Синдромы, обусловленные аномалиями кариотипа, такими как нарушение числа хромосом (анеуплоидии) или их структуры (делеции, дупликации, инверсии и транслокации), называются хромосомными. Эти синдромы характеризуются одновременным поражением многих систем и органов, что является основной причиной инвалидности и ранней детской смертности. Чаще хромосомные синдромы не наследуются, а в 90% случаев, являются следствием новых мутаций (de novo) в половых клетках родителей. Частота хромосомных аномалий составляет 5–7 случаев на 1000 новорожденных, из них 35% приходиться на аномалию половых хромосом, до 25% – на аутосомные трисомии [1].
Основным методом диагностики хромосомных аномалий является дифференциальная окраска хромосом – GTG-кариотипирование. Технология окрашивания, первоначально предложенная Seabright (1971) [36], основана на приобретении хромосомами по всей длине поперечных светлых и темных полос при обработке трипсином с последующей окраской красителем Гимзы [3]. Данный метод, однако, малопригоден для окраски хромосом из клеток хориона, полученных прямым методом. Стабильную дифференциальную окраску таких хромосом можно получить c помощью флуорохрома Hechst33258/AcD [2]. Этот метод позволяет провести анализ всего кариотипа, выявить ряд хромосомных синдромов, вызванных нарушением числа целых хромосом (анеуплоидия), идентифицировать хромосомные перестройки или мозаицизм (аномальный клеточный клон) и его доли в организме под световым микроскопом, разрешающая способность которого равна приблизительно 5Mb (5–10 млн пар нуклеотидов) [10].
Главным условием цитогенетической диагностики является получение делящихся клеток после 7–14 сут культивирования клеток или через 2–5 дней при наличии митозов в ворсинках хори-она [13, 14, 18].
Однако разрешающая возможность микроскопа не может выявить размеры перестроек от 1 до 5 Mb, т.е. микроделеций, возникающих вследствие потери групп генов в рамках одного хромосомного сегмента [40]. Для определения микроделеций применяют молекулярно-цитогенетические методы, отличающиеся более высокой разрешающей способностью.
В конце прошлого века появились молекулярно-цитогенетические методы, которые преодолевают некоторые ограничения GTG-кариотипирования. Проведение анализа данными методами возможно на небольшом числе клеток без культивирования или их ДНК [31]. Разрешающая возможность этих методов определяется минимальным размером последовательности хромосомной ДНК (числом нуклеотидов), которую возможно регистрировать с помощью высокоразрешающей оптической или автоматизированной систем детекции и анализировать с помощью специализированной компьютерной программы.
Молекулярно-цитогенетические методы широко применяются при невозможности проведения GTG-кариотипирования клеток с низкой пролиферативной активностью, для быстрого выявления или уточнения определенных (таргетных) хромосомных патологий в пренатальной диагностике. Эти методы применяются в онкоцитогенетических исследованиях для выявления хромосомного маркера, прогнозирования и мониторинга онкологических заболеваний, в предимплантационной диагностике и в педиатрии, у детей с врожденными пороками и/или задержкой умственного развития [5, 19, 32, 42, 43].
Во всем мире в настоящее время для пренатальной диагностики применяются следующие перспективные молекулярно-цитогенетические методы:
• интерфазная флуоресцентная in situ гибридизация (FISH-метод) [38];
• количественная флуоресцентная полимеразная цепная реакция КФ-ПЦР (QF-PCR) [28];
• мультиплексная лигазная цепная реакция МЛЦР (MLPA) [30];
• система анализа prenetal BACs-on-Beads (BoBs) [12, 23];
• метод сравнительной геномной гибридизации СГГ (CGH) [20, 21] (табл. 1).
Цель обзора состоит в анализе различных молекулярно-цитогенетических методов в пренатальной диагностике анеуплоидий, мозаицизма, микроделеционных синдромов.
Метод флуоресцентной in situ гибридизации (FISH) позволяет исследовать как метафазные хромосомы, так и интерфазные клетки. Метод основан на реакции гибридизации специально созданных флуоресцентных ДНК – (зондов) с известной уникальной ДНК последовательностью в определенном комплементарном районе исследуемой хромосомы. ДНК-проба (зонд) – это фрагмент или фрагменты нуклеиновых кислот, меченые таким образом, чтобы было возможно проведение их детекции после гибридизации in situ [8]. Визуальная оценка результатов гибридизации специалистом-исследователем базируется на наличии флуоресцентного сигнала в изучаемом районе хромосомы и сравнении его с гомологичной хромосомой [38].
