Вирус папилломы человека (ВПЧ) является самой распространенной инфекцией, передающейся половым путем. В последнее время отмечается значительный рост заболеваний шейки матки, в которых этиологическую роль играет именно наличие высокоонкогенных штаммов ВПЧ [1, 2].
Известно, что 60 штаммов вируса из 120 способны вызывать заболевания половых органов [3–5]. По данным Европейского отделения Международного общества по изучению инфекции в акушерстве и гинекологии (I-IDSOG-EUROPE) ВПЧ подразделяются на следующие группы онкологического риска: высокого (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 46, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 73, 82-й типы) и низкого (6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 70, 72, 81-й типы) [6].
Процесс ВПЧ-инфицирования начинается в клетках базального слоя эпителия, куда вирус проникает через микротравмы и участки воспаления. Процесс репликации и образования вирионов происходит по мере дифференцировки клеток и перемещения их в верхние слои, где вирус собирает капсид, и в процессе отшелушивания высвобождаются вирионы [7]. Эта стадия инфекции является продуктивной и может сопровождаться формированием цервикальной интраэпителиальной неоплазии (ЦИН) легкой степени. Далее инфекция переходит в стадию трансформации, и на протяжении длительного периода (от 1 до 10 лет) разные степени неоплазии, как правило, последовательно сменяют друг друга. В молекулярно-биологическом плане это сопровождается патологическими изменениями механизмов клеточной пролиферации, дифференцировки, апоптоза, нарастанием генетической нестабильности и атипии клеток. Инвазия измененных клеток сопровождается нарушением межклеточных контактов, выделением факторов, разрушающих базальную мембрану, стимулирующих неоангиогенез и сосудистую мимикрию.
После инфицирования ВПЧ уже через 3 года у 27% женщин развивается ЦИН высокой степени. Наиболее опасным фактором прогрессии является длительная (более 2 лет) персистенция ВПЧ [8].
Известно, что в большинстве случаев (85–90%) ВПЧ-инфекция спонтанно регрессирует в течение нескольких месяцев. Однако, если ВПЧ высокоонкогенных типов не элиминируются, риск развития ЦИН шейки матки различной степени, а также инвазивной карциномы, увеличивается. Это обусловливает важность диагностики ВПЧ-ассоциированных заболеваний шейки матки на ранних этапах их развития [9].
По данным исследования 2004–2008 гг., проведенного Центром по контролю и профилактике заболеваний США (CDC), за год в США регистрируется около 33 300 случаев ВПЧ-ассоциированного рака. 21 300 случаев ВПЧ-ассоциированного рака диагностируется каждый год среди женщин и около 12 000 – среди мужчин. Рак шейки матки (РШМ) является наиболее распространенной формой ВПЧ-ассоциированного рака среди женщин. ВПЧ является причиной более чем 91% анального рака и РШМ, более 75% – рака влагалища и 69% – рака вульвы (данные международного агентства по исследованию рака) (табл. 1) [10].
Диагностика ВПЧ-ассоциированных заболеваний
Исследования последних 20 лет привели к пониманию многих моментов биологии ВПЧ и сыграли большую роль в поиске и разработке новых методов диагностики. В диагностике предраковых заболеваний и РШМ применяются различные методы: цитологический; расширенная вульво-, вагино- и кольпоскопия; жидкостная цитология; молекулярно-генетические (генотипирование вируса, определение вирусной нагрузки, экспрессия вирусных онкобелков Е6, Е7, метод «гибридного захвата» (Digene-тест)); морфологическое исследование; иммуноцитохимическое и иммуногистохимическое исследование онкомаркеров p16 и Кi67; оптико-электронное сканирование ткани шейки матки (TruScreen). Скрининг РШМ в России включает в себя взятие мазков на онкоцитологию, в то время как в США и в ряде стран Европейского Сообщества сегодня предпочтение отдается ВПЧ-тесту.
Проведение кольпоскопии с последующей биопсией является стандартом диагностики характера патологически измененного эпителия шейки матки [11].
Но гистологическое заключение, как правило, сводится к анализу структуры тканей и не может быть маркером риска дальнейшего прогрессирования процесса или его регресса, что является очень важным для молодых женщин. К тому же ошибки, которые встречаются при гистологическом анализе ЦИН различной степени тяжести, могут приводить либо к слишком интенсивному, иногда неоправданному лечению, либо, наоборот, к недостаточно радикальному лечению пациентов, что особенно опасно при дисплазии тяжелой степени. В этой связи особое значение приобретают молекулярно-генетические исследования, а также анализ молекулярного состава биологических жидкостей и тканей методами масс-спектрометрии (МC) и ядерно-магнитного резонанса (ЯМР) [11].
