Noninvasive prenatal diagnosis of aneuploidies by extracellular DNA sequencing: The current view on the problem

Tetruashvili N.K., Parsadanyan N.G., Fedorova N.I., Trofimov D.Yu., Shubina E.S.

Academician V. I. Kulakov Research Center of Obstetrics, Gynecology, and Perinatology, Ministry of Health of Russia, Moscow, Russia
The article sets forth the current views on noninvasive prenatal diagnosis (NPD) by sequencing to determine aneuploidies in both high- and low-risk pregnant women. It describes the results of the investigations conducted in the past 3 years, which determine the sensitivity, specificity and accuracy of tests versus conventional screening methods in pregnant women. The advantages and limitations of NPD methods and the opinions of leading obstetrics societies on whether it is expedient to use them as diagnostic and screening tools are defined.

Keywords

noninvasive prenatal diagnosis
aneuploidies
free DNA
pregnancy
screening

Вопросы пренатальной диагностики остаются одними из самых актуальных и обсуждаемых в перинатальной медицине. Существующий в настоящее время протокол скрининга беременных включает определение белковых маркеров материнского происхождения в совокупности с данными ультразвукового исследования (УЗИ). Вместе с тем прогрессивно увеличивается число публикаций, указывающих на перспективность определения свободной эмбриональной ДНК 
(сэ-ДНК) в периферической крови женщины для диагностики анеуплоидий у беременных как высокого, так и низкого риска [1–4]. До сих пор нет единого мнения о необходимости включения методов неинвазивной пренатальной диагностики (НПД) путем секвенирования в протокол обследования беременных.

«Золотым стандартом» постановки диагноза анеуплоидии является кариотипирование с получением плодового материала методами инвазивной пренатальной диагностики: хориоцентеза между 10-й и 12-й неделями гестации или с помощью плацентоцентеза, амниоцентеза между 14-й и 18-й неделями гестации. При проведении вышеуказанных инвазивных диагностических процедур риск потери беременности достигает 2%, а у женщин с выкидышами в анамнезе до 5% [5]. При осложненном течении беременности возможности назначения инвазивных методов диагностики ограничены и сопряжены с высоким риском потери желанной беременности. В то же время одной из важнейших задач именно в условиях угрожающего выкидыша является оценка состояния плода и диагностика хромосомных аномалий, наследуемых от родителей или возникающих de novo.

Наиболее вероятны генетические причины при привычных потерях беременности в следующих клинических ситуациях:

  • Очень ранние потери беременности (анэмбрионии);
  • Семейный анамнез – данные о наличии в семье детей с хромосомной патологией или точечными генными мутациями;
  • Наличие у супружеской пары случаев анеуплоидий.

У исследователей нет единого ответа на вопрос, улучшает ли прогноз для последующей беременности наличие анеуплоидии абортуса при цитогенетическом исследовании.

В одном из исследований получены данные, что в случае выявления анеуплоидии абортуса прогноз вынашивания следующей беременности лучше, чем у пар с привычным выкидышем и нормальным кариотипом погибшего эмбриона [6]. В другом исследовании, напротив, показано, что у пар с привычным выкидышем и наличием подтвержденной анеуплоидии в исходе беременности вероятность повторения подобной ситуации выше, чем при нормальном кариотипе абортуса. Во всех случаях подобные ситуации нечасто обусловлены сбалансированными хромосомными перестройками у матери или отца, как правило, кариотип родителей нормальный. Вместе с тем, частота сбалансированных хромосомных перестроек в парах с привычным выкидышем составляет 4,1–11% по сравнению с популяционными данными – 0,6%. Наиболее часто встречаются сбалансированные реципрокные транслокации и Робертсоновская транслокация, реже инверсии и мозаицизм. В этой связи кариотипирование пар с привычным выкидышем входит в стандарт обследования в программе предгестационной подготовки.

В последние 15 лет уделяется значительное внимание развитию методов НПД, в частности выделению сэ-ДНК из периферической крови беременной женщины [2, 7–9].

