Внедрение инновационных технологий в микробиологическую диагностику расширяет наши познания в области медицинской микроэкологии. Развитие лабораторной техники, молекулярно- биологических и генетических методов исследования позволило установить высокую гетерогенность бактерий рода Lactobacillus и их широкое видовое разнообразие, достигающее сотни видов [7, 8, 16]. Возможность видовой идентификации лактобактерий, основной составляющей нормофлоры вагинального биотопа, возможно, позволит ближе подойти к пониманию механизмов развития оппортунистических вагинальных инфекций, установить корреляцию между видовым составом этих микроорганизмов и инфекционной патологией влагалища [1, 2, 4, 19, 22].
У здоровых женщин доминирующими видами микробиоты влагалища являются лактобактерии, преобладающее количество которых, по мнению большинства исследователей, определяет высокий уровень противомикробной защиты [2, 9, 11, 12]. В последние годы наблюдается снижение частоты воспалительных заболеваний урогенитального тракта женщин, вызванных абсолютными патогенами, в то время как частота оппортунистических инфекций этой локализации неуклонно растет [5, 15, 17]. Нарушение состава микробиоты влагалища возникает вследствие неблагоприятных внешних воздействий, при подавлении локального и общего иммунитета, при ряде инфекционных и соматических заболеваний, широкого использования антибактериальных и контрацептивных препаратов [5, 6, 13]. Нарушения вагинальной микрофлоры во время беременности провоцируют восходящее инфицирование плодного яйца, задержку роста плода, преждевременные роды или их сочетания. Причиной этого может быть вытеснение лактобактерий из микробиоты влагалища и доминирование условно-патогенной микрофлоры, увеличение общего количества бактерий и местная лейкоцитарная реакция [12, 15, 21]. Поэтому необходимо пристальное изучение состава микробиоты влагалища.
Лактобактерии (лактобациллы) являются превалирующими видами нормальной микрофлоры вульвы и влагалища (106–108 КОЕ/мл отделяемого). Грамположительные микроаэрофильные или анаэробные неспорообразующие бактерии, чаще длинные «палочки» правильной формы, иногда кокковидные, располагаются в коротких цепочках или поодиночке. Лактобактерии морфологически очень изменчивы и могут иметь разную морфологию в нативных вагинальных мазках и в мазках из чистой культуры. Более того, один и тот же вид лактобактерий различен морфологически в зависимости от питательной среды и условий культивирования. Общепризнанно, что главные функции лактобактерий во влагалище — поддерживать кислую среду и подавлять рост условно- патогенных микроорганизмов.
Полезные функции лактобактерий обусловлены продукцией молочной кислоты, уксусной кислоты и перекиси водорода, повышающих кислотность среды, а также веществ с антибиотической активностью, подавляющих рост патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. Несмотря на то что лактобактерии считаются «полезной» флорой влагалища, их обильный рост во влагалище способен вызвать патологическое состояние (цитолитический вагиноз, лактобациллез), также описаны единичные случаи сальпингита, хронического цервицита и даже перитонита и сепсиса, вызванных лактобактериями [20, 23, 25].
Видовая идентификация лактобактерий долгое время была трудновыполнимой задачей из-за невозможности преодоления методических трудностей при изучении их биологических свойств. Более века морфологические свойства лактобактерий оставались единственным критерием их родовой идентификации. Учитывая морфологическое разнообразие этих бактерий, а также то обстоятельство, что во влагалище кроме лактобактерий могут присутствовать и другие грамположительные палочки (коринебактерии, актиномицеты, пропионибактерии, клостридии и др.), можно утверждать, что такая диагностика недостаточна и недостоверна. С 80-х гг. XX века с широким внедрением в практику бактериологических анализаторов, появилась возможность видовой идентификации культивируемых лактобактерий на основе фенотипических свойств по биохимической активности [8, 16]. Опыт применения биохимических панелей от различных производителей показывал, что данная методика трудоемка, длительна и мало достоверна. Несмотря на все недостатки, морфологические и биохимические методы идентификации лактобактерий до последнего времени оставались единственными критериями видовой идентификации этих микроорганизмов. Альтернативой классической биохимической идентификации в последние два десятилетия стал метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), а с недавнего времени прочную нишу начал занимать мaсс-спектрометрический анализ (MS), основанный на регистрации белковых спектров микроорганизмов, которые уникальны для семейств, родов и видов микроорганизмов. Современная видовая идентификация лактобактерий должна стать первым шагом в разработке новой стратегии диагностики и лечения оппортунистических урогенитальных инфекций.
Целью настоящего исследования было определение видового состава лактобактерий при различных состояниях микробиоты влагалища у женщин репродуктивного возраста с помощью масс-спектрометрического и молекулярно-генетического методов.
