Metabolomic profile in pregnant women with fetal growth restriction

Kan N.E., Khachatryan Z.V., Amiraslanov E.Yu., Chagovets V.V., Tyutyunnik V.L., Lomova N.A., Starodubtseva N.L., Kitsilovskaya N.A., Baranov I.I., Frankevich V.E.

Academician V.I. Kulakov National Medical Research Center of Obstetrics, Gynecology, and Perinatology, Ministry of Health of Russia, Moscow
Objective. To search for biomarkers of fetal growth restriction (FGR) based on a study of the metabolic profile of pregnant women. Subjects and methods. Plasma samples from 38 pregnant women were investigated during the study. The pregnant women were divided into two groups: 1) 17 pregnant women with FGR; 2) 21 women with physiological pregnancy. The samples were analyzed using liquid chromatography with mass spectrometric detection. Control of the analysis of experimental results and their processing were done applying Agilent MassHunter software. Results. The investigators identified 18 metabolites min with statistically significantly different levels. Correlation analysis established a significant relationship between the identified metabolites and clinical and anamnestic data. There was a moderate correlation of FGR with 3 amino acids: beta-alanine (rs = 0.413, p = 0.003), cysteine (rs = 0.588, p <0.001), and ornithine (rs = 0.427, p = 0.002). Conclusion. The findings substantiate the prospects of investigating beta-alanine, cysteine, and ornithine as diagnostic markers of FGR. The high correlation of these metabolites with Doppler readings determines the possibility of their inclusion in the integrated diagnosis of FGR.

Keywords

fetal growth restriction
metabolomics
amino acids

Задержка роста плода (ЗРП) остается одной из ведущих проблем современного акушерства [1]. Анализ эпидемиологических данных показывает, что, помимо высокой заболеваемости и смертности в перинатальном периоде, дети с ЗРП входят в группу риска по развитию сердечно-сосудистых и метаболических заболеваний при достижении ими зрелого возраста [2–4]. Несмотря на постоянное совершенствование протоколов диагностики и ведения ЗРП, доля маловесных к сроку гестации детей составила 22% в 2012 г., согласно данным Исследовательской группы по эпидемиологии детского здоровья [5]. В связи с чем поиск высокочувствительных и специфичных диагностических тестов не теряет актуальности. Изучение механизмов развития ЗРП является основополагающим фактором разработки эффективных методов профилактики и лечения данного осложнения.

В настоящий момент большой интерес представляют уточнение механизмов развития ЗРП, связанных с состоянием матери, и изучение метаболических изменений плода, которые носят компенсаторный характер и возникают в ответ на неблагоприятные внутриутробные факторы. Метаболомика как наука, включающая в себя количественное определение и идентификацию низкомолекулярных метаболитов, позволяет оценить состояние организма и выявить взаимосвязь между процессами, лежащими в основе формирования метаболических нарушений. Полученные знания в будущем могут помочь в разработке методов, направленных на коррекцию этих нарушений.

Целью исследования являлся поиск биомаркеров ЗРП на основании изучения метаболомного профиля беременных.

Материалы и методы

В исследование были включены 38 беременных, которые поступили и были родоразрешены в ФГБУ «НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова» Минздрава России: 1-ю группу (основную) составили 17 пациенток c подтвержденным диагнозом ЗРП; 2-ю группу (контрольную) – 21 соматически здоровая женщина с беременностью без осложнений. Диагноз ЗРП был подтвержден постнатально, согласно центильным таблицам ВОЗ для доношенных и таблицам Фентона (2013 г.) для недоношенных детей. Все пациентки подписали информированное согласие на участие в исследовании. Исследование было одобрено локальным этическим комитетом ФГБУ «НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова» Минздрава России. Критериями включения в исследование послужили: возраст беременных от 18 до 45 лет, одноплодная беременность на сроке от 22 до 40 недель. Критерии исключения: отсутствие резус- и AB0-изоиммунизации, хромосомных аномалий, генетических мутаций и врожденных пороков развития у плода, наличие у матери тяжелой экстрагенитальной патологии, миомы матки больших размеров, острых инфекционных заболеваний.

