Несмотря на более чем вековую историю изучения различных сторон патогенеза доброкачественных заболеваний матки (аденомиоз, миома матки и гиперпластические процессы эндометрия), эти заболевания остаются одной из актуальных медико-социальных проблем.
Эндометриоз стоит на третьем месте в структуре гинекологической заболеваемости и поражает до 50% женщин с сохраненной менструальной функцией, приводя к расстройствам в репродуктивной системе, отрицательно влияя на психоэмоциональное состояние женщин.
Клиническая картина аденомиоза (эндометриоза тела матки) характеризуется значительным полиморфизмом. В связи с этим применение информативных методов обследования, позволяющих в минимальные сроки установить точный диагноз и тем самым обосновать тактику лечения больных при подозрении на данную патологию, вызывает определенные затруднения.
Самым частым заболеванием, сочетающимся с аденомиозом, является миома матки, которую диагностируют в 50–85% случаев. По данным многих исследователей, гиперпластические процессы эндометрия в 30–35% случаев сочетаются с миомой небольших размеров и аденомиозом [3].
Опубликовано значительное количество работ, освещающих информативность различных методов исследования в диагностике доброкачественных заболеваний матки, уточнена диагностическая ценность каждого из них. Наиболее информативными методами диагностики остаются трансвагинальное ультразвуковое сканирование (ТВУЗИ), лапаро- и гистероскопия, гистологичекое исследование удаленных тканей.
Однако, по данным ряда авторов, расхождения в диагнозе, установленном при ТВУЗИ и гистологическом исследовании удаленной матки, составляет до 50%. Таким образом, имеют место как гипердиагностика аденомиоза, так и проблемы с дифференциальной диагностикой узловой формы аденомиоза и миомы матки, определяющие ошибочную схему лечения и прогноз. В связи с этим поиск достоверных маркеров остается по-прежнему актуальным [3].
В последние годы для поиска в сыворотке крови новых маркеров различных заболеваний все чаще используются постгеномные методы анализа, среди которых протеомные технологии занимают ведущие позиции.
Существующие на сегодняшний день технологические ограничения не позволяют анализировать напрямую такие сложные белковые смеси, как, например, протеомы плазмы или сыворотки крови, включающие в себя более 100 000 белков с различиями в относительном содержании, перекрывающими диапазон в 10–12 порядков величин.
Для решения этой проблемы используются различные методы фракционирования, позволяющие выделять из такой сложной смеси белков и пептидов относительно узкие и воспроизводимые по составу фракции, которые в дальнейшем анализируют с помощью масс-спектрометрии.
Масс-спектрометрия – это физический метод анализа, заключающийся в переводе молекул образца в ионизированную форму с последующим разделением и регистрацией образующихся при этом ионов. Результатом измерения является масс-спектр: график зависимости интенсивности сигнала на детекторе от отношения массы к заряду детектируемого иона.
Современная матрично-активированная лазерная десорбционно/ионизационная (МАЛДИ) масс-спектрометрия характеризуется высоким разрешением и чувствительностью, широким массовым и динамическим диапазоном. В 2002 г. Коичи Танака (за разработку метода ионизации МАЛДИ) и Джон Фенн (за разработку метода ионизации электрораспылением или электроспреем) были удостоены Нобелевской премии по химии.
В литературе описаны примеры успешного применения этого метода для выявления различий между сывороткой крови больных раком желудка, прямой кишки, простаты, эндометрия, яичников, гепато-клеточной карциномой и сывороткой крови здоровых людей [2].
Цель данного исследования — выявление в сыворотке крови женщин потенциальных пептидных маркеров, пригодных для диагностики доброкачественных заболеваний матки с помощью магнитных микрочастиц с функционализированной поверхностью.
Материал и методы исследования
Нами были обследованы 63 больные аденомиозом (средний возраст 40 лет), 48 больных мио-мой матки (средний возраст 42 года), 24 больных с гиперпластическими процессами эндометрия (средний возраст 41 год) и 133 практически здоровые женщины, составившие контрольную группу (средний возраст 40 лет). Диагноз аденомиоза, миомы матки и гиперплазии эндометрия был установлен на основании данных гистероскопии и результатов морфологического исследования.
Распределение больных по данным анамнеза представлено в табл. 1.
Сыворотки крови больных аденомиозом были получены из ГКБ № 64, ГКБ № 29, поликлиники №1 Национального медико-хирургического центра им. Н.И.Пирогова Росздрава (Москва). В качестве контроля были использованы образцы сывороток крови практически здоровых женщин (далее «контроль»), полученные из клинико-диагностической лаборатории ООО НПФ «Литех» (Москва).
Кровь из вены (около 4 мл) собирают в пробирку без антикоагулянта, инкубируют ее при комнатной температуре в течение 1 ч, центрифугируют при 1900 G (3000 об/мин) в течение 15 мин (при комнатной температуре), надосадочную жидкость (сыворотку) отбирают, переносят в две предварительно промаркированные пробирки типа Эппендорф по 1 мл и замораживают при -70°С.
Для фракционирования образцов сывороток крови использовали набор для профилирования, содержащий магнитные микрочастицы со слабой катионообменной поверхностью MB-WCX производства компании Bruker Daltonics (Германия). Описание этого набора для профилирования, а также рекомендованного для него протокола фракционирования можно найти на Интернет-странице компании – www.bdal.de.