Пионерами в данной области были группа авторов под руководством D. Lo, с 1997 года непрерывно совершенствующих методы выявления 
сэ-ДНК [10]. Тем не менее, детальные исследования в НПД были проведены в течение последних пятнадцати лет, что связано с прогрессивным развитием технологии секвенирования [11, 12].

Предполагается, что сэ-ДНК попадает в кровь матери несколькими путями: из фетальных клеток, переходящих плацентарный барьер и разрушающихся иммунной системой, в результате лизиса клеток плаценты и прямого выброса ДНК плода в кровь матери [13–15]. Сэ-ДНК обнаруживается уже на первых неделях развития плода (у 0% беременных женщин она обнаруживается на 28-й день после зачатия) [16]. Эти данные свидетельствуют о том, что сэ-ДНК появляется в крови матери раньше времени формирования системы кровообращения плода. В настоящее время многие работы подтверждают, что источником ДНК плода в материнском кровотоке являются клетки трофобласта.

Серия исследований, проведенных за последние 15 лет, была посвящена вначале техническим аспектам методик, а затем их клиническому применению у пациенток высокого и среднего риска. Высказывалась точка зрения о необходимости НПД с определением сэ-ДНК у женщин именно высокого риска по наличию анеуплоидии, чья беременность протекает с осложнениями либо у женщин со средним риском для выбора правильной тактики ведения беременности [17–20].

Переломным в оценке места методов НПД явилось последнее исследование в данной области, опубликованное в 2014 г. группой ученых под руководством D. Bianchi, лидера в области работ, посвященных НПД в США. Целью многоцентрового проспективного ослепленного исследования было сравнить результаты общепринятого скрининга на анеуплоидии с результатами массивного параллельного геномного секвенирования у беременных низкого риска. Включены 2042 женщины, из которых 128 выбыли из исследования в связи с различными причинами. 1914 проб подвергали первичному анализу, из них 1909 – на трисомию 21, 
1905 – на трисомию 18. Проанализировали ложноположительные результаты, полученные в результате секвенирования и общепринятого скрининга. При проведении исследований на трисомию 21 в I и II триместрах ложноположительный результат получен в 4 случаях, тогда как при общепринятом скрининге – в 51 случае. В III триместре эти результаты составили 2 и 18 соответственно. При исследовании на трисомию 18 получены аналогичные результаты, однако различия были значимы при анализе проб I и II триместров. Полученные результаты были достоверны для трисомий 18 и 21, ложноположительные результаты были достоверно ниже при проведении секвенирования по сравнению с общепринятым скринингом. Отрицательный предиктивный результат секвенирования составил 100%. Положительный предиктивный результат при секвенировании превосходил аналогичный показатель при общепринятом скрининге в 10 раз для трисомии 21, в 5 раз – для трисомии 18 [21, 22].

Несмотря на обнадеживающие результаты, у профессиональных сообществ нет единого мнения относительно возможности использования данной технологии для скрининга беременных. Два профессиональных сообщества высказали различные мнения о необходимости внедрения методов НПД по определению сэ-ДНК для беременных низкого риска по реализации хромосомной патологии. В настоящее время тестирование применяется у беременных высокого риска, однако существует мнение, что подобное расширенное обследование необходимо рекомендовать и для женщин низкого риска.

Так, Королевское общество акушеров-гинекологов Великобритании (RCOG) полагает, что в настоящее время НПД должна стать первичным звеном скрининга хромосомных аномалий во время беременности. В противоположность этому мнению, американская ассоциация по фетальной медицине (Society for Maternal Fetal Medicine – SMFM) осторожно заявляет, что НПД  многообещающий метод, который демонстрирует прекрасные результаты, но этого недостаточно, чтобы изменить существующие в настоящее время рекомендации Американского общества акушеров-гинекологов (ACOG) и специалистов по фетальной медицине (SMFM) [23].

