Рак шейки матки (РШМ) занимает четвертое место в структуре заболеваемости и смертности женщин от онкологических заболеваний (примерно 604 000 новых случаев и 342 000 смертей во всем мире в 2020 г.) [1]. Согласно эпидемиологическим данным, риск развития РШМ возрастает уже с подросткового возраста после начала половой жизни. Быстрое развитие РШМ у молодых женщин объясняется наличием многих взаимосвязанных факторов, среди которых особенности вирусного канцерогенеза (быстрое соединение вирусного генома с геномом клеток базального эпителия), многочисленный пул стволовых (прогениторных) клеток, активные процессы метаплазии, частая смена половых партнеров, курение и ряд других факторов [2].
Раннее выявление РШМ и оценка прогнозов малигнизации имеют критически важное значение, поскольку женщины, у которых инвазивный рак обнаруживается на ранних стадиях, имеют существенно более высокие шансы на излечение, что, в свою очередь, эффективно с точки зрения экономических затрат [2].
Механизмы развития дисплазии шейки матки
Дисплазия шейки матки – это заболевание, характеризующееся нарушением пролиферации клеток и развитием ядерной атипии на фоне длительной персистенции вируса папилломы человека (ВПЧ) высококанцерогенного риска, особенно 16 и 18 типов [3]. Изучено около 200 серотипов ВПЧ, из которых 35 способны инфицировать урогенитальный тракт, повреждать и трансформировать эпителиальные клетки. Поэтому в диагностике заболеваний шейки матки важная роль отведена ВПЧ-типированию [4].
Геном ВПЧ содержит около 8000 пар нуклеотидов, разделенных на 3 функционально активных области, кодирующих ранние белки (Е), поздние белки (L) и длинную контрольную область (LCR). Продуктами экспрессии генов, кодирующих ранние белки, являются онкопротеины E1, E2, E4, E5, Е6 и Е7 [5, 6]. Основная функция ранних белков – репликация вирусной ДНК. Поздние белки L1 и L2 составляют каркас вирусного капсида. Длинная контрольная область регулирует репликацию вирусной ДНК и экспрессию онкопротеинов. Важное клиническое значение имеет определение экспрессии онкобелков E6 и Е7 в эпителии шейки матки, приводящих к деградации белка-супрессора опухолевого роста р53, высвобождению фактора транскрипции Е2F и блокировке клеточного апоптоза в пораженных вирусом клетках. Связывание онкопротеина Е7 с рRb приводит к активации экспрессии гена CDKN2A, кодирующего р16INK4a, что обеспечивает пути выживания зараженных вирусом опухолевых клеток [7].
При наличии микротравм в эпителии шейки матки вирионы ВПЧ легко проникают в базальный слой, взаимодействуя с интегрином альфа-6, который связывает ВПЧ-16 [8]. Синтез вирусной ДНК начинается в базальных слоях, производя 50–100 копий генома, за этим следует экспрессия белков E1 и E2, которые необходимы для процедуры репликации и разделения недавно синтезированной ДНК. Ранние генные продукты, такие как E5-E7, стимулируют деление ДНК в клетке-хозяине и останавливают апоптоз.
Как только клетка достигает внешнего слоя эпителия, вновь синтезированная вирусная ДНК инкапсулируется с образованием новых вирионов, которые высвобождаются, и затем жизненный цикл повторяется. Поскольку ВПЧ не вызывают полного лизиса в клетках-хозяевах, новые вирионы откладываются в чешуйках, которые непрерывно сбрасываются [9]. Интересно, что вирус в значительной степени скрыт от иммунной системы хозяина, поскольку иммуногенные вирионы объединяются только во внешних частях эпителия. Кроме того, вирусные белки E6 и E7 инактивируют фактор регуляции интерферона, вследствие чего отсутствуют какие-либо симптомы вирусного воздействия [10].
Клетки плоского эпителия, инфицированные ВПЧ, превращаются в койлоциты, которые имеют более крупное, темное и асимметрично очерченное ядро [11].
При плоскоклеточном интраэпителиальном поражении шейки матки низкой степени тяжести происходит раннее нарушение регуляции клеточного цикла. Повышаются уровни E6 и E7 в базальном и парабазальном слоях, и поэтому присутствует белковый комплекс обслуживания минихромосом, необходимый для репликации геномной ДНК. Из-за нарушения регуляции E6 и E7 в нижних слоях эпителия появляется маркер онкогенной активности ВПЧ p16 [12, 13].
В случае плоскоклеточного интраэпителиального поражения шейки матки высокой степени тяжести клеточная активность полностью нарушена, и аномальные базальные и парабазальные клетки выталкиваются вверх через клеточные слои. В то же время E4 вытесняется в клеточных слоях и в конечном итоге исчезает, в то время как p16 будет присутствовать и обнаруживаться на гистологическом срезе. Это связано с тем, что p16 сверхэкспрессируется в поражениях шейки матки высокой степени [14].
