В проспективное исследование методом случайной выборки были включены 56 беременных в возрасте от 22 до 27 лет (в среднем 24,9±0,4 года), составивших 3 группы. В 1-ю группу вошли 19 женщин с ПН, у которых беременность закончилась родами в срок (39–40 нед), во 2-ю группу – 17 женщин с у ПН, беременность у которых завершилась преждевременными родами (36–37 нед), 3-ю (контрольную) группу составили 20 женщин с неосложненным течением беременности и родов. У всех женщин 1-й и 2-й групп в соответствии с классификацией А.Н. Стрижакова имела место компенсированная форма ПН, при которой наблюдались гемодинамические отклонения в системе мать–плацента–плод I степени. Диагноз ПН поставлен на основании комплексного динамического обследования. Критериями при постановке диагноза ПН служили: выявление анамнестических факторов риска, изменение толщины и структуры плаценты, количество и качество околоплодных вод, снижение фето- и маточно-плацентарного кровотока при допплерометрии, отставание роста плода по данным ультразвуковой биометрии, обнаружение признаков внутриутробной гипоксии плода при проведении кардиотокографии, падение активности специфического плацентарного изофермента глутаматдегидрогеназы в сыворотке крови в конце I триместра беременности до 1,4 ммоль/л и ниже,
во II триместре – до 1,8 ммоль/л и ниже, в III триместре – до 2,2 ммоль/л и ниже [4]. Для оценки
степени внутриутробной гипоксии сразу после рождения изучали показатели газового состава и кислотно-основного состояния крови в сосудах пуповины, а также уровень ксантина+гуанина,
снижающийся при кислородной недостаточности на 40–45% относительно нормативных величин. При проведении фетоплацентометрических, допплерометрических и лабораторных исследований использовали ультразвуковой аппарат Toshiba SSA-340A (Япония), фетальный кардиомонитор
с компьютерной обработкой Oxford Sonicaid Team Duo (США), анализатор Humalyzer 2000 human
(Германия). Критериями включения беременных в основные группы (1-ю и 2-ю) являлись вышеперечисленные признаки ПН. Критерием исключения служила выявленная аутоиммунная и сердечно-сосудистая патология.
По возрасту, индексу массы тела, соматическому и акушерско-гинекологическому анамнезу пациентки обследуемых групп были сопоставимы. Во всех группах преобладали первородящие женщины: в 1-й группе – 59,5%, во 2-й группе – 53,1% и в 3-й группе – 61,4%. У 15,8% женщин 1-й группы, 17,6% – 2-й группы и 15% – 3-й группы в анамнезе имели место медицинские аборты (от 1 до 3). Самопроизвольные выкидыши у пациенток всех групп отсутствовали. У большинства женщин, включенных в обследование, беременность завершилась самопроизвольными родами (в 1-й груп-
пе – в 84,2%, во 2-й группе – в 76,5%, в контрольной – в 100% случаев). Кесарево сечение по показа-
ниям к оперативному родоразрешению со стороны плода было произведено у 3 и 4 женщин 1-й и 2-й
групп соответственно.
Материалом исследования служили плаценты, взятые сразу после родов. Биохимические компоненты и активность ферментов определяли в гомогенатах плаценты, приготовленных при соблюдении холодового режима (0–4 °С). Содержание аргинина и пролина оценивали с помощью автоматического анализатора AAA-400 Microtechna (Чехия). Подготовку тканей и анализ проводили согласно инструкции к прибору по стандартной программе. Активность аргиназы определяли по ее способности превращать аргинин в мочевину. Содержание образовавшейся мочевины оценивали с помощью коммерческих
«Новокарб» («Вектор-Бест», Россия). Активность NO-синтазы измеряли по увеличению продукции NO из L-аргинина в присутствии никотинамидадениндинуклеотидфосфата (НАДФН). Количественную оценку образованного NO проводили с помощью электронной парамагнитнорезонансной спектрометрии (ЭПР-спектрометрии) мононитрозильных комплексов с двухвалентным железом и диэтилдитиокарбонатом, обладающих характерными парамагнитными свойствами [7]. Сигналы ЭПР регистрировали на радиоспектрометре «Цейс EP-9». Эндогенный уровень NO в форме нитрит-аниона после энзиматического восстановления нитратов в нитриты определяли с помощью классической реакции Грисса [12] и обозначали как NOx. Концентрацию пероксинитрита и других нитропроизводных измеряли спетрофотометрически по характерным полосам поглощения при 302, 338 и 438 нм с использованием соответствующих молярных коэффициентов экстинкции [2].
