Impaired structural and functional properties of hemoglobin in the pathogenesis of fetal and neonatal hypoxia

Marusov A.P., Ledyaikina L.V., Balykova L.A., Gerasimenko A.V., Akimova E.B.

1N.P. Ogarev Mordovia State Medical University, Saransk 430032, Ulyanova str. 26A, Russia; 2Mordovian Clinical Perinatal Center, Saransk 430013, Pobedy str. 18, Russia
Objective. To investigate major risk factors of fetal and neonatal hypoxia and the role of the impaired structural and functional state of hemoglobin in its pathogenesis.
Subjects and methods. A total of 226 newborn infants with cerebral ischemia were examined. A control group consisted of 50 apparently healthy neonates.
Results. Progressive pathophysiological disorders in the conformation of hemoglobin and its ability to bind and release oxygen were ascertained to develop in the red blood cells of the newborn infants who had experienced perinatal hypoxia. Such impairments correlated with the severity of cerebral ischemia. Gassing with oxygen decreased the ability of hemoglobin to bind ligands and deteriorated its affinity for the latter.
Conclusion. The findings permit the use of Raman spectroscopic data to assess the severity of prior hypoxia and the correction of oxygenation parameters in newborns with cerebral ischemia.

Keywords

hypoxia
preeclampsia
cerebral ischemia
hemoglobin
Raman spectroscopy

Одно из лидирующих мест в структуре заболеваемости и смертности новорожденных традиционно занимают повреждения гипоксически-ишемического характера и их последствия [1]. Наибольшую опасность и прогностическую значимость представляет ишемически-гипоксическое поражение центральной нервной системы (ЦНС), нередко являющееся причиной летальных исходов и играющее ведущую роль в дальнейшей дезадаптации детей и возникновении тяжелых инвалидизирующих заболеваний [2–4].

Успехи медицинской науки и практики, обобщение огромного количества новых данных позволили выйти на качественно иной уровень понимания патологических процессов, лежащих в основе развития ряда критических состояний, в том числе церебральной гипоксии/ишемии [5–6]. Патогенетическая терапия, в частности использование краниоцеребральной гипотермии, представляет собой новую веху в лечении перинатальной гипоксии и ее последствий, однако результаты этого лечения, особенно у недоношенных детей, далеки от совершенства [7–9].

Очевидно, что многие аспекты патогенеза перинатальных гипоксически-ишемических повреждений органов и систем, особенности адаптации новорожденных к перинатальной гипоксии и коррекции ее последствий до настоящего времени недостаточно изучены [10].

Материал и методы исследования

В исследование включены 226 новорожденных, перенесших анте- и/или интранатальную гипоксию, рожденных и/или находившихся на выхаживании и лечении в данных лечебно-профилактических учреждениях.

Дети разделены на 3 группы соответственно степени тяжести церебральной ишемии (ЦИ) (таблица). Контрольную группу составили 50 практически здоровых новорожденных от физиологических беременностей и родов.

РАМАН-спектроскопия гемоглобина проведена 151 новорожденному с перинатальной гипоксией и 50 здоровым детям. Осуществляли заборы крови (0,1–0,2 мл) у новорожденных детей. Делались обычные мазки крови на предметное стекло. Затем с помощью аппарата проводилась РАМАН-спектроскопия с записью кривых РАМАН-спектра гемоглобина новорожденного. Выписывались полоcы спектра РКР гемоглобина при возбуждении лазером 532 нм и соотнесение полос с колебаниями связей порфирина [11].

Соотношение интенсивностей I1375/(I1355+I1375) является характеристикой относительного количества оксигемоглобина в крови или суспензии эритроцитов. Отношение интенсивностей I1355/I1550 отражает относительную способность всего гемоглобина в пробе связывать лиганды (в том числе кислород), а соотношение I1375/I1580 — относительную способность гемоглобина выделять лиганды. Отношение (I1355/I1550)/(I1375/I1580) отражает сродство гемоглобина к лигандам, в первую очередь кислороду.