Роль цервиковагинальной жидкости (ЦВЖ) в диагностике различных состояний женского репродуктивного тракта
ЦВЖ имеет огромное значение в поддержании гомеостаза и иммунитете женского полового тракта. В частности, ЦВЖ можно рассматривать как источник биомаркеров гинекологических заболеваний, так как молекулярный состав ЦВЖ определяется состоянием органов женской репродуктивной системы [9].
Женский репродуктивный тракт обладает уникальной иммунологической микросредой, обеспечивающей выполнение генеративной функции [12]. Слизистые оболочки генитального тракта создают механический и функциональный барьер для вторжения патогенных микроорганизмов путем выделения слизистого секрета, который увлажняет поверхность и препятствует адгезии бактерий на эпителиальных клетках [13]. Одновременно слизистые оболочки являются иммунологическим фильтром, в котором можно выделить клеточное (макрофаги, нейтрофилы и лимфоциты) и гуморальное звено (иммуноглобулины, эйкозаноиды (простагландины и лейкотриены), лактоферрин, лизоцим, пропердин, белки системы комплемента, цитокины и др.) [14, 15].
Слизистая оболочка нижних отделов женских половых путей заселена синантропными бактериями, которые являются важным защитным фактором. Нормальная влагалищная флора состоит в основном из лактобацилл (Lactobacillus (L) crispatus, L. iners, L. Jensenii); также могут присутствовать и облигатно-анаэробные виды микроорганизмов, но в существенно более низких концентрациях. Гликоген из отслоившихся эпителиальных клеток сначала метаболизируется до глюкозы, которая затем используется флорой влагалища для выработки молочной кислоты, поддерживающей рН среды влагалища на низком (3,8–4,5) уровне [15–18]. Кроме того, некоторые лактобациллы (например, L. crispatus) вырабатывают перекись водорода в смертельной для патогенных микроорганизмов концентрации. Комменсалы могут конкурировать с нерезидентными бактериями за доступность питательных веществ, а некоторые бактерии производят широкий спектр антимикробных пептидов (бактериоцинов), лизоцим и аминокислоты. Все эти факторы подавляют рост чужеродных бактерий и оказывают совместно селективное антимикробное действие, способствующее сохранению нормальной микрофлоры влагалища [13, 14, 18, 19].
Адаптационные механизмы локального иммунитета нижнего отдела половых путей в настоящее время известны. Так, дендритные клетки (клетки Лангерганса) слизистых оболочек половых путей, способны представлять антигены Т-лимфоцитам и в результате запускать адаптивный иммунный ответ [16, 20]. Кроме того, плазматические клетки, локализованные в соединительной ткани слизистой оболочки, выделяют иммуноглобулины IgG и секреторные IgA в ЦВЖ. Эти иммуноглобулины способствуют активации других клеток иммунной системы, препятствуя бактериальной адгезии и опсонизации патогенов [14]. Другим важным компонентом локального иммунитета системы женских половых органов является ЦВЖ, которая состоит из выделений сальных, потовых, бартолиновых и желез Скене, транссудата плазмы, отслоившихся эпителиальных клеток, бактериальных продуктов, шеечной слизи, секрета желез эндометрия и маточных труб [21]. ЦВЖ состоит в основном из воды и содержит муцин, белки, углеводы, липиды, холестерин, аминокислоты и неорганические ионы. В составе ЦВЖ были определены возможные белки-маркеры различных заболеваний генитального тракта (бактериальный вагиноз, вагиниты, цервициты) [22].