Биомаркеры прогрессирования дисплазии шейки матки
Для оценки прогнозирования злокачественной трансформации и улучшения подходов к лечению РШМ изучаются различные биомаркеры и мутации, продуцируемые и зафиксированные на различных биологических стадиях вирусной активности.
Наиболее перспективными и широко обсуждаемыми остаются онкобелки Ki‑67 и p16/INK4a [15, 16].
Ki‑67 – это ядерный белок, который связан с клеточной пролиферацией и экспрессируется во всех активных фазах митотического цикла, для многих опухолевых процессов характерна гиперэкспрессия этого маркера. Ki-67 является маркером пролиферации и экспрессируется в пролиферирующих клетках в ядре парабазальных клеток нормального эпителия. Сверхэкспрессия Ki-67 указывает на пролиферативное клеточное состояние [17].
Белок p16/INK4a представляет собой ингибитор циклинзависимых киназ и играет важную роль в регуляции клеточного цикла эукариот, подавляет опухолевый рост; повышенная экспрессия p16/INK4a может запускать остановку цикла клеточного деления. Многие виды опухолей характеризуются инактивацией гена p16/INK4a, что приводит к нарушению регуляции клеточного цикла и бесконтрольной пролиферации клеток. Но в опухолях, связанных с трансформирующим действием ВПЧ, отмечается увеличение экспрессии данного белка. Экспрессия белка p16/INK4a реактивно увеличивается при росте количества вирусных онкобелков ВПЧ Е6 и Е7 [18].
Комбинация p16 и Ki-67 (известная как двойное тестирование) подтвердит наличие пролиферативного клеточного состояния и трансформирующей инфекции, тем самым указывая на вероятность истинного предрака шейки матки, т.е. степень поражения [19]. Действительно, как пришли к выводу Икенберг и его коллеги в своем крупном панъевропейском многоцентровом исследовании двойного тестирования, «цитология с двойным окрашиванием p16/Ki-67 сочетает в себе превосходную чувствительность и не меньшую (аналогичную) специфичность по сравнению с цитологией Пап для выявления цервикальной интраэпителиальной неоплазии CIN2+. Это предполагает потенциальную роль цитологии с двойным окрашиванием в скрининге» [20, 21].
Уровни экспрессии маркеров p14 (ARF) и p15 (INK4b) тоже увеличены при карциноме шейки матки, что указывает на то, что пути старения и апоптоза могут быть вовлечены в онкогенез шейки матки [22].
Существуют некоторые маркеры, такие как транскрипционный фактор, регулирующий клеточный цикл P53, белок супрессора опухоли pRb и белок адгезии, экспрессирующийся в клеточном эпителии E-cadherin, которые также показали способность обнаружения интраэпителиальных поражений. Кроме того, такие онкомаркеры плоскоклеточного рака, как CEA и SCC-Ag, и интегральный клеточный гликопротеин CD44 могут диагностировать инвазивные формы заболевания [23].
Протеомика широко применяется при онкогенезе шейки матки. Кодируемая генами протеомика сравнивает изменения белковых профилей при РШМ с нормальной шейкой матки, создавая полную библиотеку белков для определения дифференциальных белков до и после возникновения РШМ. Протеомика дает новый ключ к раннему поиску новых биомаркеров и проливает свет на патогенез РШМ.
Так, чрезмерная экспрессия белка S100A9 была дополнительно подтверждена иммуноблоттингом и иммуногистохимическими подходами при РШМ [24]. S100 – большое подсемейство кальцийсвязывающих белков, состоящее как минимум из 25 членов. Кальций-связывающий белок S100 A11 (S100A11), также известный как кальгиззарин, или S100C, является важным членом белка S100, который участвует в инициации и прогрессировании рака. S100A11 играет ключевую регуляторную роль в различных клеточных процессах рака, таких как пролиферация, апоптоз, клеточный цикл, миграция, инвазия и эпителиально-мезенхимальная трансформация.
Экспрессия циркулирующей длинной некодирующей РНК MALAT1 значительно повышена при РШМ в отличие от здоровых клеток. Его экспрессия в раковых тканях значительно выше, чем в прилегающих нормальных тканях. Активность MALAT1 коррелирует с размером опухоли, стадией FIGO, сосудистой инвазией и метастазами в лимфатические узлы и является независимым предиктором общей выживаемости при РШМ. При подавлении эндогенного MALAT1 раковые клетки значительно снижают пролиферацию и инвазию и увеличивают апоптоз [25].
В исследовании обнаружено, что длинные некодирующие РНК LncRNA MALAT1 ускоряют рост опухоли при РШМ путем ингибирования miR-124. Результаты исследования предполагают, что MALAT1 может быть признан потенциальной мишенью для диагностики прогрессирования РШМ [26].
Была выявлена четкая взаимосвязь между повышением уровня экспрессии параоксоназы PON3 и наличием цервикальной интраэпителиальной неоплазии. Избыточное образование PON3 происходит при опухолевой трансформации клеток, обеспечивая их устойчивость к антиоксидантному стрессу и тем самым снижая способность к апоптозу. Полученные результаты свидетельствуют о возможной роли фермента PON3 в развитии диспластических процессов, следовательно, определение уровня экспрессии PON3 может иметь определенный клинический потенциал в диагностике предраковых заболеваний шейки матки [27].
