Хронический вульвовагинит (ХВВ) является актуальной проблемой в практике акушера-гинеколога. ХВВ плохо поддается лечению и часто рецидивирует. Известно множество факторов, которые могут приводить к нарушению биоценоза влагалища и способствовать рецидивированию.
В литературе имеются исследования, которые доказывают роль аллергии в генезе воспалительных заболеваний гениталий [1, 2]. Аллергия может являться первичным триггером воспалительного процесса или сопутствовать уже развившемуся ХВВ [3]. В норме слизистая оболочка вульвы и влагалища осуществляет барьерную функцию и обеспечивает защиту от проникновения как патогенов, так и аллергенов. При наличии воспаления барьерная функция слизистых нарушается, развиваются изменения иммунного ответа слизистой оболочки, которые способствуют более активному проникновению аллергенов и индуцируют развитие аллергического воспаления. При развитии аллергического воспаления происходит подавление клеточного иммунного ответа и смещение в сторону Th2-иммунного пути.
Клеточный иммунный ответ слизистых генетически детерминирован. При этом полиморфизм (SNP – англ. single nucleotide polymorphism) генов иммунного ответа является важным генетическим фактором возникновения как аллергических заболеваний и атопии, так и хронических воспалительных изменений слизистых оболочек. Известны SNP генов иммунного ответа, которые ассоциированы с высокой гиперреактивностью тканей, выработкой IgE на определенный аллерген и высокой активностью Th-2 лимфоцитов. Есть данные, которые подтверждают важную роль генов цитокинов в восприимчивости к астме, аллергическому риниту и атопии в целом [4–11]. Также получены данные, доказывающие важную роль генов иммунного ответа в развитии хронических воспалительных заболеваний нижнего отдела генитального тракта у женщин [12, 13]. При этом исследований, посвященных изучению SNP генов иммунного ответа у пациенток с ХВВ, ассоциированным с аллергическим воспалением (а-ХВВ), недостаточно.
В связи с этим мы провели исследование, целью которого стала оценка прогностической роли экспрессии и полиморфизма генов цитокинов в развитии а-ХХВ.
Материал и методы исследования
В одномоментное исследование с параллельным контролем были включены 106 пациенток репродуктивного возраста. Группу 1 составили 55 пациенток с ХВВ, диагноз которого устанавливался на основании наличия более 4 рецидивов вульвовагинита в течение одного года и выявления более 15 лейкоцитов в поле зрения в мазках, окрашенных по Граму. Группу 2 (контроль) составила 51 пациентка без признаков ХВВ. Критериями исключения были: впервые выявленный острый вульвовагинит и/или цервицит, половые инфекции в период исследования, предрак или рак шейки матки и влагалища, проведение антибактериальной, антимикотической, антигистаминной, глюкокортикоидной терапии менее чем за один месяц до включения в исследование, беременность и период лактации. Все пациентки подписали информированное согласие на участие в исследовании.
Лабораторные исследования проводились в период обострения ХВВ и ремиссии сопутствующих аллергических заболеваний при наличии таковых и включали: микроскопию мазка, окрашенного по Граму; pH-метрию влагалища; определение эозинофилов в крови и вагинальных смывах методом цитометрии и микроскопии; определение уровней общих IgE в сыворотке крови и вагинальных смывах методом иммуно-ферментного анализа. Маркерами аллергического воспаления считалось увеличение концентрации общего IgE в сыворотке крови (более 100 МЕ/мл) и выявление эозинофилов в вагинальных смывах.
Определение полиморфизма генов в цельной крови проводилось c помощью коммерческих ПЦР (полимеразная цепная реакция) тест-систем (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия) с помощью ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) с плавлением продуктов реакции в присутствии «примыкающих» олигонуклеотидов (метод kissing probes). Были изучены следующие SNP: IL10 с.-1082A>G (rs1800896), IFNG с.874A>T (rs2430561), TNFα с.-238A>G (rs361525), IL4 с.-590C>T (rs2243250). Оценку соответствия выявленных частот генотипов закону Харди–Вайнберга проводили по критерию χ2 в сравнении с ожидаемыми частотами генотипов равновесного распределения. Экспрессия мРНК генов иммунного ответа (IL10, IFNG, TNFα, IL4) в клетках соскобов слизистой влагалища оценивалась с помощью ПЦР-РВ, с предварительной обратной транскрипцией (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия).
Для статистического анализа использовался пакет статистических программ Statistica 10 (США). Статистический анализ проводился с применением χ2-теста для сравнения частотных показателей и теста Манна–Уитни для сравнения непрерывных величин, логистической регрессии для создания модели прогноза и расчета отношения шансов (ОШ) с 95% доверительным интервалом (ДИ), ROC-анализа для нахождения порогов отсечки непрерывных величин, включенных в модель. Различия между статистическими величинами считали статистически значимыми при уровне достоверности p<0,05. Исследование было одобрено комиссией по этике ФГБУ НЦАГиП им. В.И. Кулакова Минздрава России.