В работе использованы стандартный набор и масс-спектрометрический протокол компании JASEM (Турция) для пробоподготовки образцов плазмы и последующего анализа 43 аминокислот. Набор содержит две различные калибровочные смеси лиофилизированных аминокислот, смесь внутренних стандартов, лиофилизированную смесь для контроля качества анализа, подвижные фазы A и B, так называемый Реагент-1 (кат. № JSM-CL-503), используемый при пробоподготовке образцов плазмы, а также колонку для высокоэффективной жидкостной хроматографии аминокислот JASEM (кат. № JSM-CL-575).

Для приготовления образцов плазмы к исследованию к 50 мкл плазмы добавляли 50 мкл раствора смеси внутренних стандартов, перемешивали на вортексе в течение 5 с, добавляли 700 мкл Реагента-1, перемешивали повторно 15 с, центрифугировали 3 минуты со скоростью 3000 об./мин, после чего переносили надосадочную жидкость в виалу. Подготовку и хранение анализируемых образцов и вспомогательных растворов производили в соответствии с руководством JASEM.

Анализ образцов осуществляли с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (Agilent 1290 Infinity II) с масс-спектрометрическим детектированием(Agilent 6470 А). Транзитные переходы между родительскими ионами и дочерними фрагментами для мониторируемых аминокислот, соответствующие им хроматографические времена удержания, концентрации внутренних стандартов, а также сведения о чувствительности и воспроизводимости анализа приведены в руководстве JASEM.

Статистическую обработку полученных экспериментальных данных проводили с помощью скриптов, написанных на языке R (R Core Team (2018), Австрия) в RStudio (RStudio Team (2016), США) и программного обеспечения IBM SPSS Statistics 21. Для проверки гипотезы о нормальном распределении использовался критерий Шапиро–Уилка, для проверки равенства дисперсий – критерий Левина. При несоблюдении условий нормального распределения статистический анализ проводили с помощью непараметрических критериев Манна–Уитни и коэффициента ранговой корреляции по Спирмену. Сравнение групп по качественным признакам проводили с помощью точного критерия Фишера. Количественные данные представлены в виде медианы, верхней и нижней квартили – Me (Q1;Q3). Для оценки диагностической эффективности исследуемого метода использовали ROC-анализ. Данные ROC-анализа представлены в виде площади под кривой с 95% доверительным интервалом (ДИ). Для всех видов анализа статистически значимыми считали значения p<0,05.

Результаты и обсуждение

Пациентки, включенные в исследование, не имели значимых различий по возрасту, соматической и гинекологической заболеваемости (p>0,05). Гестационный срок при родоразрешении в группе с ЗРП составил 35,4 (33,7;37,5) недели, что было обусловлено наличием показаний для экстренного досрочного родоразрешения путем операции кесарева сечения (КС). Клинико-анамнестические данные представлены в табл. 1.

На следующем этапе работы был проведен количественный хромато-масс-спектрометрический анализ 43 аминокислот. Регистрировали хроматограммы ионного тока образцов сыворотки крови беременных двух групп исследования. Исходя из площадей соответствующих хроматографических пиков, был произведен расчет концентраций аминокислот. С помощью дальнейшего статистического анализа полученных данных было выявлено 18 метаболитов со статистически значимо различающимися значениями (рис. 1). К этим различающимся метаболитам относились аланин, аспарагин, аспартат, бета-аланин, карнозин, цистин, гамма-аминобутират, глутамин, глицин, гистидин, изолейцин, лизин, метионин, о-фосфорил-этаноламин, орнитин, фенилаланин, серин, триптофан. Концентрации аминокислот в группах исследования приведены в табл. 2.

