Gene methylation in the placenta of fetuses with fetal growth restriction

В настоящее время большое значение приобретает изучение концепции фетального программирования, определяющего сформированную еще во внутриутробном периоде восприимчивость организма к заболеваниям [1–3]. Гипотеза, впервые выдвинутая D. Barker, предполагает, что неблагоприятные факторы окружающей среды вызывают морфологические и физиологические изменения у плода, адаптационный характер которых направлен на поддержание его гомеостаза [4]. В течение последних 30 лет в мировой литературе появилось множество работ о взаимосвязи между дефицитом массы тела при рождении и риском развития метаболических, сердечно-сосудистых и неврологических заболеваний [5–7]. Несмотря на понимание важности механизмов, лежащих в основе внутриутробного программирования, они остаются малоизученными [8, 9]. Согласно последним исследованиям, предположительную роль играют эпигенетические изменения некоторых генов, возникающие в ответ на негативные факторы пренатального периода [10–13]. Плацента – уникальный орган, позволяющий изучить взаимодействие генетических факторов и факторов окружающей среды, а также их вклад в развитие заболеваний [14, 15]. Изучение эпигенетических изменений ДНК плаценты представляет большой интерес в связи с перспективностью разработки новых диагностических тестов на основании определения эпигенетических меток в других биологических субстратах. Полученные знания об эпигенетической регуляции позволят в будущем внедрить их в развитие новых терапевтических методов. Одним из наиболее изученных эпигенетических механизмов, осуществляющих контроль генной экспрессии, является метилирование в области CpG динуклеотидов в промоторных регионах ДНК [16, 17].

Целью исследования было изучение профиля метилирования ДНК в плаценте при задержке роста плода (ЗРП).

Материалы и методы

Было изучено 38 образцов плацент от пациенток, которые поступили и были родоразрешены в ФБГУ «НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова» Минздрава России. Женщины были разделены на 2 группы: 1-ю группу составили 18 пациенток c подтвержденным диагнозом ЗРП, 2-ю группу – 20 женщин с физиологическим течением данной беременности. Данное исследование было одобрено локальным этическим комитетом ФБГУ «НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова» Минздрава России, всеми пациентками было подписано информированное согласие на участие. Критериями включения в исследование послужили: спонтанная одноплодная беременность, отсутствие острых инфекционных заболеваний, тяжелых экстрагенитальных патологий и миомы матки больших размеров у матери, отсутствие хромосомных и генетических аномалий и пороков развития у плода.

Забор плацентарной ткани производили сразу после родов. Образцы плацент были обработаны и отмыты от материнской крови в физиологическом растворе при температуре –4 °С. В исследовании были использованы ворсины хориона в месте прикрепления пуповины. Образцы тканей хранили при температуре –80° С. ДНК из ткани выделялась с использованием колонок «К-сорб» («Синтол», Россия) согласно протоколу изготовителя. Далее ДНК подвергалась бисульфитной конверсии с использованием набора Epijet (Thermo Scientific, США), в результате которой все неметилированные цитозины конвертировались в урацилы, а метилированные – не изменялись. После этого проводили полимеразную цепную реакцию (ПЦР) с праймерами к фрагменту островка метилирования генов-кандидатов, в результате которого урацилы заменялись на тимины. Отбор праймеров производили по критерию отсутствия динуклеотидов CpG. Уровень метилирования исследуемого фрагмента определяли с помощью анализа кривых плавления с высоким разрешением (methylation-specific high resolution melts, MSHRM) с использованием программного обеспечения Precision Melt Analysis Software, версия 3 (BioRad, США) [18]. Для количественной оценки метилирования использовали относительные единицы интенсивности флуоресценции (RFU) при температуре максимального расхождения кривых согласно методике, описанной ранее Красным А.М. и соавт. [19]. ПЦР и анализ кривых плавления с высоким разрешением проводили с использованием амплификатора CFX-96.

На основании данных литературы, с целью исследования уровня метилирования были отобраны гены с потенциальной ролью в патогенезе ЗРП – CDO1, MMP2, CEBPA, LEP, HLAG, VEGF, MEST, CDH1, GNA12, TLR2, BMP6, DAPK3, DFNA5, импринтинг-контролирующей области IGF2/H19.