Результаты исследования
Группы сравнения не отличались по соматической, гинекологической заболеваемости и акушерскому анамнезу. Возраст пациенток был сопоставим и составил 32,3±6,0 года в группе ХВВ и 32,2±6,7 года в контрольной группе (р=0,9265). Подтверждением наличия рецидива ХВВ в момент включения в исследование было наличие повышенного числа лейкоцитов в вагинальных мазках, которое составило 38,07±36,7 клеток в группе 1 и 1,8±1,3 клеток в группе 2 (р<0,0001).
Данные по распределению SNP и экспрессии мРНК генов цитокинов в группах сравнения представлены в табл. 1 и 2. У пациенток с ХВВ погранично значимо чаще выявлялся генотип СС гена IL4 с.-590C>T (р=0,0562), реже – генотип АА гена IL10 с.1082A>G (р=0,0565), а также отмечалось значимое увеличение экспрессии IL10, IFNG и IL4.
Из 55 пациенток с ХВВ маркеры аллергического воспаления были выявлены у 19 женщин (группа 1а), у 36 – признаков аллергии выявлено не было (группа 1б). Данные группы также не отличались значимо по соматической, гинекологической заболеваемости и акушерскому анамнезу. Возраст пациенток был сопоставим и составил 32,3±5,8 года в группе 1а и 32,3±6,2 года в группе 1б (р=0,9804). Подтверждением наличия аллергии в группе 1а было наличие повышенного числа эозинофилов в вагинальных мазках, которое составило 47,8±61,9 клеток в группе 1а и 10,7±15,7 клеток в группе 1б (р=0,0012) и уровня IgE в сыворотке крови, которое составило 285,5±170,9 МЕ/мл в группе 1а и 22,7±24,2 МЕ/мл в группе 1б (р<0,0001).
Данные по распределению генотипов и экспрессии генов цитокинов у пациенток с ХВВ в зависимости от наличия или отсутствия признаков аллергического воспаления представлены в табл. 3 и 4.
У пациенток с а-ХВВ значимо чаще выявлялся генотип ТТ гена IL4 с.-590C>T (р=0,0012), генотип GG гена IL10 с.1082A>G (ОШ=6,42; 95% ДИ=1,42;28,91) и генотип AA гена IFNG с.874A>Т (ОШ=4,51; 95% ДИ=1,21;16,75) (рис. 1).
В этой группе пациенток в клетках соскобов слизистой влагалища отмечалось значимое увеличение экспрессии IL10 и снижение экспрессии IFNG (рис. 2).
Для создания модели оценки роли аллергического воспаления в развитии ХВВ был применен метод бинарной логистической регрессии. В модель были включены SNP и уровень экспрессии изученных генов в виде бинарных переменных на основании определения их порогов отсечки в проведенном ROC-анализе. В ходе проведения многофакторного анализа свою значимость показали следующие переменные: генотип GG гена IL10 с.1082A>G, генотип АА гена IFNG с.874A>Т и уровень экспрессии гена IFNG. В качестве критерия согласия созданной модели использовался процент правильной переквалификации (Concordant) и коэффициент связи Somers’D. Общая оценка согласия модели и реальных данных производилась с использованием теста Хошмера–Лемешева (p=0,8416). Достоверность модели была проверена путем построения кривой ROC. Площадь под кривой (AUC) составила 84,2%. Было получено следующее правило прогнозирования аллергического воспаления в развитии ХВВ:
Concordant=78,8% Somers’D=0,684
где Р(Аллергия) – вероятность наличия аллергического фактора в развитии ХВВ, Exp – экспонента, IL10_GG – генотип GG гена IL10 с.1082A>G, IFNG_АА – генотип АА гена IFNG с.874A>Т, IFNG – уровень экспрессии гена IFNG в клетках соскобов слизистой влагалища более 0,001.
Обсуждение
Рецидивирование воспалительного процесса в области гениталий может быть обусловлено наличием SNP генов цитокинов, отвечающих за развитие иммунного ответа, что, в свою очередь, приводит к изменению экспрессии генов цитокинов и нарушению баланса между ними. Баланс про- и противовоспалительных цитокинов играет важную роль при хронизации воспалительного процесса. Провоспалительные цитокины обеспечивают функционирование иммунных реакций против микробных возбудителей, а противовоспалительные цитокины подавляют чрезмерную активность воспалительного процесса. Мы оценили SNP генов про- и противовоспалительных цитокинов (IL10 с.-1082A>G, IFNG с.874A>T, TNFα с.-238A>G, и IL4 с.-590C>T) в крови пациенток и уровень их экспрессии (IL10, IFNG, TNFα, IL4) в клетках соскобов слизистой влагалища.