На следующем этапе был проведен корреляционный анализ с выявлением зависимости между определяемыми метаболитами и клинико-анамнестическими данными. Умеренная корреляционная связь ЗРП была выявлена с 3 аминокислотами – бета-аланином (rs=0,413; р=0,003), цистином (rs=0,588;р<0,001) и орнитином (rs=0,427; р=0,002). Анализ данных метаболитов и показателей лабораторных и инструментальных методов исследования показал умеренную корреляционную связь цистина и орнитина с показателями маточно-плацентарного кровотока (rs=0,688; p<0,001 и rs=0,504; p<0,001 соответственно), высокую корреляционную связь цистина с показателями плодово-плацентарного кровотока (rs=0,688; p<0,001 для пупочной артерии и rs=0,779; p<0,001 для средней мозговой артерии) и умеренную корреляционную связь орнитина с показателями плодово-плацентарного кровотока (rs=0,512; p<0,001 для пупочной артерии и rs=0,479; p<0,001 для средней мозговой артерии).

Для определения значимости данных аминокислот в качестве диагностического теста при ЗРП был проведен ROC-анализ, который охарактеризовал полученную модель как хорошую и обосновал перспективность использования бета-аланина с AUC=0,75 (95% ДИ 0,62–0,89), чувствительностью 77%, специфичностью 68%; цистина с AUC=0,86 (95% ДИ 0,76–0,96), чувствительностью 62%, специфичностью 100% и орнитина с AUC=0,76 (95% ДИ 0,62–0,90), чувствительностью 77%, специфичностью 68% для выявления групп беременных с ЗРП (рис. 2).

Поскольку ЗРП сопровождается нарушением процессов обмена веществ как у матери, так и у плода, изучение метаболомного профиля беременных при данной патологии представляет большой интерес в связи с перспективностью выявления потенциальных прогностических маркеров. В последних работах исследователи подчеркивают неоспоримую роль аминокислот, липидов и других метаболитов в патогенезе ЗРП. Так, Dessi и соавт. сравнили метаболомные профили мочи здоровых детей и детей с ЗРП и получили данные о повышении уровня мио-инозитола, саркозина, креатина и креатинина в группе ЗРП [6, 7]. Barberini и соавт. исследовали показатели метаболитов мочи у детей с малыми и крупными размерами к сроку гестации по сравнению с нормовесными детьми и также установили повышение уровня мио-инозитола в группе маловесных и крупновесных детей [8]. Известно, что мио-инозитол участвует в поддержании клеточного роста, развитии периферических нервов и метаболизме [9, 10]. Кроме того, он играет важную роль в повышении чувствительности к инсулину и регуляции жирового обмена [11, 12]. L. Maitre и соавт. [13] при анализе метаболомного профиля мочи беременных с целью поиска новых прогностических маркеров ЗРП обнаружили снижение уровня тирозина, ацетата, триметиламина и формиата в группе ЗРП. При этом данные метаболиты находились в обратной корреляции с уровнем инсулина в крови беременных, что, возможно, связано с их ролью в углеводном и жировом обмене. В то же время в других исследованиях была показана значимость триптофана, глутамата и фенилаланина как наиболее высокочувствительных и специфичных метаболитов в диагностике ЗРП [14]. Однако, согласно исследованию Sanz-Cortés M. и соавт., в котором проводился анализ аминокислотного состава пуповинной крови новорожденных с ЗРП, статически значимые результаты метаболитов были получены только в группе с поздней формой ЗРП [15]. Так, было отмечено снижение холина и значительное повышение уровня ненасыщенных жирных кислот, глютамина и креатина в группе с ЗРП. Интересные данные были получены позднее у J. Liu и соавт., которые показали снижение уровня гомоцистеина, метионина, тирозина, аланина, орнитина и серина в крови новорожденных с ЗРП [16]. S. Visentin [17] и соавт. были обнаружены более низкие уровни каприновой и лауриновой кислот как у новорожденных с подтвержденным диагнозом ЗРП, так и у их матерей. Известно, что при физиологически протекающей беременности данные кислоты используются плодом в качестве дополнительного источника энергии посредством кетогенеза [18], что позволяет предположить, что при ЗРП возникают усиленный перенос и утилизация данных кислот в связи с развитием метаболических нарушений у плода [19].