При использовании лазера 532 нм для сравнительного анализа спектров ГКР от мембраносвязанного и изолированного цитоплазматического гемоглобина рассчитывалось соотношение интенсивностей полос 1375 и 1172 см-1 I1375/I1172. Полоса 1172 см-1 появляется в результате асимметричных колебаний колец пирролов в оксигемоглобине. Отношение I1375/I1172 несет информацию о выраженности симметричных и асимметричных колебаний пиррольных колец, а его изменение может быть связано с конформационными изменениями пирролов. Данные формулы вносились в программу Microsoft Еxcel, производился подсчет данных показателей. Проведено исследование влияния различного потока кислорода на структурно-функциональные особенности гемоглобина in vitro. Взяты пробы крови у новорожденных с различной степенью тяжести церебральных ишемий, осуществлялась подача кислорода с разным потоком (2 л/мин, 5 л/мин, 10 л/мин).

Полученные данные обработаны статистически на персональном компьютере с использованием пакета программ Statistica 8, достоверность полученных результатов оценивалась с использованием критерия Стьюдента t. Корреляционный анализ проводился с использованием критерия Пирсона и коэффициента ранговой корреляции Спирмена.

Результаты исследования

Для оценки функциональной активности эритроцитов и кислород-транспортирующих свойств гемоглобина как важнейшего патогенетического механизма формирования кислородной недостаточности у новорожденных, перенесших перинатальную гипоксию и имеющих ишемически-гипоксические поражения ЦНС, был применен метод спектроскопии комбинационного рассеивания (СКР). Предварительно при оценке спектров КР венозной крови здоровых новорожденных и взрослых людей установлены особенности конформационного состояния гемоглобина новорожденного.

В данной работе для характеристики относительного количества оксигемоглобина в крови определялось соотношение интенсивностей спектров I1375/(I1355+I1375). Относительная способность гемоглобина связывать лиганды рассчитывалась как отношение СКР I1355/I1550. Относительная способность гемоглобина выделять лиганды определялась как отношение СКР I1375/I1580. Сродство гемоглобина к лигандам (в том числе к кислороду) определяли по соотношению интенсивностей (I1355/I1550)/(I1375/I1580). Отношение СКР I 1375/I 1172 использовали для оценки колебаний пиррольных колец, свидетельствующих о конформационных изменениях пирролов.

Согласно полученным данным, в эритроцитах новорожденных по сравнению с эритроцитами взрослых содержится большее количество оксигемоглобина, имеется меньшая относительная способность гемоглобина связывать и выделять лиганды, но более высокое сродство гемоглобина к кислороду. Более интенсивные колебания метиновых мостиков гемоглобина свидетельствуют о конформационных отличиях гемоглобина новорожденных от гемоглобина взрослых. При анализе спектров КР у новорожденных, которые перенесли гипоксию и у которых развилось ишемически-гипоксическое поражение ЦНС, выявлено, что соотношение интенсивностей полос, характеризующих количество оксигемоглобина, растет с увеличением тяжести заболевания, причем данный показатель оказался больше, чем у здоровых новорожденных.

Показатель, отражающий способность гемоглобина связывать лиганды, в первую очередь кислород, у новорожденных с перинатальными поражениями ЦНС уменьшается с увеличением степени тяжести ЦИ. Показатель относительной способности гемоглобина выделять лиганды у новорожденных при ишемически-гипоксическом поражении ЦНС выше, чем у здоровых новорожденных, и растет по мере увеличения тяжести ЦИ. Отношение полос в спектре КР, которое отражает сродство гемоглобина к лигандам, в том числе к кислороду, у новорожденных с ЦИ меньше, чем у здоровых, причем оно уменьшается по мере увеличения тяжести ЦИ (рис. 1).

Показатель, отражающий конформационные изменения пиррольных колец (так называемые колебания метиновых мостиков в гемоглобине), у детей с ЦИ выше, чем у здоровых, и возрастает по мере ее утяжеления, что свидетельствует о более выраженных структурно-функциональных нарушениях гемоглобина. В этих условиях присоединение кислорода к гемоглобину становится еще менее эффективным, способствуя усугублению гипоксии. Таким образом, у новорожденных, перенесших перинатальную гипоксию, в эритроцитах развиваются прогрессирующие патофизиологические нарушения конформации гемоглобина и его способности связывать и выделять кислород.

Морфологический анализ эритроцитов позволяет документировать изменение формы эритроцитов у новорожденных при ишемически-гипоксических поражениях ЦНС, что, по всей видимости, отражает частичные нарушения гемопоэза. Важнейшим патофизиологическим механизмом, лежащим в основе изменения кислород-транспортирующих свойств эритроцитов, выступает перераспределение гемоглобина в их внутреннем объеме. Как видно, интенсивность СКР, связанная с характером распределения гемоглобина, максимально изменяется у новорожденных с ЦИ III степени (рис. 2).