IL10 является одним из основных противовоспалительных цитокинов. Основное его влияние на иммунитет заключается в подавлении синтеза IFNG, TNFα, IL8, IL1β, а также ингибировании Th1-иммунного ответа. При синтезе IL10 снижается противоинфекционный иммунитет и инициируется хронизация процесса. Имеются данные о связи данного гена с аллергическими заболеваниями [6, 8].
IL-4 может усиливать выработку IgE и провоцировать развитие аллергических реакций и воспаления на коже и слизистых оболочках. При увеличении уровня продукции IL-4, происходит угнетение клеточного иммунитета, и инициация Th2-иммунного ответа, характерного для атопии. Помимо этого, IL-4 является ингибитором синтеза IFNG, что свидетельствует об угнетении противоинфекционного иммунитета. Имеются данные, о связи данного гена с аллергическими заболеваниями [5, 8, 10, 11].
INFG подавляет пролиферацию Тh2-лимфоцитов. Имеются данные, что при атопических заболеваниях экспрессия IFNG снижается [6, 7, 11].
У пациенток с ХВВ по сравнению с контрольной группой женщин отмечалось более частое, хотя и не статистически значимое выявление генотипа СС гена IL4 с.-590C>T, и более редкое выявление генотипа АА гена IL10 с.1082A>G. Соответственно, в этой группе пациенток в клетках соскобов слизистой влагалища отмечалось значимое усиление экспрессии мРНК противовоспалительных цитокинов IL4, IL10, а также провоспалительного цитокина IFNG. Мы не получили данных о наличии SNP и изменении экспрессии гена TNFα у пациенток с ХВВ. Наши данные частично согласуются с данными О.В. Бурменской и соавт. (2014), которыми было определено более частое выявление аллеля А TNFα –238 A>G и повышение экспрессии мРНК IFNG, IL10 и TNF у пациенток с ХВВ [13]. Логично, что при развитии воспалительной реакции на слизистых происходит активация синтеза провоспалительных цитокинов (TNF-α, IL-1ß, IFNG), осуществляющих защитную функцию. При этом повышение экспрессии IL10 и IL4 может быть обусловлено влиянием микрофлоры. Существуют данные, что микробная контаминация (в частности С. albicans), нарушение микрофлоры (при бактериальном вагинозе) и хронизация воспалительного процесса сопровождается повышением экспрессии IL10 и IL4 [14, 15].
Аллергическое воспаление в области гениталий также может быть обусловлено SNP генов цитокинов. В ряде исследований показана ассоциация полиморфизма генов цитокинов с развитием ряда аллергических заболеваний [5–11]. Воспалительный процесс при аллергии инициируется клетками Тh2-типа, которые производят цитокины, необходимые для производства IgE и локальной эозинофилии [16].
В нашем исследовании у пациенток с а-ХВВ по сравнению с пациентками с ХВВ иной этиологии отмечалось в 6,4 раза более частое выявление генотипа ТТ гена IL4 с.-590C>T и генотипа GG гена IL10 с.1082A>G, а также в 4,5 раза более частое выявление генотипа AA гена IFNG с.874A>Т. Мы предполагаем, что данные SNP приводят к изменению экспрессии соответствующих мРНК и белков. Соответственно, в клетках соскобов слизистой влагалища у пациенток с а-ХВВ отмечалось значимое увеличение экспрессии IL10 и снижение экспрессии IFNG. Данных за изменение экспрессии IL4 у этих пациенток выявлено не было.
Наши данные частично согласуются с данными других исследований. Так, A.D. Aguilar и соавт. (2006) обнаружили значительное повышение экспрессии IL10 и снижение экспрессии IFNG и не выявили значимых изменений экспрессии IL4 у пациентов с аллергическим ринитом [9]. Авторы рассматривают это, как дисбаланс Th1 и Th2 ответа и сдвиг в сторону Th2 пути. А S.R. Fan и соавт. (2008) в своем исследовании определили, что у пациенток с рецидивирующим вульвовагинальным кандидозом аллергического генеза уровень экспрессии как IL4, так и IFNG в клетках соскобов слизистой влагалища был повышен [16].
Заключение
Для оценки суммарного воздействия выявленных SNP и, как следствие, измененной экспрессии генов цитокинов нами был проведен многофакторный анализ с созданием модели роли аллергии в развитии ХВВ. В созданной модели на вероятность развития а-ХВВ оказывали влияние SNP гена IL10 с.1082A>G (генотип GG), SNP гена IFNG с.874A>Т (генотип АА) и снижение экспрессии IFNG. Таким образом, генетическая предрасположенность к сниженной экспрессии гена IFNG (у носителей генотипа АА) и повышенная экспрессия гена IL10 (у носителей генотипа GG) может являться фактором риска в развитии и поддержании аллергического воспаления гениталий.