Материали методы исследования
Проведено обследование 228 женщин репродуктивного возраста от 18 до 40 лет: 147 женщин во II–III триместрах беременности и 81 – вне беременности. У женщин были исключены инфекции, передающиеся половым путем: ВИЧ- инфекция, сифилис (методом ИФА), гонорея, трихомониаз, хламидиоз, инфекции вызванные M. genitalium (методом ПЦР). Всем женщинам было проведено комплексное микробиологическое обследование: микроскопия мазков (окрашенных по Граму и метиленовым синим) и культуральное исследование отделяемого влагалища. Оценка состояния микроценоза влагалища проводилась по модификации А.С. Анкирской и В.В. Муравьевой [3] с учетом состояния вагинального эпителия, лейкоцитарной реакции, состава микробиоты, а также выделенных микроорганизмов в посеве. Взятие отделяемого влагалища для культурального исследования проводили стерильным тампоном в две пробирки с транспортной средой Эймса (Medical Wire, Англия). Первичный посев с полуколичественной оценкой роста микроорганизмов проводили на селективные и дифференциально-диагностические питательные среды: колумбия агар, маннит-солевой агар (Сonda, Испания), среду Эндо, энтерококкагар и агар Сабуро (ФГУН «ГИЦПМ и Б», Оболенск). Оценку роста лактобактерий проводили после культивирования в условиях СО2 инкубатора (Jouan, Франция), анаэробных газогенераторных пакетов (ВioMerieux, Франция) и анаэростата (Jouan, Франция) с использованием питательных сред отечественных (Лактобакагар, ФГУН «ГИЦПМ и Б», Оболенск) и иностранных производителей (агар MRS, Conda, Испания). Все посевы инкубировали при температуре 36 °С в течении 24–48 ч. Видовую идентификацию выделенных лактобактерий проводили масс-cпектрометрическим методом с использованием времяпролетного масс-спектрометра MALDI TOF MS AutoFlex III c программным обеспечением Maldi BioTyper (Bruker Daltoniks, Германия). Параллельно с культуральной диагностикой для ПЦР исследования брали отделяемое влагалища в транспортные среды для биопроб (изотонический водно-солевой раствор с консервантом, ДНК- технология, Россия). Для прямого молекулярно-генетического типирования лактобактерий использовали метод видоспецифичной количественной ПЦР (Real-Time PCR, ДНК-технология, Россия) с праймерами лактобактерий 6 видов: L. crispatus, L. jensenii, L. gasseri, L. iners, L. johnsonii, L. vaginalis.
Результаты исследования и обсуждение
На основании интегральной оценки результатов микроскопии и культурального исследования в общей группе женщин (n=228) состояние микроценоза оценено как нормоценоз (Н) у 109 (47,8%), а у 119 (52,2%) – диагностированы различные варианты вагинальных инфекций. Вульвовагинальный кандидоз (ВВК) выявлен у 40 (17,5%) пациенток; неспецифический вагинит (НВ), ассоциированный с факультативно-анаэробными условно-патогенными микроорганизмами – у 35 (15,3%); бактериальный вагиноз (БВ) и мезоценоз (М) суммарно – у 34 (14,9%), сочетание БВ и ВВК – у 10 (4,5%). Сравнение состава микробиоты влагалища в группе беременных и женщин вне беременности не выявило существенной разницы в частоте Н (47,6 и 54,3% соответственно) и вагинальных инфекций (52,4 и 45,7% соответственно). Среди вариантов инфекционной патологии близкие по частоте выявления данные получены для НВ (14,7 и 13,6% соответственно) и сочетания БВ с ВВК (5,8 и 3,7% соответственно). В то же время при беременности в 1,7 раза чаще диагностировали ВВК и реже в 1,6 раза выявляли БВ.
При культуральном исследовании выделено 332 штамма лактобактерий, видовая идентификация которых выполнена MS методом. С высокой степенью достоверности (lg score≥1,9) идентифицировано 88,9% культур и средней (lg score<1,9) – 11,1%. Выделено 18 видов лактобактерий, среди которых лидирующее положение занимали 3 вида: L. crispatus (33,5%), L. jensenii (23,0%) и L. gasseri (18,6%). Частота выделения остальных 15 видов (L. fermentum, L. salivarius, L. mucosae, L. oris, L. ultunensis, L. delbrueckii, L. plantarum, L. rhamnosus, L. kitasatonis, L. casei, L. paracasei, L. johnsonii, L. zeae, L. reuteri и L. viridescens – Weissella v.) колебалась от 0,5 до 5,1%. Таким образом, методом MS до вида были идентифицированы все штаммы куль тивированных лактобактерий.