Полученные данные позволяют предположить, что при проведении аппаратной искусственной вентиляции легких (ИВЛ) новорожденным с тяжелой ЦИ повышение напряжения кислорода во вдыхаемой смеси будет нецелесообразным, так как гемоглобин с измененной молекулярной структурой не в состоянии будет его связывать и высвобождать. Хотя на практике для выхаживания доношенных детей, перенесших тяжелую перинатальную асфиксию/гипоксию, продолжают применять ИВЛ с достаточно высоким содержанием кислорода. Эта гипотеза подтверждена нами при анализе спектра КР у новорожденных с перинатальным поражением ЦНС ишемически-гипоксического генеза с применением газации кислорода.

Установлено, что показатель, отражающий способность гемоглобина связывать лиганды (в первую очередь кислород), у новорожденных с ЦИ в пробах без подачи кислорода больше, чем в пробах с газацией, причем способность гемоглобина связывать лиганды уменьшается прямо пропорционально увеличению потока подаваемого кислорода. Возможно, при увеличении потока кислорода, гемоглобин им быстро заполняется, и при уже заполненных молекулах его способность связывать лиганды снижается. Следовательно, гипероксия нарушает транспортную способность гемоглобина у новорожденных.

Отношение полос в СКР, которое отражает сродство гемоглобина к лигандам, в том числе к кислороду, в пробах крови без газации выше по сравнению с пробами с подачей кислорода, и чем больше его поток, тем меньше данный показатель. Очевидно, при гипероксии изменяется конфигурация пиррольного кольца, что приводит к снижению способности гемоглобина связывать кислород (рис. 3). Поэтому детям, перенесшим тяжелую гипоксию, с развившимся в перинатальном периоде поражением ЦНС ишемически-гипоксического генеза нецелесообразно давать кислород в больших концентрациях. Эффектов, которых обычно ждут при этом клиницисты (улучшение общего состояния, показателей кислотно-щелочного равновесия, насыщения тканей кислородом и др.), не будет, а гипероксия, наоборот, приведет к «кислородному парадоксу», заключающемуся в повреждающем действии высоких концентраций кислорода на мембранные структуры после периода длительной гипоксии.

Таким образом, показатели СКР, отражающие способность гемоглобина связывать лиганды и конформационные изменения пиррольных колец (колебания метиновых мостиков), достаточно точно характеризуют структурно-функциональные свойства гемоглобина новорожденных с перинатальными ишемически-гипоксическими поражениями ЦНС и дают возможность корректировать параметры ИВЛ.

Заключение

Важнейшим патофизиологическим механизмом, лежащим в основе развития гипоксии новорожденного, является нарушение кислород-транспортирующих свойств эритроцитов за счет изменения конформационной структуры гемоглобина путем его перераспределения во внутреннем объеме эритроцитов и нарушения его функционального состояния. Тяжесть состояния новорожденных, перенесших перинатальную гипоксию, с развившимся гипоксически-ишемическим поражением ЦНС находится в корреляционной зависимости от изменений структурно-функционального состояния гемоглобина.

В опытах in vitro установлено, что газация кислорода ухудшает функциональную способность гемоглобина новорожденных, что проявляется снижением его способности связывать лиганды и ухудшением сродства гемоглобина к лигандам, очевидно, за счет изменения конфигурации пиррольного кольца. Одним из новых критериев тяжести перенесенной гипоксии может быть также изменение структурно-функциональных свойств гемоглобина, для выявления которого необходимо проводить новорожденным с тяжелой гипоксией РАМАН-спектроскопию, позволяющую более точно определить тактику оксигенотерапии у таких пациентов.

Supplementary Materials

  1. Table 1. Characteristics of the newborn
  2. Figure 1. Changing the relationship of the intensities of the spectral bands of Raman scattering of hemoglobin in neonatal ischemic and hypoxic lesions of the CNS.
  3. Figure 2. The distribution of hemoglobin in the erythrocytes of newborns with cerebral ischemia: a - healthy newborn; b – newborn with a cerebral ischemia I, II (c), III degree (d).
  4. Figure 3. Changing the relationship of the intensities of the characteristic spectral bands of Raman scattering of hemoglobin in newborns with oxygen in vitro.