RCOG утверждает, что тестирование дает убедительные результаты, приближающиеся к точности 100%, однако метод имеет ограничения в некоторых случаях, к которым относятся:

  • Очень ранние сроки беременности, когда низкий уровень сэ-ДНК не позволяет исключить ложноотрицательный результат;
  • Ожирение беременной, когда фракция сэ-ДНК является крайне низкой;
  • Исследование при дихориальной двойне, когда интерпретация данных затруднена, что особенно важно, если речь идет о самопроизвольной редукции одного эмбриона из дихориальной двойни;
  • Мозаицизм тканей женщины или плацентарный мозаицизм (около 1% случаев);
  • Материнские факторы, например, онкологическое заболевание, сопровождающееся массивным выбросом опухолевой ДНК.

Согласно опубликованным комментариям в New England Journal of Medicine (2014), RCOG предусматривает 3 модели, при которых НПД по сэ-ДНК дает наилучшие результаты и может быть внедрена в национальную клиническую практику Великобритании:

  • в качестве резервного метода после проведения скрининга, включающего в себя тройной тест и УЗИ (по предварительным данным около 20% женщин будут направлены на дополнительное тестирование);
  • как часть комбинированного скрининга;
  • как самостоятельный метод первой линии у всех женщин.

Касаясь возможности проведения такого расширенного тестирования, RCOG утверждает, что материальные средства могут быть переведены в пользу внедрения нового метода взамен существующего исследования биохимических маркеров. Обсуждая вопросы экономической эффективности методов, авторы полагают, что стоимость исследования, скорее всего, упадет, так как в последние годы расходы на секвенирование ДНК существенно снижаются.

Авторы полагают, что в целом замена определения биохимических маркеров, которые часто указывают на повышенные риски, на тестирование сэ-ДНК позволит повысить точность исследования. Кроме того, новый метод тестирования позволит уменьшить количество инвазивных диагностических процедур у пациенток, вынашивающих плоды без хромосомной патологии.

Оппонент RCOG, которым является SMFM, подчеркивает необходимость получения большего объема данных, особенно среди групп беременных низкого риска, и обращает внимание на ограничение возможностей новых методов. Например, профессор V. Berghella, президент SMFM, полагает, что уровень трисомии 21, выявленный в нескольких последних исследованиях методом НПД по сэ-ДНК, существенно выше, чем обычно выявляется в группе женщин низкого риска, что важно, если это исследование служит основой для расширения инвазивного тестирования. Кроме того, SMFM указывает на следующие ограничения проведенных исследований:

  • Ложно позитивные тесты, которые чаще встречаются при тестировании трисомии 13 и половых хромосом;
  • Некоторые образцы в проведенных исследованиях были взяты у женщин в третьем триместре беременности, когда уровень сэ-ДНК высокий и обусловливает большую точность исследования;
  • В некоторых вышеуказанных случаях подобный скрининг не даст результата (двойни, мозаицизм, ожирение и др.).

В исследовании выявлено только 8 анеуплоидных плодов, что слишком мало для оценки эффективности тестов.

Таким образом, в условиях отсутствия новых клинических рекомендаций по-прежнему проводится рутинный биохимический и ультразвуковой скрининг, однако в ближайшем будущем, по-видимому, изменения в НПД будут внесены с учетом существующих ограничений метода определения сэ-ДНК [12, 24, 25].

Требуются дальнейшие исследования в данной области для определения возможностей клинического применения описанных методов, как у беременных женщин групп риска, так и в качестве скриннинговых методик. Необходима национальная валидация методов НПД и разработка нормативных документов, определяющих их место в обследовании беременных женщин в условиях системы российского здравоохранения.