Статистическую обработку данных осуществляли с помощью лицензионного пакета программ Statistica (версия 5.1 фирмы StatSoft. Jnc.) и Excel -2002. Однородность дисперсий проверяли по критерию Фишера. Достоверность различий между сравниваемыми показателями определяли по критерию Стьюдента (t-критерий) и его аналогу для непараметрических распределений—критерию Манна–Уитни. Результаты оценивали как статистически значимые при p <0, 05.
Результаты исследования и обсуждение
Установлено, что ПН развивается на фоне значительных изменений в физиологическом балансе основных путей метаболизма аргинина.
Таблица. Показатели метаболизма аргинина и его производных в плаценте при физиологической и осложненной беременности (M+-m).
Представленные в таблице данные свидетельствуют о том, что в плаценте женщин с ПН, доносивших
беременность (1-я группа), содержание аргинина было на 29% ниже, чем при неосложненной беременности. Такая же степень и направленность изменений имели место для пролина, уровень которого снижен на 30%. Выявленные отклонения в содержании этих аминокислот происходят на фоне повышения активности аргиназы в плаценте на 36% относительно контрольных величин. Для пациенток 1-й группы характерно также увеличение плацентарной активности NO-синтазы (на 39%) и основного продукта катализируемой ею реакции – оксида азота, концентрация которого повышена на 23%. Значительные изменения обнаружены и для производных NO, образующихся в результате его взаимодействия с активными кислородными радикалами и кислородсодержащими компонентами – пероксинитритом, S-нитрозоглутатионом и нитрозотирозином. Содержание этих нитрозопроизводных
возрастало в плаценте пациенток 1-й группы на 48; 30 и 35% соответственно.
Еще более выраженные метаболические изменения установлены при преждевременных родах. Так, плацентарный уровень аргинина был снижен у женщин 2-й группы почти на 40% по сравнению с аналогичной величиной в контрольной группе. Содержание пролина, для которого аргинин является исходным субстратом, снижено на 37%. Активность аргиназы у беременных данной группы была в 1,5 раза выше, чем в контрольной, а также превышала значения данного показателя у беременных 1-й группы. Что касается NO-синтазы, то в отличие от динамики соответствующего показателя при донашивании осложненной беременности, активность этого фермента была снижена на 44%. Такая же направленность изменений наблюдалась и в содержании NOx, которое у беременных 2-й группы ниже физиологической величины на 25%. Плацентарная продукция нитропроизводных в данной группе женщин увеличена на 65% (для пероксинитрита), 47% (для нитрозоглутатиона) и 44% (для нитрозотирозина).
Важная роль аргинина как пластического, энергетического материала, а также самостоятельной сигнальной молекулы в регуляции различных путей метаболизма определяет негативные последствия снижения его содержания в плаценте при ПН. Уменьшение количества аргинина, очевидно, может сказываться на продукции других аминокислот, субстратом которых он является: цитруллина, орнитина, пролина. Полученные нами данные подтверждают эти представления на примере пролина, количество которого было снижено в плаценте женщин как 1-й, так и 2-й группы. Причем между степенью уменьшения содержания аргинина и пролина в обеих группах обнаружена прямая корреляция (r=0,77и 0,81; р<0,05 соответственно), что позволяет предполагать наличие взаимосвязи
между их динамикой. Сопоставление модификации активности ферментов аргининового обмена
выявило следующие закономерности. Если в плаценте женщин с ПН, доносивших беременность,
обнаружено повышение активности как аргиназы, так и NO-синтазы, то при преждевременных родах
изменение активности ферментов имеет противоположную направленность. В последнем случае
(у пациенток 2-й группы) снижение концентрации аргинина, очевидно, происходило только за счет
возрастания активности аргиназы, в то же время в 1-й группе увеличение утилизации аргинина могло
происходить под действием обеих ферментных систем. Одной из причин разнонаправленных изменений активности указанных ферментов у женщин 2-й группы может быть динамика плацентарной экспрессии трансформирующего фактора роста β (ТФР-β). Как показали ранее проведенные нами исследования [13], содержание ТФР-β в плаценте при преждевременных родах значительно возрастает. Известное ингибирующее влияние этого фактора роста на активность NO-синтазы и, напротив, индуцирующее действие на аргиназную активность [9, 14] в определенной мере объясняют возможные регуляторные механизмы выявленных нами нарушений активности ферментов аргининового обмена.