Фракционирование сывороток крови проводили на специализированном роботе ClinProt robot (Bruker Daltonics, Германия) по протоколу, рекомендованному производителем магнитных микрочастиц. Элюаты наносили на стальную полированную 384-точечную масс-спектрометрическую мишень (MTP 384 target plate polished steel TF) в четырех повторах, после высушивания на воздухе на образец наносили раствор матрицы. В качестве матрицы использовали смесь 2,5-дигидроксибензойной кислоты (3 мг/мл) и альфа-циано-4-гид-роксикоричной кислоты (2,4 мг/мл) в смеси метанол/ацетонитрил/вода в соотношении 5:4:1.
Времяпролетную МАЛДИ-масс-спектрометрию проводили с использованием времяпролетного масс-спектрометра Ultraflex (Bruker Daltonics, Германия). Десорбцию образцов осуществляли иррадиацией азотным лазером (длина волны 337 нм), работающим при частоте 25 Гц. Для удаления пиков матрицы использовали максимальный уровень подавления сигнала вплоть до 900 Д. Спектры регистрировали в линейном режиме положительно заряженных ионов в диапазоне масс 0,9–12 кД. Для калибровки использовали калибровочную смесь, содержащую пептиды и белки в диапазоне масс 1–10 кД. Для увеличения чувствительности детекции избыток матрицы удаляли 8 импульсами лазера при мощности 50% с последующей аккумуляцией данных при мощности лазера 30%. Для каждого спектра суммировали результаты 720 лазерных импульсов (по 60 импульсов с 12 различных точек пятна). Суммировали спектры с отношением сигнал/шум >5 и разрешением >300.
Масс-спектрометрические данные анализировали с использованием компьютерной программы ClinProTools 2.1 (Bruker Daltonics, Германия). Математические модели для классификации масс-спектров смеси пептидов и белков, полученных после фракционирования сывороток крови, строили на основе генетического алгоритма и управляемой нейронной сети (Supervised Neural Network).
Для построения классификационных моделей масс-спектры каждой из групп разделяли пополам, одну пару использовали для построения классификационной модели, а вторую – для ее валидации.
Результаты исследования и обсуждение
На основании масс-спектрометрического профилирования сывороток крови после их фракционирования на магнитных микрочастицах со слабой катионообменной поверхностью (MB-WCX) были построены классификационные модели с использованием обоих математических алгоритмов. При использовавшихся параметрах обработки масс-спектров в них воспроизводимо детектировали 89 пиков. После изучения вклада площадей отдельных пиков в классификационные модели 7 пиков были выделены как наиболее значимые для диагностики патологии.
Для оценки достоверности построенных моделей были использованы образцы сыворотки крови групп «аденомиоз» (31), «миома матки» (24), «гиперпластические процессы эндометрия» (12) и «контроль» (66), не использовавшиеся для построения классификационных моделей. Значения чувствительности и специфичности построенных математических моделей классификации приведены в табл. 2.
Визуальный анализ статистических диаграмм изменения площадей масс-спектрометрических пиков между группами «аденомиоз» и «контроль» позволил обнаружить 3 пика, у которых не наблюдается пересечения в диапазонах изменения их площадей между группами (рис. 1, см. на вклейке). То же самое обнаружено и в отношении миомы матки (рис. 2, см. на вклейке). Подобные пики могут соответствовать специфическим биомаркерам аденомиоза и миомы матки, поскольку дают довольно высокие значения специфичности и чувствительности, что мы и наблюдаем в данном случае. Итоговый анализ масс-спектрометрических профилей образцов сывороток крови групп «аденомиоз» и «контроль», фракционированных с использованием магнитных микрочастиц МВ-WCX, представлен на рис. 3, «миома матки» и «контроль» — на рис. 4.
Привлекательность использования плазмы (сыворотки) крови для диагностики различных заболеваний человека обусловлена главным образом тем обстоятельством, что она наиболее полно представляет фенотип человека, его состояние в конкретный момент времени [4]. Еще одно немаловажное достоинство плазмы (сыворотки) крови – ее доступность, поскольку она является наиболее распространенным в медицинской практике первичным клиническим образцом.
На сегодняшний день нет однозначного ответа на вопрос, в какой связи находятся регистрируемые в сыворотке крови изменения пептидно-белковых паттернов с исследуемым патологическим процессом в организме. Предполагается, что эти изменения могут отражать реальные колебания концентраций белков и пептидов, напрямую ассоциированных с заболеванием, но, с другой стороны, нельзя исключить и возможность их возникновения, например, в результате вызванных патологией отклонений в процессах свертывания крови ex vivo при получении из нее сыворотки [5,7].
С нашей точки зрения, диагностическая ценность найденных сигнатур не зависит от природы их возникновения при условии строгой воспроизводимости их появления в сыворотке крови больных. Ранее было показано, что процедура получения сыворотки, а именно длительность временной задержки до отделения сыворотки от образовавшегося сгустка в процессе свертывания крови, не влияет на ее масс-спектрометрический профиль [1].
Полученные результаты позволяют предположить обнаружение новых достоверных маркеров аденомиоза и миомы матки, что не удалось в отношении гиперплазии эндометрия.
В ближайшем будущем мы планируем проведение исследований по установлению структуры выявленных в сыворотках крови потенциальных биомаркеров аденомиоза и миомы матки. Примеры подобных работ описаны в литературе и связаны, как правило, с использованием тандемной массспектрометрии с ионизацией электрораспылением, сопряженной с обращеннофазовой жидкостной нанохроматографией [6,7].