Сформированы и постоянно дополняются хромосомспецифичные ДНК-библиотеки для диагностики наиболее частых синдромов, таких как Патау, Эдвардса, Дауна (трисомии по аутосомам 13, 18, 21 соответственно), Клайнфельтера и Шерешевского-Тернера (связанные с нарушением числа половых хромосом Х и Y) [7, 20, 34]. Созданы специальные наборы до 5 ДНК-проб для одновременного проведения дифференцированного анализа на одном препарате разных хромосомных патологий (Abbott Molecular, Vysis®, США).
Для определения робертсоновских транслокаций, синдромов Прадера-Вилли, Ангельмана и т.д. разработаны локусспецифичные зонды, которые применяются с целью выявления некоторых делеций и перестроек хромосом.
Для сложных межхромосомных перестроек применяют цельнохромосомные зонды, однако данная технология является дорогостоящей и используется в основном для научных исследований [18]. FISH-метод стал неотъемлемой частью в пренатальной диагностике всестороннего цитогенетического анализа патологических структур хромосом до или после стандартного кариотипирования, маркерных хромосом и уровня мозаицизма [16, 25, 35]. Современные протоколы FISH-метода предлагают возможность определения анеуплоидии и некоторых микроделеционных симптомов в течение 2 ч после взятия эмбрионального образца [16, 39]. Многочисленные данные литературы о применении FISH-метода в пренатальной диагностике свидетельствуют почти о 100% чувствительности и специфичности метода [8, 18, 37, 42].
При этом FISH-метод имеет ряд ограничений. На одном препарате сложно поставить и провести анализ более 5 проб одновременно, что не всегда покрывает объем поиска, а повторная гибридизация на одном препарате может привести к ошибке цитогенетического анализа. Недостаточное число клеток или контаминация материнскими клетками также создают дополнительные сложности для постановки правильного диагноза. Установлено, что ДНК-зонды непрямого мечения, где нуклеотиды связаны репортерными молекулами для образования связывающего комплекса между флуоресцентной меткой, увеличивают число артефактных сигналов [4]. Барьерными факторами для применения данной методики являются: применение всего пяти флуоресцентных красителей, неполная библиотека таргентных зондов у фирм изготовителей, ограничение оптического разрешения микроскопа и высокая стоимость исследования по сравнению с классическим кариотипированием (табл. 1).
Метод количественной флуоресцентной полимеразной цепной реакции (КФ–ПЦР, QF-PCR) может выявить количественный состав продуктов ДНК. Определенные районы ДНК плода (STR-локусы) связывают флуоресцентными метками, число которых увеличивают (амплифицируют) в миллионы раз с помощью ПЦР, затем на ДНК-анализаторе проводится определение фрагментов, а результат анализируется с помощью компьютерной программы.
Метод QF-PCR может применяться в пренатальной диагностике у женщин с высоким риском рождения ребенка с хромосомной патологией для скрининга на частые анеуплоидии и/или хромосомные перестройки у плода при семейном носительстве. Такой подход снижает число случаев, требующих диагностического GTG-кариотипирования до 13% от количества образцов, направленных для цитогенетического анализа, а частота выявленных хромосомных патологий составляет 99–92%. При сравнении с GTG-кариотипированием и FISH-анализом ручной труд, время диагностики и материальные затраты существенно снижаются [9, 18, 25, 33].
К ограничениям метода относятся невозможность выявлять мозаицизм низкого уровня и структурные сбалансированные аномалии de novo (табл. 1).