References

1. Rabinowitz M., Valenti E., Pettersen B., Sigurjonsson S., Hill M., Zimmermann B. Noninvasive aneuploidy detection by multiplexed amplification and sequencing of polymorphic Obstet. Gynecol. 2014; 123(Suppl. 1): 167S.
2. Porreco R., Garite T., Maurel K., Marusiak B., Ehrich M., van den Boom D. et al. Noninvasive prenatal screening for fetal trisomies 21, 18, 13 and the common sex chromosome aneuploidies from maternal blood using massively parallel genomic sequencing of DNA. Am. J. Obstet. Gynecol. 2014; Mar 19. pii: S0002-9378(14)00270-1. doi: 10.1016/j.ajog.2014.03.042. cм. №8
3. Lo Y.M. Non-invasive prenatal testing using massively parallel sequencing of maternal plasma DNA: from molecular karyotyping to fetal whole-genome sequencing. Reprod. Biomed. Online. 2013; 27(6): 593-8.
4. Gorzelnik K., Bijok J., Zimowski J.G., Jakiel G., Roszkowski T. Noninvasive prenatal diagnosis of trisomy 21, 18 and 13 using cell-free fetal DNA. Ginekol. Pol. 2013; 84(8): 714-9.
5. Ford H.B., Schust D.J. Recurrent pregnancy loss: etiology, diagnosis, and therapy. Rev. Obstet. Gynecol. 2009 Spring; 2(2): 76-83.
6. Lim J.H., Kim M.H., Han Y.J., Lee da E., Park S.Y., Han J.Y. et al. Cell-free fetal DNA and cell-free total DNA levels in spontaneous abortion with fetal chromosomal aneuploidy. PLoS One. 2013; 8(2): e56787.
7. Barrett A.N., Chitty L.S. Developing noninvasive diagnosis for single-gene disorders: the role of digital PCR. Methods Mol. Biol. 2014; 1160: 215-28.
8. Papageorgiou E.A., Patsalis P.C. Non-invasive prenatal diagnosis of aneuploidies: new technologies and clinical applications. Genome Med. 2012; 4(5): 46.
9. Benn P., Cuckle H., Pergament E. Non-invasive prenatal testing for aneuploidy: current status and future prospects. Ultrasound Obstet. Gynecol. 2013; 42(1): 15-33.
10. Lo Y.M. PCR-based noninvasive prenatal diagnosis using fetal cells in maternal circulation. Methods Mol. Med. 1998; 16: 265-74.
11. Song Y., Liu C., Qi H., Zhang Y., Bian X., Liu J. Noninvasive prenatal testing of fetal aneuploidies by massively parallel sequencing in a prospective Chinese population. Prenat. Diagn. 2013; 33(7): 700-6.
12. Morain S., Greene M.F., Mello M.M. A new era in noninvasive prenatal testing. N. Engl. J. Med. 2013; 369(6): 499-501.
13. Ishihara N., Matsuo H., Murakoshi H., Laoag-Fernandez J.B., Samoto T., Maruo T. Increased apoptosis in the syncytiotrophoblast in human term placentas complicated by either preeclampsia or intrauterine growth retardation. Am. J. Obstet. Gynecol. 2002; 86(1): 158-66.
14. Leung T.N., Lau T.K., Chung T.Kh. Thalassaemia screening in pregnancy. Curr. Opin. Obstet. Gynecol. 2005; 17(2): 129-34.
15. Masuzaki H., Miura K., Yoshiura K.I., Yoshimura S., Niikawa N., Ishimaru T. Detection of cell free placental DNA in maternal plasma: direct evidence from three cases of confined placental mosaicism. J. Med. Genet. 2004; 41(4): 289-92.
16. Lo Y.M., Hjelm N.M., Fidler C., Sargent I.L., Murphy M.F., Chamberlain P.F. et al. Prenatal diagnosis of fetal RhD status by molecular analysis of maternal plasma. N. Engl. J. Med. 1998; 339(24): 1734-8.
17. Wang S.J., Gao Z.Y., Lu Y.P., Li Y.L., You Y.Q., Zhang L.W. et al. Value of detection of cell-free fetal DNA in maternal plasma in the prenatal diagnosis of chromosomal abnormalities. Zhonghua Fu Chan Ke Za Zhi. 2012; 47(11): 808-12.
18. Gil M.M., Quezada M.S., Bregant B., Ferraro M., Nicolaides K.H. Implementation of maternal blood cell-free DNA testing in early screening for aneuploidies. Ultrasound Obstet. Gynecol. 2013; 42(1): 34-40.
19. Chiu R.W., Akolekar R., Zheng Y.W., Leung T.Y., Sun H., Chan K.C. et al. Non-invasive prenatal assessment of trisomy 21 by multiplexed maternal plasma DNA sequencing: large scale validity study. Br. Med. J. 2011; 342: c7401.
20. Palomaki G.E., Deciu C., Kloza E.M., Lambert-Messerlian G.M., Haddow J.E., Neveux L.M. et al. DNA sequencing of maternal plasma reliably identifies trisomy 18 and trisomy 13 as well as Down syndrome: an international collaborative study. Genet. Med. 2012; 14(3): 296-305.
21. Bianchi D.W., Parker R.L., Wentworth J., Madankumar R., Saffer C., Das A.F. et al. DNA sequencing versus standard prenatal aneuploidy screening. N. Engl. J. Med. 2014; 370(9): 799-808.
22. Bianchi D.W., Wilkins-Haug L. Integration of noninvasive DNA testing for aneuploidy into prenatal care: what has happened since the rubber met the road? Clin. Chem. 2014; 60(1): 78-87.
23. American College of Obstetricians and Gynecologists Committee on Genetics. Committee Opinion No. 545: Noninvasive prenatal testing for fetal aneuploidy. Obstet. Gynecol. 2012; 120(6): 1532-4.
24. Fairbrother G., Johnson S., Musci T.J., Song K. Clinical experience of noninvasive prenatal testing with cell-free DNA for fetal trisomies 21, 18, and 13, in a general screening population. Prenat. Diagn. 2013; 33(6): 580-3.
25. Futch T., Spinosa J., Bhatt S., de Feo E., Rava R.P., Sehnert A.J. Initial clinical laboratory experience in noninvasive prenatal testing for fetal aneuploidy from maternal plasma DNA samples. Prenat. Diagn. 2013; 33(6): 569-74.