Экспрессию PTEN оценивали при РШМ с помощью тканевого микрочипа. Это исследование показало, что большинство пациентов с аденокарциномой шейки матки имеют экспрессию PTEN, которая коррелирует с гистологическими подтипами аденокарциномы [28].
С помощью тканевого микрочипа было установлено, что матриксная металлопротеиназа 2 (MMP-2) высоко экспрессируется в тканях РШМ и коррелирует с метастазами в лимфатические узлы и инвазией параметрия. Интересно, что уровень MMP-2 не связан с рецидивом и выживаемостью у пациентов с РШМ [29].
Экспрессия митоген-активированной протеинкиназы 3 (МЕКК-3), регулируемая внеклеточными сигналами, и экспрессия сурвивина были связаны с клинической стадией, глубиной инфильтрации и метастазами в лимфатические узлы при РШМ [30].
Недавно высокая экспрессия SEL1L, Notch3 и SOCS3 была идентифицирована у пациентов с РШМ [31].
В дополнение к протеомике изучаются маркеры метаболомики, которая заключается в использовании современных аналитических методов для анализа продуктов метаболизма эндогенных низкомолекулярных веществ, таких как плазма, моча, гомогенат тканей и клетки, для выявления метаболической сущности жизнедеятельности [32]. Известно, что развитие и прогрессирование рака часто сопровождается метаболическими изменениями. Метаболомика использовалась для измерения метаболизма рака и выявления измененных метаболитов и путей инициации и прогрессирования опухоли. За последнее десятилетие исследования метаболизма рака возродились, и, в частности, в центре внимания оказались две выдающиеся характеристики: (1) эффект Варбурга: повышенная скорость поглощения глюкозы и секреция лактата даже в присутствии кислорода и (2) зависимость от глутамина: для роста клеток необходима высокая скорость поглощения глутамина [33].
Метаболомику также применяли к РШМ с использованием ядерного магнитного резонанса 1H. Ye N. et al. выявили метаболомические профили образцов сыворотки от пациентов с РШМ, CIN и хроническим цервицитом соответственно. Они обнаружили, что основные метаболиты, включая формиат, тирозин, β-глюкозу, инозитол, карнитин, глутамин, ацетат, аланин, валин, изолейцин и липопротеины очень низкой плотности, могут быть причиной этих различий [34].
Yin M.Z. et al. использовали UPLC-MS (ультрапроизводительная жидкостная хроматография-масс-спектрометрия) для обнаружения молекулярного метаболита в плазме плоскоклеточного РШМ и идентифицировали два метаболита, фосфатидилхолин и лизофосфатидилхолин, как новые потенциальные биомаркеры РШМ [35].
Кроме того, метаболические признаки в плазме были оценены с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии при цервикальной интраэпителиальной неоплазии и плоскоклеточном РШМ. По сравнению с группой контроля более низкие уровни аминокислот в плазме наблюдались при цервикальной интраэпителиальной неоплазии и РШМ. Уровни аргинина и треонина были повышены в плазме пациентов с цервикальной интраэпителиальной неоплазией, в то время как были понижены при РШМ. Более того, уровни в плазме большей группы аминокислот постепенно снижались от цервикальной интраэпителиальной неоплазии до инвазивного РШМ. Это исследование предполагает, что аминокислотные профили, свободные от плазмы, могут быть полезны для диагностики рака на ранней стадии с использованием образцов крови и метаболомного анализа [36].
Недавно в ходе исследований микробиома человека было обнаружено, что комменсальные бактерии являются основным фактором патогенеза как здоровых, так и болезней. Они распространяются за пределы кишечника в другие системы органов, особенно в вагинальный микробиом [37]. Многие исследования доказали связь между вагинальным микробиомом и цервикальной интраэпителиальной неоплазией [37, 38].
Предыдущие исследования показали, что большая часть влагалищной флоры, такой как аэробные лактобациллы, эпидермальный стафилококк, энтерококки, кишечная палочка, микоплазма гениталиум и бактероиды у больных РШМ, разнообразна по сравнению со здоровыми людьми в контрольной группе [39, 40].
Заключение
Одна из наиболее важных целей применения опухолевых маркеров – своевременная диагностика заболеваний шейки матки на ранних стадиях. Кроме того, определение различных опухолевых маркеров чрезвычайно важно для прогнозирования ответа на лечение пациенток с предраковыми изменениями и РШМ. В этой связи актуальным является проведение дальнейших перспективных научных исследований в данном направлении с целью разработки новой панели прогностических маркеров диагностики дисплазии шейки матки и диагностических маркеров перехода цервикальной интраэпителиальной неоплазии в рак, что позволит повысить качество ранней диагностики предраковых заболеваний шейки матки, а значит, и оптимизировать дифференцированную лечебную тактику.