References

1. Zanelli S.A., Stanley D.P., Kaufman D. Hypoxic-ischemic encephalopathy. 2012. Available at: http://emedicine.medscape.com/article/973501

2. Volodin N.N., Mukhina Yu.G. Childhood diseases. Vol. 1. Neonatology. Moscow: Dynasty; 2011. 511p. (in Russian)

3. Mwaniki M.K., Atieno M., Lawn J.E., Newton C.R. Long-term neurodevelopmental outcomes after intrauterine and neonatal insults: a systematic review. Lancet. 2012; 379(9814): 445-52.

4. Shi J., Xiong Y., Mu D.Z. Clinical evidence for the pharmacological therapy in newborn infants with hypoxic-ischemic encephalopathy. Zhongguo Dang Dai Er Ke Za Zhi. 2009; 11(9): 740-4.

5. Huang Z.H., Sun Y., Chen C. Progress in encephalopathy of prematurity. Zhongguo Dang Dai Er Ke Za Zhi. 2011; 13(10): 771-5.

6. Distefano G., Praticò A.D. Actualities on molecular pathogenesis and repairing processes of cerebral damage in perinatal hypoxic-ischemic encephalopathy. Ital. J. Pediatr. 2010; 36: 63.

7. Takenouchi T., Cuaycong M., Ross G., Engel M., Perlman J.M. Chain of Brain Preservation-a concept to facilitate early identification and initiation of hypothermia to infants at high risk for brain injury. Resuscitation. 2010;81(12): 1637-41.

8. Edwards A.D., Brocklehurst P., Gunn A.J., Halliday H., Juszczak E., Levene M. et al. Neurological outcomes at 18 months of age after moderate hypothermia for perinatal hypoxic ischaemic encephalopathy: synthesis and meta-analysis of trial data. BMJ. 2010; 340: c363.

9. Higgins R.D., Raju T., Edwards A.D., Azzopardi D.V., Bose C.L., Clark R.H. et al. Hypothermia and other treatment options for neonatal encephalopathy: an executive summary of the Eunice Kennedy Shriver NICHD workshop. J. Pediatr. 2011; 159(5): 851-8.

10. Alonso-Alconada D., Álvarez A., Álvarez-Granda L., Hilario E. Therapeutic potential of the endocannabinoid system in perinatal asphyxia. Rev. Neurol. 2011; 53(12): 758-64.

11. Wood B.R., Caspers P., Puppels G.J., Pandiancherri S., McNaughton D. Resonance Raman spectroscopy of red blood cells using near-infrared laser excitation. Anal. Bioanal. Chem. 2007; 387(5): 1691-703.

Received 18.05.2016

Accepted 27.05.2016

About the Authors

Marusov Alexander Pavlovich, MD, Professor, Department of obstetrics and gynecology, N.P. Ogarev Mordovia State Medical University.
430032, Russia, Saransk, Ulyanova str. 26A. E-mail: inst-med@adm.mrsu.ru
Ledyaykina Lyudmila Viktorovna, MD, Professor of Pediatrics, Deputy chief physician of Pediatrics, chief freelance neonatologist of the Republic of Mordovia, Mordovian Clinical Perinatal Center. 430013, Russia, Saransk, Pobedy str. 18. E-mail: ledlv@list.ru
Balykova Larisa Aleksandrovna, MD, Professor, Director of N.P. Ogarev Mordovia State Medical University.
430032, Russia, Saransk, Ulyanova str. 26A. E-mail: inst-med@adm.mrsu.ru
Gerasimenko Alexey Valentinovich, MD, Professor, honored doctor of the Republic of Mordovia, Director of Mordovian Clinical Perinatal Center.
430013, Russia, Saransk, Pobedy str. 18. E-mail: perinatrm@mail.ru
Akimova Ekaterina Borisovna, doctor-Intern, Department of Pediatrics, N.P. Ogarev Mordovia State Medical University.
430032, Russia, Saransk, Ulyanova str. 26A. Tel.: +79375132883. E-mail: blackmoon220@mail.ru

For citations: Marusov A.P., Ledyaikina L.V., Balykova L.A., Gerasimenko A.V., Akimova E.B. Impaired structural and functional properties of hemoglobin in the pathogenesis of fetal and neonatal hypoxia. Akusherstvo i Ginekologiya/Obstetrics and Gynecology. 2017; (1): 54-8. (in Russian)
http://dx.doi.org/10.18565/aig.2017.1.54-8

Similar Articles

By continuing to use our site, you consent to the processing of cookies that ensure the proper functioning of the site.