About the Authors

Tetruashvili Nana K., Doctor of Medicine, Head of the Department of Pregnancy Loss Prevention and Therapy, Academician V.I. Kulakov Research Center of Obstetrics, Gynecology, and Perinatology, Ministry of Health of Russia. 117997, Russia, Moscow, A. Oparin str. 4. Tel.: +74954381477. E-mail: tetrauly@mail.ru
Parsadanyan Nane G., Graduate student, Department of Pregnancy Loss Prevention and Therapy, Academician V.I. Kulakov Research Center of Obstetrics, Gynecology, and Perinatology, Ministry of Health of Russia. 117997, Russia, Moscow, A. Oparin str. 4. Tel.: +79263304241. E-mail:
Fedorova Nataliy I., candidate of Medicine, obstetrician-gynecologist, Academician V.I. Kulakov Research Center of Obstetrics, Gynecology, and Perinatology, Ministry of Health of Russia. 117997, Russia, Moscow, A. Oparin str. 4. Tel.: +74954381477. E-mail: natasha_fedorova@mail.ru
Trophimov Dmitrii Y., Ph.D. in medical sciences, Head of Laboratory of molecular genetic methods, Academician V.I. Kulakov Research Center of Obstetrics, Gynecology, and Perinatology, Ministry of Health of Russia. 117997, Russia, Moscow, A. Oparin str. 4. Tel.: +74954384951. E-mail: d_trofimov@oparina4.ru
Shubina Ekaterina S., Graduate student, laboratory of molecular genetic methods, Academician V.I. Kulakov Research Center of Obstetrics, Gynecology, and Perinatology, Ministry of Health of Russia. 117997, Russia, Moscow, A. Oparin str. 4. Tel.: +79267218717. E-mail: e_shubina@oparina4.ru

Similar Articles

By continuing to use our site, you consent to the processing of cookies that ensure the proper functioning of the site.