Таким образом, анализ литературы указывает на трудности выделения определенного метаболита, связанного с ЗРП, который можно было бы предложить в качестве потенциального маркера, в связи с чем все большее значение отводится определению метаболомного профиля. В проведенной работе удалось из метаболомного профиля выделить три метаболита, которые были ассоциированы с ЗРП, что обосновывает перспективность их определения для прогнозирования и диагностики данного осложнения беременности.

Заключение

Выявленные корреляционные связи данных метаболитов с показателями допплерометрии определяют возможность их комплексного применения в сочетании с тестами функциональной диагностики в клинической практике на антенатальном этапе для повышения их прогностической значимости.

References

  1. Вишнякова П.А., Суханова Ю.А., Микаелян А.Г., Булатова Ю.С., Пятаева С.В., Балашов И.С., Боровиков П.И., Тетруашвили Н.К., Высоких М.Ю. Синдром задержки роста плода и маркеры митохондриальной дисфункции. Акушерство и гинекология. 2018; 6: 31–6. [Vishnyakova P.A., Sukhanova Yu.A., Mikaelyan A.G., Bulatova Yu.S., Pyataeva S.V., Balashov I.S., Borovikov P.I., Tetruashvili N.K., Vyssokikh M.Yu. Fetal growth restriction and markers for mitochondrial dysfunction. Akusherstvo i Ginekologiya/Obstetrics and Gynecology. 2018; (6): 31–6. (in Russian)]. doi:10.18565/aig.2018.6.31-36
  2. Unterscheider J., Daly S., Geary M.P., Kennelly M.M., McAuliffe F.M., O’Donoghue K., et al. Optimizing the definition of intrauterine growth restriction: the multicenter prospective PORTO Study. Am J Obstet Gynecol. 2013; 208(4): 290.e1-6. doi: 10.1016/j.ajog.2013.02.007
  3. Cruz-Lemini M., Crispi F., Van Mieghem T., Pedraza D., Cruz-Martínez R., Acosta-Rojas R., et al. Risk of perinatal death in early-onset intrauterine growth restriction according to gestational age and cardiovascular Doppler indices: a multicenter study. Fetal Diagn Ther. 2012; 32(1–2): 116–22. doi: 10.1159/000333001.
  4. Balasuriya C.N.D., Stunes A.K., Mosti M.P., Schei B., Indredavik M.S., Hals I.K., et al. Metabolic outcomes in adults born preterm with very low birth weight or small for gestational age at term: a cohort study. J Clin Endocrinol Metab. 2018;103(12): 4437–46. doi: 10.1210/jc.2018-00464
  5. Lee A.C., Kozuki N., Cousens S., Stevens G.A., Blencowe H., Silveira M.F., et al. Estimates of burden and consequences of infants born small for gestational age in low and middle income countries with INTERGROWTH-21st standard: analysis of CHERG datasets. BMJ. 2017; 358:j3677. doi: 10.1136/bmj.j3677
  6. Dessì A., Atzori L., Noto A., Visser G.H., Gazzolo D., Zanardo V., et al. Metabolomics in newborns with intrauterine growth retardation (IUGR): urine reveals markers of metabolic syndrome. J Matern Fetal Neonatal Med. 2011; 24 Suppl 2: 35–9. doi: 10.3109/14767058.2011.605868
  7. Dessì A., Marincola F.C., Pattumelli M.G., Ciccarelli S., Corbu S., Ossicini C., et al. Investigation of the 1H-NMR based urine metabolomic profiles of IUGR, LGA and AGA newborns on the first day of life. J Matern Fetal Neonatal Med. 2014; 27 Suppl 2: 13–9. doi: 10.3109/14767058.2014.955674