Мультиплексная амплификация с использованием лигированных олигонуклеотидных зондов (MLPA), метод основан на гибридизации разных по длине олигонуклеотидных праймеров (фрагментов нуклеиновой кислоты, которые служат стартовой точкой при репликации ДНК) с исследуемой ДНК, последующим лигированием (от лат. ligare – «связывать», соединение двух молекул с образованием новой химической связи), проведением ПЦР и сравнительном анализе длины исследуемых и контрольных образцов специальным прибором. В методике используется способность ДНК-лигазы соединять две пары комплементарных олигонуклеотидов с последовательностями исследуемой in vitro ДНК. Специфичность реакции обеспечивается тем, что любое нарушение гомологии в области соединения двух олигонуклеотидов сразу же предотвращает их лигирование. Метод зависит от структуры ДНК-зондов и в основном применяется для выявления частых анеуплоидий, и редко – для определения микроделеционных патологий [12, 28, 43].
К барьерным факторам метода относятся различия длины праймеров, что усложняет количественные шаги ПЦР, так как мелкие фрагменты лучше амплифицируются. Для решения этого технического барьера разработан простой и быстрый метод обработки и анализ данных большого количества образцов полностью автоматизированным способом – MLPA на матрице (аrray-MLPA) [28]. В клинической молекулярной диагностике применение MLPA на матрице (чипе) рассматривается как быстрая и чувствительная технология для выявления частых анеуплоидий, которую целесообразно применять для крупномасштабного тестирования на частые анеуплоидии в клинических лабораториях. Данная технология является менее трудоемкой и не дорогой по сравнению с GTG- и FISH-методами [23] (табл.1).
Новейший метод prenetal BACs-on-Beads (BoBs) представляет собой быстрый метод, который позволяет одновременно выявлять анеуплоидии по хромосомам 13, 18, 21, Х, У и микроделеционные регионы хромосом, обусловливающие развитие 9 синдромов [24] (табл. 2).
Технология BoBs (PerkinElmer, Inc.) – метод, в котором применяют прикрепленные к микросферам ДНК-зонды (сферические биочипы), полученные из определенных искусственных бактериальных хромосом (BAC). Технология включает в себя гибридизацию (аналогично с FISH-методом) меченой ДНК-пробы и контрольной ДНК с комплементарными зондами. Для достоверности исследования гибридизацию проводят в двух параллельных пробах. В качестве внутреннего контроля используется ДНК мужского и женского образцов без патологий. Интенсивность сигналов определяется диагностической системой мультипараметрического флуоресцентного анализа Luminex 100/200, с программным обеспечением (Luminex Corporation). Результаты анализируются специализированной программой. Продолжительность исследования составляет 24 ч. Тесты на хромосомную патологию, в зависимости от цели исследования, в данном методе могут по необходимости быть изменены [12].
F. Vialard и соавт. установили, что BoBs выявляет клеточный мозаицизм до 20–30%, является высокоспецифичным и чувствительным методом (>99; >98% соответственно) с низкой себестоимостью за счет исследования 44 образцов за один цикл реакции [41]. Таким образом, результаты исследования имеют высокую диагностическую и прогностическую значимость (табл. 1).
Метод сравнительной геномной гибридизации, или молекулярное кариотипирование (СГГ, CGH) предложен более 10 лет назад [40]. Метод основан на конкурентной in situ гибридизации на метафазных пластинках ДНК здорового человека, полученной из анализируемой ткани, c контрольной ДНК, меченной разными флуорохромными красителями. Впоследствии, при помощи цифрового анализа производится сравнительная оценка различий интенсивности флуоресцентного свечения в конкурентном и опытном образцах для определения избытка или недостатка числа копий целых хромосом и их отдельных участков. Метод проводит молекулярный анализ всего генома, включая анеуплоидию, все известные делеции, дупликации во всех хромосомах без непосредственного просмотра хромосом в течение 2 дней.
Модификация этого метода – матричная СГГ (array CGH), основана на проведении гибридизации на микрочипе, содержащем фрагменты ДНК или олигонуклиотидных последовательностей, дисбаланс в которых может возникнуть где угодно в геноме и проявляться врожденными патологиями и ограниченными интеллектуальными возможностями. Разрешающая способность метода определяется размером ДНК-мишени и количеством проб, нанесенных на микрочип [6]. Технология позволяет выявить хромосомные изменения размером менее 1 Mb (1 млн пар нуклеотидов) [17]. Этот подход успешно применили для определения хромосомных патологий эмбриональной ДНК в крови матери [26].
