Трудности ранней диагностики и высокие метастатический и инвазивный потенциалы рака яичников определяют необходимость углубленного изучения механизмов распространения этой опухоли, знание которых могло бы стать основой для создания новых препаратов, целенаправленно подавляющих процессы метастазирования и инвазии. Известно, что одним из основных механизмов инвазии злокачественных опухолей является разрушение окружающей базальной мембраны и внеклеточного матрикса (ВКМ) ассоциированными с опухолью протеиназами, играющими также важную роль в процессах метастазирования и неоангиогенеза [9]. В опухолевой инвазии задействовано несколько классов протеиназ, к важнейшим из которых следует отнести семейство матриксных металлопротеиназ (ММП), названных так за свою способность специфически гидролизовать все основные белки ВКМ, в первую очередь, коллаген [5].
Важнейшими представителями семейства ММП являются желатиназы A и B, специфические коллагеназы коллагена IV типа (ММП-2 и -9), а также матрилизин – ММП-7, имеющий широкую субстратную специфичность и помимо коллагена IV гидролизующий также эластин, протеогликаны, фибронектин и др. Матрилизин участвует также в активации предшественников ММП-2 и -9 [13]. Публикации последнего десятилетия свидетельствуют о том, что именно эти ММП являются перспективными маркерами для дифференциальной диагностики различных новообразований яичников и прогноза рака яичников [4, 7, 8, 10–12].
Активность ММП в межклеточном пространстве специфически подавляется четырьмя тканевыми ингибиторами (ТИМП). В последнее время появляются данные, свидетельствующие о том, что ТИМП играют также важную самостоятельную роль в регуляции роста и дифференцировки опухолевых и нормальных клеток и обладают антиангиогенными свойствами [2]. Среди тканевых ингибиторов наиболее значимым маркером рака яичников, по данным литературы, является ТИМП-1 [6].
Цель данного исследования: используя количественные иммуноферментные тесты, провести сравнительную оценку содержания ММП-2, ММП-7 и ММП-9, а также их тканевых ингибиторов 1 и 2 типов в опухолях и сыворотке крови больных раком, доброкачественными и пограничными новообразованиями яичников и проанализировать взаимосвязь этих показателей с основными клинико-морфологическими особенностями рака яичников.
Материал и методы исследования
Обследованы 84 больные первичными опухолями яичников: 49 – злокачественными, 11 – пограничными и 24 – доброкачественными. В контрольную группу вошли 30 практически здоровых женщин.
Из 49 больных злокачественными опухолями яичников у 43 выявлен серозный рак яичников, у 3 – муцинозный и у 3 – эндометриоидный. Среди 24 доброкачественных новообразований яичников в 19 наблюдениях обнаружены серозные опухоли.
Содержание исследуемых белков определяли в сыворотке крови и лизатах опухолей [1] с помощью стандартных наборов для иммуноферментного анализа: «Human/Mouse/Rat MMP-2 (total)», «Human MMP-7 (total)», «Human MMP-9 (total)», «Human TIMP-1» и «Human TIMP-2» (Quantikine, R&D Systems, США). Концентрацию исследованных показателей в сыворотке крови выражали в нанограммах в 1 мл (нг/мл), в тканях – в нанограммах на 1 мг общего белка (нг/мг белка).
Данные обрабатывали с помощью программы «Statistica 7.0». При сравнении показателей и анализе их взаимосвязей использовали непараметрические методы: критерии Манна-Уитни и Kruskel-Wallis,тест корреляции рангов Спирмена (R). Различия и корреляции считали достоверными при p<0,05.
Результаты исследования и обсуждение
На первом этапе статистического анализа полученных данных мы сопоставили содержание исследованных ММП и ТИМП в доброкачественных, пограничных и злокачественных опухолях яичников (табл. 1).
Таблица 1. Содержание ММП и ТИМП в ткани доброкачественных, пограничных и злокачественных опухолей яичников.
Выявлено достоверное увеличение уровня ММП-7 в ткани рака яичников по сравнению с оброкачественными и пограничными опухолями, что косвенно подтверждает участие матрилизина в формировании инвазивного потенциала рака яичников. Аналогичная тенденция продемонстрирована и для ММП-9, однако для этой протеазы различия не достигли статистической значимости.
В то же время для ММП-2 обнаружена противоположная закономерность – ее уровень в доброкачественных опухолях оказался достоверно более высоким, чем в пограничных и злокачественных. Такая особенность ММП-2 согласуется с экспериментальными данными о снижении
ее экспрессии в клетках рака по сравнению с нетуморогенными клетками поверхностного эпителия яичников [3, 7]. По-разному менялась при переходе от доброкачественных опухолей яичников к злокачественным и экспрессия двух типов ТИМП: уровень ТИМП-2 в ткани рака был достоверно снижен, а уровень ТИМП-1 был сходным в доброкачественных и злокачественных опухолях, но существенно повышен в пограничных новообразованиях.
Анализ взаимосвязи концентраций исследованных маркеров в ткани рака яичников с основными клинико-морфологическими факторами прогноза показал, что достоверных различий уровней различных ММП в зависимости от стадии рака яичников по классификации FIGO не наблюдается, однако уровни ММП-9 в опухолях больных I–II стадий оказались значительно выше, чем в опухолях больных III–IV стадий. В то же время уровень ТИМП-1 в опухолях при III–IV стадиях был достоверно снижен по сравнению с I–II стадиями (табл. 2).