Для статистического анализа и построения графиков использовали пакеты статистических программ Statistica 10 и OriginPro 8.5 (США). Для проверки гипотезы о нормальном распределении использовался критерий Шапиро–Уилка, для проверки равенства дисперсий – критерий Левина. Статистический анализ проводили с помощью параметрического t-критерия Стьюдента при соблюдении нормального распределения и непараметрического критерия Манна–Уитни – при несоблюдении условий нормального распределения. Сравнение групп по качественным признакам проводили с помощью точного критерия Фишера. Количественные данные представлены в виде медианы, верхней и нижней квартили Me (Q1;Q3). Различия между статистическими величинами считали статистически значимыми при уровне достоверности p<0,05.

Результаты и обсуждение

Между исследуемыми группами не были получены статистически значимые различия по возрасту и антропометрическим данным между исследуемыми группами беременных (p>0,05). Гестационный срок при родоразрешении в группе с ЗРП составил 35,4 (33,7; 37,5) недели, что было обусловлено наличием показаний для экстренного досрочного родоразрешения путем операции кесарева сечения (КС). Клинико-анамнестические данные представлены в таблице.

Изучение метилирования генов в плаценте показало, что относительный уровень метилирования гена толл-подобного рецептора 2 (TLR2) в группе ЗРП составил 0,26 (0,14;0,28), что было статистически ниже по сравнению с группой условно здоровых беременных (0,31 (0,26;0,34), р=0,01). Данные представлены на рис. 1.

Исследование уровня метилирования импринтинг-контролирующей области инсулиноподобного фактора роста 2 (IGF2) и H19 также показало статистически значимое снижение относительного уровня метилирования в плацентах с ЗРП (0,18 (0,06;0,21)) по сравнению с контрольной группой (0,33 (0,29;0,36), p<0,001). Данные представлены на рис. 2.

Как известно, TLR2 является мембранным белком из класса толл-подобных рецепторов, играющим ключевую роль во врожденном иммунитете, и обнаруживается в плаценте с ранних сроков беременности, увеличиваясь в присутствии инфекционных агентов [20, 21]. Кроме того, TLR2 участвует в регуляции апоптоза клеток цитотрофобласта с I триместра беременности путем усиления его активности [22–24]. Таким образом, снижение уровня метилирования гена TLR2 может приводить к усилению экспрессии TLR2 и, как следствие, повышенному апоптозу в плаценте, играющему важную роль в патогенезе ЗРП.

Также в плаценте наблюдается повышенная экспрессия импринтированных генов, которые важны для ее правильного развития [25–27]. В настоящее время большой интерес вызывает изучение импринтинг-контролирующей области генов IGF2 и H19 на хромосоме 11 отцовского происхождения в связи с данными о зависимости метилирования данной области с развитием ЗРП [28]. Метилирование данного региона определяет экспрессию импринтированных генов IGF2 и H19; в случае метилирования повышается экспрессия IGF2 [29]. В исследовании Koukoura O. и соавт. [30] также было продемонстрировано снижение метилирования данной области и повышение экспрессии гена H19 в плацентах при ЗРП. Большой интерес представляет изучение IGF2 в связи с его участием в регуляции процессов пролиферации, дифференцировки и транспорта питательных веществ в плаценте [31]. Xiao X. и соавт. провели исследование уровня метилирования IGF2 в плаценте путем бисульфитного пиросеквенирования и обнаружили его снижение при ЗРП [32]. В подобном исследовании St-Pierre J. и соавт. была обнаружена отрицательная корреляция между уровнем метилирования IGF2 и массой новорожденных [33]. Таким образом, полученные нами данные согласуются с мировыми и подтверждают роль IGF2 в формировании ЗРП.

Заключение

Анализ уровня метилирования исследованных генов показал статистически значимое снижение уровня метилирования гена TLR2 и импринтинг-контролирующей области IGF2/H19 в плацентах женщин с ЗРП. Полученные результаты указывают на роль метилирования гена TLR2 и импринтинг- контролирующей области IGF2/H19 в формировании задержки роста плода и перспективность дальнейшего изучения уровня метилирования данных генов в других биологических субстратах с целью внедрения новых методов диагностики.