Работа частично поддержана Государственным контрактом Министерства образования и науки РФ № 16.522.12.2009 от 29.09.2011.
На сегодняшний день задержка развития плода (ЗРП), осложняющая течение беременности, остается одной из ведущих проблем акушерства, приводя к увеличению таких грозных осложнений, как анте- и интранатальная гибель плода, младенческая заболеваемость и смертность, а также к неблагоприятным отдаленным последствиям для ребенка. Проблема же врожденной инфекции (ВИ) у новорожденных с задержкой внутриутробного развития мало изучена, хотя именно при данном сочетании прогноз для ребенка является наиболее неблагоприятным.
Исследование генов, контролирующих активность цитокинов, являющихся медиаторами воспаления, – одна из важных задач в раскрытии патогенетических звеньев инициации и течения ВИ. Цитокины определяют функциональную кооперацию клеток при реализации реакции воспаления; при этом кооперация клеток может быть как позитивная, так и негативная. Негативное действие на функции нейтрофилов оказывают такие противовоспалительные цитокины, как IL-10, супрессирующий продукцию практически всех провоспалительных цитокинов. IL-10 подавляет транскрипцию генов цитокинов воспаления в нейтрофилах. По данным литературы, аллель A полиморфизма гена IL-10: 592 C>A ассоциирована с повышенным уровнем спонтанной и стимулированной продукции IL-10 мононуклеарами крови, что приводит к снижению интенсивности воспалительной реакции и переключению Th1>Th2 ответа [1]. Ряд авторов указывает на взаимосвязь повышенной частоты аллеля IL-10 -592 А с тяжестью сепсиса, развитием полиорганной недостаточности и высокой вероятностью летального исхода, что подтверждает важный вклад аллельного полиморфизма генов цитокинов в индивидуальные различия больных сепсисом по характеру течения инфекционного процесса и эффективности механизмов протективного иммунитета [2–4].
Изучение роли генного полиморфизма в развитии ВИ может привести к лучшему пониманию патогенеза и разработке эффективных методов профилактики и лечения таких больных.
Цель настоящего исследования – изучение роли полиморфизма генов цитокинов в реализации ВИ у беременных с ЗРП и их новорожденных детей.
Материал и методы исследования
Проведено проспективное обследование 210 пар мать-новорожденный, выполненное в акушерском обсервационном отделении ФГБУ НЦАГиП им. академика В.И. Кулакова Минздрава России.
Критерии включения: плацентарная недостаточность (ПН), установленная по данным клинического обследования, результатам функциональных методов исследования (нарушение фетоплацентарного кровотока и/или кровотока в венозном протоке и/или усиление кровотока в среднемозговой артерии по данным допплерометрии), ЗРП по данным ультразвукового исследования.
Критерии исключения: многоплодная беременность, тяжелая экстрагенитальная патология, пороки развития плода.
Все пациентки были разделены на две группы. В I группу были включены 90 пациенток с ПН, во II – 120 пациенток без ПН. Всем беременным, включенным в исследование, был выполнен стандартный набор обследований и исследованы цельная и пуповинная кровь. Все пациентки были ознакомлены с целью и методами, и было получено письменное информированное согласие на их включение в научное исследование. После родоразрешения, в зависимости от исхода беременности, пациентки I и II групп были разделены на подгруппы. В подгруппы 1А (n=54, ВИ с ПН) и 2А (n=36, ВИ без ПН) вошли пациентки с ВИ у новорожденных, развившейся в раннем неонатальном периоде и подтвержденной при клинико-лабораторном обследовании. В подгруппы 1Б (n=36, ПН без ВУИ) и 2Б (n=84, без ПН и без ВИ) – без реализации ВИ у новорожденного.
К легкой форме ВИ относили гнойный конъюктивит, везикулопустулез, к тяжелой – пневмонию, сепсис.
Выполнено определение следующих полиморфных локусов генов цитокинов у матерей и их новорожденных детей: CD14-260 (-159) C>T, IL-6 174 C>G,ESR1 PvuII -397 T>C, IL-8-251 A>T, ESR1 XbaI, TGFB -509 C>T, IL-10 -592 A/C, TLR9 -1486 T>C, IL1A -889 C>T, VEGFA -2578 A-C, IL1B-31 T>C, VEGFA -634 G-C, IL1R1390 T>C (Ser130Ser) [11100 msp1], VEGFA 936 C>T, IL1B 3953 (3954) C>T, IL1R1 -15858 C>T [Pst1 1970], TNF -308 G>A, TNF -238 G>A, IL4 -590 C>T, IL-4 -33 C>T, IL4R 1902 A>G (Gln576Arg), IL6R1510 (1073) A>C (Asp358Ala) (обозначение в базе данных dbSNP национального центра биотехнологической информации США (National Center for Biotechnological Information, NCBI)). Определение замен одиночных нуклеотидов проводили модифицированным методом «примыкающих проб» (adjacent probes, kissing probes), используя оригинальные олигонуклеотиды. Полимеразную цепную реакцию и определение температуры плавления олигонуклеотидных проб проводили с помощью детектирующего амплификатора ДТ-96 (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия).