Табица 2. Содержание ММП-2, ММП-7, ММП-9, ТИМП-1 и ТИМП-2 в опухолях больных раком яичников
в зависимости от показателей распространенности опухоли.
При учете отдельных показателей распространенности рака яичников оказалось, что внутриопухолевое содержание ММП-2 и ММП-7 достоверно выше при двустороннем поражении яичников, чем при одностороннем. Уровень ММП-7 был также достоверно выше в опухолях с просовидными очагами в брюшине, чем в опухолях с более крупными очагами.
Таким образом, однозначной связи, свидетельствующей об увеличении уровня ММП в ткани рака яичников по мере распространения опухолевого процесса, выявить не удалось. В ряде случаев наблюдалось даже снижение уровня некоторых ММП при наиболее распространенном процессе. В связи с этим можно предположить, что продукция ММП в бóльшей степени необходима опухолям на начальных или промежуточных стадиях развития, а при распространенном процессе потребность в протеолитической деградации ВКМ снижается.
Одной из важных задач было выяснение вопроса о том, в какой мере изменение продукции ММП и ТИМП в опухолевой ткани отражается на их концентрации в периферической крови. Проанализировав корреляционные взаимосвязи тканевого и сывороточного уровней исследуемых маркеров, мы выявили в общей группе обследованных больных не сильные, но достоверные положительные корреляции уровней всех трех ММП в сыворотке крови и в опухолевой ткани (для ММП-2 R=0,31, p=0,020; для
ММП-7 R=0,29, p=0,006; для ММП-9 R=0,24, p=0,019), усиливавшиеся для ММП-7 и ММП-9 в группе больных раком (R=0,35; p=0,022 и R=0,36; p=0,020 соответственно) и не проявлявшиеся у больных доброкачественными и пограничными новообразованиями яичников.
Другим важным аспектом изучения уровня биологических маркеров в сыворотке крови является возможность их использования для дифференциальной диагностики и/или мониторинга эффекта лечения. Продемонстрировано достоверное увеличение содержания ММП-7 и ММП-9 в сыворотке крови больных раком яичников по сравнению с контролем и пациентками с доброкачественными и пограничными новообразованиями (табл. 3).
Таблица 3. Содержание ММП и ТИМП в сыворотке крови больных доброкачественными,
пограничными и злокачественными опухолями яичников.
В то же время, содержание ММП-2 в сыворотке крови больных раком и пограничными опухолями яичников было достоверно ниже, чем в контроле, а у больных доброкачественными новообразованиями яичников достоверно не отличалось от показателей контрольной группы. Это соотношение соответствует закономерностям, выявленным для опухолевых тканей. Содержание ТИМП-1 в сыворотке крови больных раком яичников достоверно выше, чем у пациенток всех других групп, а самый низкий уровень ТИМП-1 выявлен в сыворотке крови больных пограничными опухолями
яичников (табл. 3).
В целом анализ содержания ММП и ТИМП в сыворотке крови показал, что наиболее перспективным маркером для дифференциальной диагностики пограничных, доброкачественных и злокачественных новообразований яичников является ММП-7. Уровень этой ММП повышен относительно контроля только у больных раком яичников. Превышение верхней границы нормы (95% показателей контрольной группы – менее 4,67 нг/мл) отмечено у 38 из 49 первичных больных раком, т.е. чувствительность относительно контроля при 95%-ной специфичности составляет 78%. Чувствительность этого теста относительно доброкачественных и пограничных новообразований составляет соответственно 37,5 и 64%. ММП-7 оказалась и самым значимым маркером при анализе взаимосвязи показателей сыворотки крови с клинико-морфологическими особенностями рака яичников (табл. 4). Ее уровень достоверно положительно коррелировал с ключевыми показателями распространенности рака яичников: стадией заболевания в целом, размером первичной опухоли, по данным ультразвукового исследования, наличием и характером диссеминации по брюшине и метастазов в большом сальнике, наличием и количеством асцита. Уровень ММП-7 в сыворотке крови коррелировал также и с ее концентрацией в асцитической жидкости (R=0,53; p=0,008). Кроме того, только уровень ММП-7 был положительно ассоциирован с показателями классического сывороточного маркера рака яичников – СА-125 (R=0,32; p=0,003).
Таблица 4 (1). Содержание ММП-2, ММП-7, ММП-9, ТИМП-1 и ТИМП-2 в сыворотке крови больных раком
яичников в зависимости от показателей распространенности опухоли.
Заключение
Иммуноферментное исследование содержания нескольких ММП и их тканевых ингибиторов в опухолевой ткани, сыворотке крови и асцитической жидкости больных раком, пограничными и
доброкачественными новообразованиями яичников показало координированное увеличение тканевой экспрессии и сывороточной концентрации ММП-7 при раке яичников, нарастающее по мере распространения заболевания. Противоположная направленность изменений обнаружена для ММП-2. В меньшей степени выражены изменения в показателях содержания ММП-9 и ТИМП 1 и 2 типов.
Наиболее перспективным серологическим маркером рака яичников следует признать ММП-7.