Что касается метаболитов оксида азота в плаценте обследованных женщин, следует отметить, что
их содержание при недонашивании беременности, как и активность NO-синтазы, снижено по сравнению с показателями в контрольной группе. Уменьшение продукции такого активного вазодилататора, как NO, несомненно, нарушает баланс вазоактивных компонентов и приводит к редукции кровотока, что подтверждают допплерометрические исследования фетальной и материнской гемодинамики. Помимо снижения плацентарного кровотока, отклонения в обмене аргинина, очевидно, сопровождаются и структурными изменениями соединительной ткани сосудов в результате уменьшения концентрации пролина, необходимого для синтеза коллагена [10].
Усиление продукции NO в плацентах женщин 1-й группы, по-видимому, носило компенсаторный
характер и способствовало поддержанию фетоплацентарного кровотока в условиях осложненной
беременности, что в комплексе с другими регуляторными молекулярно-клеточными механизмами позволило создать условия для донашивания беременности, хотя и протекающей с угрозой прерывания. Сопоставление активности NO-синтазы и уровня NOx в плаценте женщин 1-й группы свидетельствует о различной степени их увеличения. Возможно, что наблюдающиеся различия в степени накопления NOx и повышения активности фермента обусловлены способностью части избытка
NO связываться в комплексы, которые образуют активные депо в форме S-нитрозотиолов и динитрозильных комплексов железа [1]. Имеющиеся в литературе данные позволяют предполагать, что, с одной стороны, связывание избытка NO в депо защищает от его цитотоксического и чрезмерного вазодилататорного действия, с другой – депо NO может служить резервом, который будет использован в случае необходимости [3].
Характеристики воздействия NO могут значительно видоизменяться в результате реакций с активными формами кислорода, в частности с супероксид-анионом, который в большом количестве накапливается в плаценте при окислительном стрессе, развивающемся в условиях гипоксии. Это очень быстрая реакция приводит к образованию пероксинитрита, обладающего сильными оксидантными свойствами и гораздо большей реакционной способностью, чем NO. Из полученных нами данных следует, что ПН сопровождается значительным ростом продукции пероксинитрита, который может усиливать прооксидантные процессы и в то же время выводить часть NO из его активной «сферы деятельности». Как известно, пероксинитрит участвует во многих химических реакциях: инициирует перекисное окисление липидов, подавляет транспорт электронов в митохондриях, повреждает цепи ДНК, окисляет
SH-группы белков и небелковых соединений [15], поэтому повышение его уровня при ПН вызывает
весьма серьезные метаболические последствия, способствующие развитию функциональных нарушений в плаценте.
Дополнительные оксидантные воздействия на плацентарный гомеостаз, кроме пероксинитрита,
вызывают такие нитропроизводные NO, как нитрозоглутатион и нитрозотирозин. Продукция этих
нитросоединений, как показали наши исследования, возрастает в плаценте женщин 1-й и особенно
2-й группы. Следует отметить, что нитрозилирование тиолов (прежде всего глутатиона) и тирозиннитрирование – важные проявления клеточного действия NO. В случае, когда эти реакции происходят с белково-связанными тирозином и цистеином (NO-протеиновая модификация), изменяется конформация белков и как следствие их функциональная активность, что приводит к усилению дисбаланса обменных процессов в плаценте.
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о важной роли нарушений метаболизма аргинина и его производных в механизмах формирования ПН.