Статистическую обработку полученных результатов проводили на персональном компьютере при помощи программного пакета SPSS Statistics 17.0 for Windows. Для определения статистической значимости различий применяли точный двухсторонний критерий Фишера и U-тест Манна–Уитни для несвязанных совокупностей. Отношение шансов (OR) приводили с 95% доверительным интервалом (CI).
Результаты исследования
В настоящее время принято выделять большое число факторов риска развития ПН и ВИ на основании общего клинического обследования: возраст матери – до 17 и старше 35 лет, вредные привычки (курение, алкоголь, наркотики), неблагоприятные социально-бытовые условия, повреждающее воздействие физических или химических факторов на ранних сроках гестационного периода, наличие очагов латентной инфекции, экстрагенитальная патология, отягощенный акушерского-гинекологический анамнез и осложнения настоящей беременности [5, 6], в связи с чем был проведен углубленный анализ общей клинической характеристики обследованных беременных.
Возраст беременных, включенных в исследование, колебался от 18 до 41 года и составил в среднем 31,4±0,5 и 28,4±0,5 года соответственно по группам. В I группе отмечалось большее количество пациенток старше 36 лет (26,5%), тогда как пациенток от 18 до 23 лет всего 6,1% (р<0,05).
При изучении анамнеза были выявлены различия в частоте перенесенных инфекционных заболеваний в детстве: в I группе достоверно чаще отмечались краснуха (50,0%) и ангина (48,0%) (р<0,05).
У пациенток основной группы имело место достоверное увеличение частоты хронических заболеваний ЛОР-органов – 40,0% (р<0,05); хронического пиелонефрита (20,0%) (р<0,05) и хронического цистита (26,0%) (р<0,05); хронической артериальной гипертензии (10,0%) (р<0,05).
В структуре гинекологической заболеваемости было отмечено достоверное увеличение в I группе хронического эндометрита (18,0%), хронического сальпингоофорита (20,0%), доброкачественных новообразований яичников (12%), бесплодия (16%) и цервицита (54%) (p<0,05).
Анализ исходной инфекционно-воспалительной заболеваемости с определением спектра возможных возбудителей показал, что в I группе достоверно чаще встречались вирус простого герпеса I и II типов (40,0%), уреаплазма (34,0%), Candida Albicans (38,0%) (p<0,05).
Так как большинство пациенток, включенных в исследование, были повторнородящими, нами был проведен анализ акушерского анамнеза. В основной группе достоверно чаще встречались самопроизвольные выкидыши (18,0%), бесплодие (16,0%) и интранатальная гибель плода (6,0%) (p<0,05). Также у пациенток I группы в 20,0% отмечалась неразвивающаяся беременность в анамнезе, хотя достоверных отличий не было. Только у пациенток I группы в анамнезе отмечали преждевременную отслойку нормально расположенной плаценты (2,0%).
Сравнительный анализ исходной клинической характеристики исследуемых подгрупп показал, что в структуре экстрагенитальной патологии у пациенток 1Б подгруппы достоверно чаще отмечались заболевания ЛОР-органов, в то время как у пациенток с ПН и реализацией ВИ у новорожденных чаще выявлялся хронический пиелонефрит, цистит (p<0,05) и аутоиммунный тиреоидит (p>0,05).
Анализ данных акушерско-гинекологического анамнеза выявил более частые случаи позднего наступления менархе. При анализе исходной инфекционно-воспалительной заболеваемости с определением спектра возможных возбудителей установлено, что в 1А и 1Б подгруппах достоверно чаще, по сравнению с контрольной 2Б подгруппой, встречались хроническая герпетическая инфекция (46,2 и 33,3%), кандидозный вульвовагинит (42,3 и 33,3%) (p<0,05). Уреаплазменная инфекция достоверно чаще встречалась только в I группе (38,5%) (p<0,05). В 1А и 1Б подгруппах достоверно чаще встречался хронический эндометрит (23,0 и 13,9%) (p<0,05), в 1А подгруппе – доброкачественные новообразования яичников (16,1%) и эндометриоз (8,1%) (p<0,05), в 1Б подгруппе – хронический сальпингоофорит (25,0%) (p<0,05).