Выявление изменений протеомного состава ЦВЖ может дать важную информацию о патогенезе многочисленных гинекологических заболеваний, в первую очередь – хронических воспалительных процессах нижнего отдела генитального тракта. Исследования последних 10 лет подтвердили высокий потенциал диагностики и прогнозирования различных заболеваний при помощи биологических жидкостей организма [23], что также справедливо и для ЦВЖ. Низкая стоимость и простота забора образца, отсутствие риска осложнений, связанных с биопсией, а также возможность наблюдения большого числа больных с использованием множества образцов являются очевидными преимуществами использования ЦВЖ для диагностики различных состояний женского генитального тракта [24–26]. Для сбора ЦВЖ наиболее часто применяются четыре метода: цервиковагинальный смыв (влагалище и влагалищную часть шейки матки промывают буферным раствором, то есть 5% уксусной кислотой или физиологическим раствором, после чего собирается полученная жидкость); цервиковагинальные щетки (специальные щетки, которые прикладываются к слизистой оболочке влагалища и шейки матки, чтобы собрать ЦВЖ); цервиковагинальные тампоны (тампоны или губки, поглощающие ЦВЖ); устройства мембранного типа (специальная чашечка для сбора цервикальной жидкости).
Ряд исследователей полагают, что биомаркеры, определяемые в ЦВЖ, окажутся более специфичными и чувствительными для раннего определения патологических процессов женской репродуктивной системы по сравнению с биомаркерами в крови [27]. Результаты протеомных исследований демонстрируют, что образцы ЦВЖ женщин с бактериальным вагинозом имеют дефицит антимикробной активности в связи с низкими уровнями экспрессии нескольких антимикробных пептидов таких как: секреторный ингибитор протеиназы лейкоцитов (SLPI), дефензины, лизоцим и лактоферрин [18, 28–31]. Кроме того, обнаружены различия в уровнях экспрессии некоторых провоспалительных цитокинов, коррелирующие с бактериальным вагинозом. Таким образом, бактериальный вагиноз приводит к нарушению нормального врожденного и адаптивного иммунного ответа и индуцирует воспалительные изменения в нижних отделах половых путей, что может привести к повышенной восприимчивости к инфекциям, передающихся половым путем, в том числе к ВИЧ-инфекции [32, 33].
Анализ ЦВЖ с использованием методов протеомики может дать новую информацию о нарушениях реакций иммунитета женских половых органов, их связи с развитием бактериального вагиноза, хронического цервицита, вагинита, и более глубоко изучить этиологию и патогенез указанных заболеваний. Однако надо иметь в виду, что ряд факторов оказывает влияние на белковый состав ЦВЖ, например, колебания содержания эстрогенов и прогестерона в течение менструального цикла [15, 34], сопутствующие заболевания, возраст [35], использование противозачаточных средств [36–39].
Протеомный анализ ЦВЖ
Группой N. Venkataraman [40] впервые был исследован белковый состав ЦВЖ и доказана роль ЦВЖ в защите организма от ВИЧ. Авторы показали, что в ЦВЖ проявляется анти-ВИЧ активность, формирование которой обеспечивается синергичным действием множества белков и пептидов, в частности кальгранулина А/B, лизоцима, человеческого нейтрофильного пептида, елафина и некоторых гистонов.
Di Quinzio и соавт. исследовали фракции белков ЦВЖ 5 женщин в 3-м триместре беременности с целью прогнозирования начала предстоящих родов. Авторы выделили 15 белков, присутствующих во всех образцах ЦВЖ [41]. Функции этих белков связаны с процессами кровообращения, структурной целостности, метаболизма жирных кислот, связыванием кальция, воспалительного ответа. В результате была создана панель белков-маркеров преждевременного разрыва плодных оболочек [42]. При анализе фракций белков ЦВЖ весом 25–45 кДа у беременных женщин за 14–17, 7–10 и 0–3 дня до родов и во время родов были обнаружены изменения в экспрессии пяти белков (серпин Б3, серпин Б1, аннексин А3, коллаген альфа-2 IV типа и альбумин), которые коррелируют с естественными изменениями, характерными для преждевременных родов [42].
S. Dasari с соавт. провел полный протеомный анализ ЦВЖ [43]. В результате идентифицировано 150 белков, большинство из которых выполняют иммунные, защитные или метаболические функции, из них 77 белков оказались уникальными по сравнению с белками крови и амниотической жидкости. Оказалось, что экспрессия 28 белков ЦВЖ отличается у женщин с угрожающими преждевременными родами. Из них 17, которые были подтверждены методом дифференциального двумерного электрофореза (2D-DIGE), могут рассматриваться в качестве потенциальных биомаркеров спонтанных преждевременных родов [12].