  8. Barberini L., Noto A., Fattuoni C., Grapov D., Casanova A., Fenu G., et al. Urinary metabolomics (GCMS) reveals that low and high birth weight infants share elevated inositol concentrations at birth. J Matern Fetal Neonatal Med. 2014; 27 Suppl 2: 20–6. doi: 10.3109/14767058.2014.954786
  9. Metzger B.E., Lowe L.P., Dyer A.R., Trimble E.R., Chaovarindr U., et al. HAPO Study Cooperative Research Group. Hyperglycemia and adverse pregnancy outcomes. N Engl J Med. 2008; 358(19): 1991–2002. doi: 10.1056/NEJMoa0707943
  10. Chau J.F., Lee M.K., Law J.W., Chung S.K., Chung S.S. Sodium/myo-inositol cotransporter-1 is essential for the development and function of the peripheral nerves. FASEB J. 2005; 19(13): 1887–9. doi: 10.1096/fj.05-4192fje
  11. Unfer V., Carlomagno G., Dante G., Facchinetti F. Effects of myo-inositl in women with PCOs: a systematic review of randomized controlled trials. Gynecol Endocrinol. 2012; 28(7): 509–15. doi: 10.3109/09513590.2011.650660
  12. Santamaria A., Giordano D., Corrado F., Pintaudi B., Interdonato M.L., Vieste G.D., et al. One-year effects of myo-inositol supplementation in post-menopausal women with metabolic syndrome. Climacteric. 2012; 15(5): 490–5. doi: 10.3109/13697137.2011.631063
  13. Maitre L., Fthenou E., Athersuch T., Coen M., Toledano M.B., Holmes E., et al. Urinary metabolic profiles in early pregnancy are associated with preterm birth and fetal growth restriction in the Rhea mother-child cohort study. BMC Med. 2014;12:110. doi: 10.1186/1741-7015-12-110
  14. Favretto D., Cosmi E., Ragazzi E., Visentin S., Tucci M., Fais P., et al. Cord blood metabolomics profiling in intrauterine growth restriction. Anal Bioanal Chem. 2012; 402(3): 1109–21. doi: 10.1007/s00216-011-5540-z
  15. Sanz-Cortés M., Carbajo R.J., Crispi F., Figueras F., Pineda-Lucena A., Gratacós E. Metabolomic profile of umbilical cord blood plasma from early and late intrauterine growth restricted (IUGR) neonates with and without signs of brain vasodilation. PLoS One. 2013; 8(12): e80121. doi: 10.1371/journal.pone.0080121
  16. Liu J., Chen X.X., Li X.W., Fu W., Zhang W.Q. Metabolomic research on newborn infants with intrauterine growth restriction. Medicine (Baltimore) 2016; 95(17): e3564 doi: 10.1097/MD.0000000000003564
  17. Visentin S., Crotti S., Donazzolo E., D’Aronco S., Nitti D., Cosmi E., et al. Medium chain fatty acids in intrauterine growth restricted and small for gestational age pregnancies. Metabolomics. 2017;13(05):1–9
  18. Lindsay K.L., Hellmuth C., Uhl O., Buss C., Wadhwa P.D., Koletzko B., et al. Longitudinal metabolomics profiling of amino acids and lipids across healthy pregnancy. PLoS One. 2015; 10(12): e0145794. doi: 10.1371/journal.pone.0145794
  19. Leite D., Cecatti J. New Approaches to Fetal Growth Restriction: The Time for Metabolomics Has Come. Rev Bras Ginecol Obstet. 2019; 41(7): 454–62. doi: 10.1055/s-0039-1692126