Поскольку большинство пациенток, включенных в исследование, были повторнородящими, у нас была возможность провести анализ акушерского анамнеза. В 1А подгруппе достоверно чаще встречались самопроизвольные выкидыши (19,2%) и бесплодие (26,9%) (p<0,05), в 1Б подгруппе – интранатальная гибель плода (8,3%), прерывание беременности до 12 недель (33,3%) (p<0,05).
Анализ течения настоящей беременности в первом триместре у пациенток основной группы (I группы) установил наличие достоверно более частых осложнений: угроза прерывания беременности (76,0%), ретрохориальная гематома (12,0%) (p<0,05). Изучение инфекционно-воспалительных заболеваний и спектра возможных возбудителей показало преобладание у пациенток I группы кандидозного вульвовагинита (14,3%), обострения хронической герпетической инфекции (8,0%), ОРВИ (26%) (р<0,05). Во II триместре у пациенток I группы отмечалось формирование истмико-цервикальной недостаточности в 14,3% случаев, потребовавшей проведения хирургической коррекции, угроза прерывания беременности (78,5%) и анемия беременных (38,0%) (p<0,05). Из особенностей течения III триместра беременности следует отметить преобладание в I группе анемии беременных– 36,0%, бессимптомной бактериурии в 6,0% случаев, патологии околоплодных вод в виде многоводия (16,3%), неспецифического вульвовагинита (20,0%), обострения хронической герпетической инфекции (8,2%) (р<0,05). В 10% случаев у пациенток I группы отмечалось преждевременное излитие околоплодных вод.
В I группе 68,0% пациенток были родоразрешены путем операции кесарева сечения, из них по экстренным показаниям 38,0% (р<0,05). Более чем в половине случаев операция была выполнена в связи с ухудшением состояния плода и нарастанием тяжести хронической гипоксии плода. В I группе средний гестационный срок, на котором пациентка была родоразрешена, составил 35 недель, тогда как во II группе (контроль) – 39 недель.
Послеродовой период у пациенток I группы в 16% случаев протекал с осложнениями: в 4,0% диагностировали эндометрит, в 12,0% субинволюцию матки (p<0,05).
Сравнительный анализ акушерских исходов в подгруппах 1А и 1Б показал, что обострение инфекции имелось при ПН с дальнейшей реализацией ВИ у новорожденных и без такового. Это подтверждает воспалительный характер развития ПН. В то же время только у пациенток I группы (ВИ) отмечались такие проявления, как неспецифический вульвовагинит, истмико-цервикальная недостаточность и многоводие, которые, по-видимому, являются факторами риска ВИ в большей степени, чем ПН. По данным F. Moscuzza и соавт. (2011) ПН, осложняющая беременность, напрямую влияет на прогноз для новорожденного. Во время беременности ПН может служить критерием для ранней диагностики хронической гипоксии плода и подробного мониторинга течения беременности. Ранняя диагностика ПН очень важна для прогнозирования риска развития таких серьезных осложнений для новорожденного, как ретинопатия новорожденных и внутрижелудочковые кровотечения [7].
В 1А подгруппе 61,5% пациенток были родоразрешены путем операции кесарева сечения, из них по экстренным показаниям 38,5% (р<0,05), причем более чем в половине случаев – в связи с ухудшением состояния плода и нарастанием тяжести хронической гипоксии плода. В 1Б подгруппе 75% пациенток были родоразрешены путем операции кесарева сечения, из них по экстренным показаниям 37,5% (р<0,05). При этом у 12,5% пациенток 1Б подгруппы отмечалось преждевременное излитие околоплодных вод (р<0,05). В 1А подгруппе средний гестационный срок, на котором пациентка была родоразрешена, составил 33,6 недели, в 1Б подгруппе – 36,4 недели, тогда как в группе контроля – 39,3 недели.
Послеродовый период у пациенток 1А подгруппы в 23,1% случаев протекал с осложнениями: диагностировали эндометрит (7,7%) и субинволюцию матки (15,4%) (p<0,05).
У детей 1А подгруппы достоверно чаще диагностировалась асфиксия (53,2 и 33,3%) и неонатальная желтуха (23,0 и 8,3%) (p<0,05).