При анализе частоты выявления лактобактерий методом Real-Time PCR (по праймерам 6 видов) было получено: L. iners (62,2%), L. crispatus (55,1%), L. vaginalis (42,6%), L. jensenii (32,7%), L. gasseri (24,5%), L. johnsonii (11,2%).
Суммарно результаты двух методов показали, что у 37,3% женщин выделен один вид лактобактерий, у 62,7% лактобактерии были в ассоциациях (28,1% – ассоциации двух видов, 20,6% – трех и 14,0% – четырех и более). У 28,6% женщин встречались ассоциации L. crispatus/L. iners, у 26,5% – L. iners/L. jensenii и у 21,4% – L. crispatus/ L. jensenii. В ассоциациях трех видов лактобактерий превалировали сочетания L. crispatus/ L. iners/L. jensenii (14,3%).
При оценке частоты выявления лактобактерий различными методами: микроскопическим, культуральным и методом Real-Time PCR с учетом состояния микробиоты влагалища (рис. 1, см на вклейке) было отмечено практически полное совпадение результатов трех методов по всем нозологическим группам, за исключением БВ.
По данным ПЦР-диагностики, при БВ в 100% случаев выявлены лактобактерии в достаточно высоком титре (>7 lg КОЕ/мл), хотя по сравнению с общей бактериальной массой их доля не превышала 10%, а ведущими микроорганизмами в составе микробиоты были строгие анаэробы. При культуральной диагностике лактобактерии были выявлены в 18% случаев в умеренных титрах (4–5 lg КОЕ/мл), в 56% это были низкие титры лактофлоры (<4 lg Кое/мл). У 20% пациенток с БВ лактобактерии не были обнаружены
Определение видового спектра лактобактерий двумя методами (рис. 2, см на вклейке) с учетом только высоких титров (>7 КОЕ/ГЭ/мл) показало, что L. crispatus обнаружены у 72% женщин с Н. Разница в частоте встречаемости L. jensenii и L. gasseri не была статистически достоверной, хотя можно отметить, что L. jensenii чаще других были выделены при кандидозах, а L. gasseri – при НВ. Более чем у 80% женщин методом ПЦР типированы L. iners.
В отличие от других микробиотических состояний при БВ культуральным методом в низком титре был получен рост широкого видового спектра лактобактерий (L. fermentum, L. salivarius, L. mucosae, L. oris, L. ultunensis, L. delbrueckii, L. plantarum, L. rhamnosus, L. casei, L. paracasei, L. zeae, L. reuteri). Метод ПЦР выявил вид L. iners, который не был обнаружен в посевах и оказался некультивируемым на питательных средах, используемых в нашем исследовании и рекомендованных производителями для селективного выделения лактобактерий. Возможно, этот вид лактобактерий морфологически в нативных мазках может быть схож с гарднереллами и другими бактериями, которые характерны для БВ и по этой причине лактоморфотипы также не выявлялись при микроскопии нативных грам-мазков отделяемого влагалища у женщин с БВ. Учитывая эти два обстоятельства: отсутствие L. iners в мазках и в посеве можно предположить, что концепция формирования патогенеза БВ может оказаться ложной, а именно положение о том, что БВ формируется на фоне резкого снижения или отсутствия лактофлоры. Возможно также, что именно наличие L. iners может быть индикатором предрасположенности к БВ и все женщины, у которых они встречаются в высоких титрах, входят в группу риска по развитию или рецидивам БВ. Для доказательства или опровержения этой гипотезы требуется проведение дополнительных исследований непосредственно в группах женщин с БВ в течение длительного периода времени.
Выводы
Таким образом, на основании проведенных исследований можно сделать следующие выводы:
1. Видовой спектр вагинальных лактобактерий отличается широким разнообразием и представлен 21 видом; лидирующими являются: L. crispatus, L. iners, L. jensenii и L. gasseri.
2. Метод MALDI TOF MS явился наиболее эффективным методом и может успешно использоваться для идентификации культивируемых влагалищных лактобактерий.
3. Методом Real-Time PCR был выявлен вид L. iners, не культивируемый на селективных для лактобактерий питательных средах отечественного и импортного производства.
4. Для уточнения роли L. iners в инфекционной патологии влагалища необходимо дальнейшее исследование их ростовых свойств и способность расти на питательных средах другого состава, а при необходимости разработка питательной среды для их культивирования.
5. Типирование L. iners методом Real-Time PCR требует обязательного включения в программу обследования женщин.
6. Дальнейшее изучение морфофенотипических признаков и геномной конфигурации L. iners, возможно, позволит иначе трактовать роль этого вида лактобактерий в развитие БВ, изменить стратегию лечения и профилактики данной патологии.