Received 01.10.2019

Accepted 04.10.2019

About the Authors

Natalia E. Kan, PhD, MD, professor of the National Medical Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology named after Academician V.I.Kulakov of Ministry of Healthcare of Russian Federation (117997, Moscow, Ac. Oparina, 4 str.). Tel.: +7(926)2208655. E-mail: kan-med@mail.ru
Zarine V. Khachatryan, PhD student of the National Medical Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology named after Academician V.I.Kulakov of Ministry of Healthcare of Russian Federation (117997, Moscow, Ac. Oparina, 4 str.). Tel.: +7(909)6562456. E-mail: z.v.khachatryan@gmail.com
Elrad Yu. Amiraslanov, PhD, the head of the obstetric department of National Medical Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology named after Academician V.I.Kulakov of Ministry of Healthcare of Russian Federation (117997, Moscow, Ac. Oparina, 4 str.). Tel.:+7(916)549-20-94. E-mail: e_amiraslanov@oparina4.ru
Vitaliy V. Chagovets, PhD, Senior Researcher of Laboratory of Proteomics and Metabolomics of Human Reproduction of the National Medical Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology named after Academician V.I. Kulakov of Ministry of Healthcare of Russian Federation (117997, Moscow, Ac. Oparina, 4 str.).
Tel.: +7(916)9191466. E-mail: vvchagovets@gmail.com
Victor L. Tyutyunnik, PhD, MD, professor of the National Medical Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology named after Academician V.I.Kulakov of Ministry of Healthcare of Russian Federation (117997, Moscow, Ac. Oparina, 4 str.). Tel.: +7(903)9695041. E-mail: tioutiounnik@mail.ru.
Natalia A. Lomova, PhD, Researcher of the Institute of Obstetrics of the National Medical Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology named after Academician V.I. Kulakov of Ministry of Healthcare of Russian Federation (117997, Moscow, Ac. Oparina, 4 str.). Tel.: +7(916)1442162. E-mail: natasha-lomova@yandex.ru
Nataliia L. Starodubtseva, PhD, Head of Laboratory of Proteomics of Human Reproduction, National Medical Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology named after Academician V.I. Kulakov of Ministry of Healthcare of Russian Federation (117997, Moscow, Ac. Oparina, 4 str.). Tel.: +7(916)4639867. e-mail: n_starodubtseva@oparina4.ru
Natalia A. Kitsilovskaya, specialist of the Laboratory of Proteomics and Metabolomics in Human Reproduction, Department of Systems Biology in Reproduction of the National Medical Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology named after Academician V.I. Kulakov of Ministry of Healthcare of Russian Federation (117997, Moscow, Ac. Oparina, 4 str.). Tel. +7(903)5657139 E-mail: kitsilovskyana@gmail.com
Igor I. Baranov, MD, professor, head of the Organizational and Methodological Department of the of the National Medical Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology named after Academician V.I. Kulakov of Ministry of Healthcare of Russian Federation (117997, Moscow, Ac. Oparina, 4 str.). Tel.: +7(495)4389492. E-mail: i_baranov@oparina4.ru
Vladimir E. Frankevich, PhD, Head of Department of Systems Biology in Reproduction of the National Medical Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology named after Academician V.I. Kulakov of Ministry of Healthcare of Russian Federation (117997, Moscow, Ac. Oparina, 4 str.). Tel.: +7(495)4380788, ext. 2198.
E-mail: v_frankevich@oparina4.ru.

For citation: Kan N.E., Khachatryan Z.V., Amiraslanov E.Yu., Chagovets V.V., Tyutyunnik V.L., Lomova N.A., Starodubtseva N.L., Kitsilovskaya N.A., Baranov I.I., Frankevich V.E. Metabolomic profile in pregnant women with fetal growth restriction.
Akusherstvo i Ginekologiya /Obstetrics and Gynecology. 2019; (12):59-65.(in Russian)
http://dx.doi.org/10.18565/aig.2019.12.59-65

Similar Articles

By continuing to use our site, you consent to the processing of cookies that ensure the proper functioning of the site.