ПН и ВИ достоверно чаще встречались при хроническом пиелонефрите (24,2%), хроническом цистите (30,6%) (p<0,05), уреаплазменной инфекции (38,5%) (p<0,05), самопроизвольных выкидышах (19,2%) и бесплодии (26,9%) в анамнезе (p<0,05), наступлении данной беременности в результате ЭКО (11,5%) (p<0,05), неспецифическом вульвовагините (23,0%), истмико-цервикальной недостаточности (23,0%) и многоводии (19,4%) (p<0,05) во время данной беременности. Полученные нами результаты позволяют выделить такие факторы риска для диагностики ПН и ВИ, как хронический пиелонефрит, хронический цистит, самопроизвольные выкидыши и бесплодие в анамнезе, наступление беременности в результате ЭКО, неспецифический вульвовагинит, истмико-цервикальная недостаточность и многоводие во время беременности. Ряд авторов выделяют такие факторы риска ПН и ВИ, как отягощенный акушерско-гинекологический анамнез, патологическое течение беременности, заболевания мочеполовой системы у матери, инфекционные заболевания любых других органов и систем у матери, которые возникают во время беременности [8–12]. Однако C. Bose с соавт. указывает на отсутствие корреляции между воспалительными заболеваниями матери и развитием ВИ и ЗРП [13]. Вероятно, это связано с необходимостью более детального отбора пациенток группы риска и проведением среди них углубленного диагностического поиска. В связи с вышесказанным большой интерес вызвало изучение генетической основы индивидуальных различий иммунного ответа при инфекционно-воспалительных заболеваниях посредством проведения молекулярно-генетического исследования полиморфных вариантов генов цитокинов и ряда их рецепторов.
В нашем исследовании у матерей с генотипом А/А уровень IL-10 в сыворотке крови не отличался от такового при наличие аллеля C в генотипе.
Однако при анализе в сыворотке крови уровня IL-6 – мощного провоспалительного цитокина – выявлено снижение его уровня в кровотоке у пациенток с генотипом IL-10: 592 A/A (p=0,05).
При исследовании пуповинной крови наличие генотипа IL-10: 592 A/A у ребенка ассоциировалось с ПН и ЗРП (85,7 против 32,6% при других генотипах, OR=12,4 (1,7-89,9), р=0,007). Соответственно чаще наблюдалась хроническая гипоксия плода (71,4 против 17,6%, OR=11,7 (2,5-55,8), р=0,003). Влияния материнского генотипа на возникновение данной патологии выявлено не было. Ряд авторов, исследовавших уровень IL-10 в пуповинной крови, указывают на достоверно более низкий уровень данного противовоспалительного цитокина в кровотоке новорожденных с ЗРП [13–15]. P. Vural и соавт. (2010), напротив, указали на связь выявления полиморфизма гена IL-10 с повышением его продукции и развитием преэклампсии [16].
Учитывая предрасположенность носителей генотипа IL-10: 592 A/A к снижению воспалительного ответа, ожидалось повышение вероятности ВИ при наличии данного генотипа у ребенка. Указанная тенденция действительно наблюдалась (28,6 против 10,4%), но не достигала статистической значимости (р=0,173). Учитывая приведенные выше данные о связи генотипа А/А с ПН, была проанализирована ассоциация ВИ, ПН и генотипа IL10: 592 A/A у ребенка.
Влияние генотипа А/А с ВИ прослеживалось у детей, рожденных у матерей с ПН, тогда как при отсутствии ПН частота ВИ оставалась низкой при всех генотипах (рисунок, см. на вклейке).
Заключение
Факторами риска развития ВИ при ПН являются: наличие хронического пиелонефрита (24,2%, OR=6,4 (2,0-20,2), p=0,001), хронического цистита (30,6%, OR=3,5 (1,0-11,8), p=0,04), самопроизвольных выкидышей в анамнезе (19,2%, OR=7,7 (2,2-27,3), p=0,0003), истмико-цервикальной недостаточности (23,0%, OR=2,1 (1,1-4,2), p=0,03) и многоводия (19,4%, OR=4,7 (1,2-18,1), p=0,02) во время данной беременности. Беременность при ПН сопровождается такими осложнениями, как формирование ретрохориальной гематомы (12,0%, OR=7,5 (1,4-39,3), р=0,036), угрозой прерывания в I и II триместрах беременности (76,5%, OR=2,3 (1,0-5,2), р=0,004) и угрозой преждевременных родов (76,0%, OR=2,9 (1,2-6,7), р=0,009), патологией околоплодных вод в виде многоводия (16,3%, OR=4,7 (1,2-18,1), р=0,019), а также ОРВИ (26%, OR=9,0 (1,9-41,9), р=0,002).
Наличие генотипа A/A полиморфизма гена IL-10: -592 A>C у ребенка ассоциируется с повышением вероятности ВИ при ПН, хронической гипоксии и задержке развития плода во время беременности (OR=18.9 (1,7-215,2), p=0,031).
Результаты исследования позволяют использовать у беременных с ПН клинические предикторы для выявления группы высокого риска реализации ВИ с последующим проведением генетического скрининга среди их новорожденных.