По мнению американской коллегии акушеров и гинекологов [10], применение этой технологии в пренатальной диагностике ограничено, поскольку не решены вопросы интерпретации результатов геномных дисбалансов, имеющих большое клиническое значение, от показателя естественного полиморфизма в популяции. Недостатком метода является невозможность выявить структурные перестройки (транслокации, инверсии), полиплоидию и низкоуровневый мозаицизм. Следует отметить более высокую стоимость метода по сравнению с проведением стандартного анализа кариотипа [10, 15, 39, 43]. Эти ограничения метода можно преодолеть, последовательно применяя альтернативные методы пренатальной диагностики. К примеру, целесообразно CGH-методом провести исследование плода с аномалиями развития, выявленными при УЗИ, а для выявления полиплоидии и низкоуровневого мозаицизма провести интерфазный FISH-анализ с применением центромерных ДНК-зондов [6]. При отрицательном результате исследования целесообразно провести стандартное GTG-кариотипирование клеток плода для выявления структурных перестроек, в том числе и сбалансированных, которые встречаются реже. Дальнейшее накопление фактического материала позволит расширить область знаний об уровне возникновения и структуре хромосомных патологий для пренатальной диагностики [20, 21]. Технологию рекомендуют применять для выявления ранее не обнаруженных геномных и/или хромосомных нарушений при обследовании плода с множественными пороками развития и детей с врожденными пороками/или задержкой развития [17, 21, 43]. Метод сравнительной геномной гибридизации позволит дать более точную характеристику этим нарушениям и помочь врачу-генетику в прогнозировании тяжести болезни.
При обобщении перечисленного ранее следует, что молекулярно-цитогенетические методы позволяют быстро и точно определить мутации как на генном, так и на молекулярном уровне организации хромосом. Данные методы концентрируются на особых «горячих точках», то есть критических областях, изменение которых связано с определенными патологическими симптомами, и позволяют выявлять аномалию хромосом вне разрешающей возможности микроскопа. Это дает возможность выбрать соответствующий метод для конкретной диагностической задачи. Преимущество данных методов диагностики состоит в том, что они автоматизированы (кроме FISH-метода), что исключает субъективную оценку результатов. Для исследования применяют ДНК или интерфазные клетки без культивирования. Таким образом, появилась возможность сообщать результат раньше, чем при GTG-кариотипировании, и точно идентифицировать причины дисбаланса [43]. При этом внедрение этих технологий требует высоких затрат на аппаратуру, реактивы, а также высокой квалификации специалиста молекулярной цитогенетики (табл. 1). По заключению ряда авторов, вышеперечисленные молекулярно-цитогенетические методы быстры, просты, обладают высокой чувствительностью и специфичностью, приближающихся к 100%, и в меньшей степени зависят от уровня подготовки цитогенетика. Данные технологии могут применяться в качестве единственного метода для диагностического пренатального скрининга при крупномасштабном тестировании частых анеуплоидий [9, 11, 22].
К ограничениям вышеперечисленных молекулярно-генентичеких методов относятся невозможность исследования изменений структуры хромосом, доли аномальных клеточных линий в организме и числа хромосом, не включенных в процесс гибридизации, что ведет к пропуску потенциально тяжелых цитогенетических нарушений.
Таким образом, заключение о наличии хромосомной патологии должно основываться на результатах комплексной оценки результатов клинических, лабораторных и молекулярно-цитогенетических исследований [27]. Последовательность применения каждого молекулярно-цитогенетического метода должна обосновываться целями пренатальной диагностики и результатом предыдущего исследования в каждом конкретном клиническом случае. Возможная стратегия обследования плода с особенностями фенотипа, по данным эхографии, заключается в том, что при выявлении любым молекулярно-генетическим методом хромосомной патологии, диагноз можно поставить без дальнейшего кариотипирования. При отрицательном результате таргетного молекулярно-генетического исследования целесообразно провести GTG-кариотипирование.
Понятие «таргетное молекулярно-генетическое кариотипирование» входит в клинический круг диагностики частых хромосомных нарушений не только пренатально, но преимплантационно для оценки эмбриональных потерь, онкологии у детей и родителей при соответствующих показаниях.
Поэтому в пренатальной диагностике будущее принадлежит таргетным молекулярным-цитогенетическим методам, которые обладают высокой разрешающей способностью и достоверностью.