Полномасштабный протеомный скрининг ЦВЖ, выполненный группой J.L. Shaw высокочувствительными методами двумерной хромато-масс-спектрометрии, обнаружили более 680 белков в ЦВЖ, причем представленность белков калликреиновой группы была ассоциирована с риском преждевременного разрыва оболочек плодного пузыря. Данные белки принимают участие в отшелушивании вагинальных эпителиальных клеток и активации цервиковагинальных антимикробных белков. Экспрессия цервиковагинального калликреина связана с преждевременным разрывом оболочек плодного пузыря [44].
Группой L.J. Tang была продемонстрирована возможность активации полиморфноядерных клеток (нейтрофилов и эозинофилов) белками ЦВЖ, секретируемыми в нижних отделах женского генитального тракта. В 47% случаев состав ЦВЖ представлен белками, которые могут влиять на проницаемость слизистой оболочки половых путей. Поскольку проницаемость часто повышается в случае воспалительных заболеваний шейки матки (эндометриты, цервициты, вагиниты, вульвиты и др.), эти плазменные белки, в конечном счете, могут быть использованы вместе с секретируемыми белками активированных нейтрофилов и эозинофилов (например, лактоферрин, миелопероксидазы, липокалин и эозинофильные белки) в качестве маркеров для ранней диагностики воспаления нижних отделов генитального тракта [45].
Белковый состав ЦВЖ отражает не только изменения, связанные с беременностью, но и ранние изменения, появляющиеся при поражении эпителия шейки матки во время заболеваний, ассоциированных с папилломавирусной инфекцией. Следовательно, развитие цервикальных неоплазий и, впоследствии, РШМ находит свое отражение в белковом составе ЦВЖ. Протеомный анализ ЦВЖ выявил 16 возможных биомаркеров, из которых α-актинин-4 (р=0,001) и изозим пируваткиназы M1/M2 (р=0,014) оказались наиболее перспективными у пациенток с ВПЧ-ассоциированными заболеваниями шейки матки. Методом ELISA (n=28) было показано, что содержание альфа-актинина-4 достоверно отличается в образцах ЦВЖ здоровых женщин и женщин с ВПЧ-инфекцией (р=0,009). Дополнительно был измерен уровень α-актинин-4 в ЦВЖ 29 пациентов (n=29) при неоднократном заборе образцов и было обнаружено, что α-актинин-4 коррелирует с временем персистенции ВПЧ. Таким образом, альфа-актинин-4 является перспективным биомаркером для выявления предраковых заболеваний шейки матки [9]. Аналогично, группой G. Zegels при исследовании протеомного состава ЦВЖ при ВПЧ-ассоциированных заболеваниях шейки матки был выявлен белок S100A9 в качестве маркера патологического процесса. Белок S100A9 образует с S100A8 гетеродимер кальпротектин и обладает мощным антибактериальным действием [46]. В исследовании Andersch-Björkamn с соавт. было выявлено 178 белков цервикальной слизи. Результаты протеомного исследования показали, что состав цервикальной слизи был похож до и после овуляции, однако отличался во время овуляции, что проявлялось в изменении степени гликозилирования компонентов слизи [47, 48].
Доказано, что при персистенции высокоонкогенных типов ВПЧ возникает экспрессия онкобелков (Е6/Е7), в том числе в ЦВЖ. Онкобелки Е6 и Е7 взаимодействуют с генами, отвечающими за локальный иммунитет [49]. Во время этого периода, длительность которого может составлять до нескольких лет, иммунные клетки вызывают лизис атипических клеток многослойного плоского эпителия при одновременном противодействии со стороны ВПЧ. Ряд авторов полагают, что в 80% случаев поражение эпителия шейки матки легкой степени указывает на активность иммунной системы. Поэтому можно предположить, что иммунный ответ при интраэпителиальных поражениях шейки матки достаточен для эффективного лизиса атипичных клеток и содержание белков-биомаркеров в ЦВЖ, определенное методами иммуноферментного анализа или масс-спектрометрии, может быть потенциальным прогностическим фактором развития РШМ [50].
Заключение
Изучение протеомного и метаболомного профилей ЦВЖ представляется перспективным для прогнозирования течения неопластического процесса шейки матки и выявления корреляции между степенью тяжести ЦИН, ВПЧ-нагрузкой и уровнем данных маркеров в динамике наблюдения. Исследование специфических генетических, эпигенетических, протеомных изменений позволит в дальнейшем использовать их в многокомпонентной тестовой системе диагностики и прогноза ЦИН и начальных стадий рака. Также возможно развитие нового подхода в таргетной терапии РШМ.
