Задержка роста плода (ЗРП) – это осложнение беременности, которое проявляется неспособностью плода достигнуть своего генетически детерминированного потенциала роста и сопряжено с риском неблагоприятных исходов для плода [1]. Этиологические факторы ЗРП можно разделить на причины, связанные со здоровьем матери (хронические экстрагенитальные заболевания, осложнения беременности, табакокурение и др.), с состоянием плода (хромосомные аберрации, внутриутробные инфекции, врожденные аномалии развития) и с нарушениями структуры и функции плаценты и пуповины. Именно на долю плацента-обусловленных состояний приходится наибольшее число случаев развития ЗРП [2].
МикроРНК относятся к семейству небольших некодирующих РНК (в среднем 18–25 нуклеотидов), которые регулируют экспрессию генов на посттранскрипционном уровне путем деградации или блокирования трансляции таргетной матриксной РНК (мРНК) [3]. Впервые описанные в 1993 г. как эндогенные медиаторы у C. elegans, сейчас микроРНК изучены более подробно; определена роль данного семейства РНК в клеточной дифференцировке, пролиферации, апоптозе, нормальном и патологическом развитии, поддержании гомеостаза [4].
Являясь модуляторами множества биологических процессов, микроРНК имеют широкий круг применения в клинической диагностике. Так, при многих заболеваниях и патологических состояниях достоверно установлено изменение активности микроРНК, играющее критическую роль в изменении экспрессии генов; особенно хорошо разработано это направление в онкологии [5]. МикроРНК могут служить ранними маркерами того или иного заболевания или осложнения, предикторами адекватного либо недостаточного ответа на лечебное воздействие, а в перспективе – могут получить применение в качестве самостоятельного терапевтического агента, действуя на причины заболевания на эпигенетическом уровне [6].
Ключевым моментом в понимании роли микроРНК является знание нормального профиля и уровня экспрессии этих биологических регуляторов в различных тканях. В основном микроРНК не обладают высоким уровнем тканеспецифичности; тем не менее, имеются данные о множестве различных микроРНК, экспрессия которых преобладает в определенных тканях [7, 8].
Вариабельность микроРНК в образцах различных тканей широко исследуется как в норме, так и при патологических изменениях.
Так как во многих случаях ЗРП обусловлена плацентарной недостаточностью, логично предположить, что те микроРНК, которые специфичны для плаценты, могут играть ключевую роль в развитии данного осложнения беременности, нарушая биологические процессы, необходимые для нормального развития и функционирования плаценты [9]. Плацента-специфичные микроРНК впервые были выделены в 2007 г. методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ) [10, 11]. Они принимают участие в огромном числе необходимых функций, включая обеспечение иммунологической толерантности и ангиогенеза [12]. В настоящее время известно более 500 микроРНК, связанных с формированием и функционированием плаценты [13]. Предполагается, что изменение экспрессии микроРНК в трофобластах может быть ассоциировано с развитием плацентарной недостаточности и обусловленных ею осложнений беременности [11].
Итак, целью настоящего исследования было определение роли микроРНК в генезе ЗРП, вызванной плацентарной недостаточностью.
Материалы и методы
Формирование клинических групп пациентов
В исследование были включены беременные, наблюдающиеся в ГБУ Ростовской области «Перинатальный центр» (основная группа) и ООО «Клиника профессора Буштыревой» (контрольная группа) в 2017–2018 гг. Сформировано две группы: первую группу составили 27 пациенток, чья беременность осложнилась ЗРП, во вторую (контрольную) группу вошли 15 женщин с неосложненным течением беременности. Критериями исключения стали: наличие многоплодной беременности, врожденных пороков развития и хромосомных аберраций, индуцированная беременность (применение вспомогательных репродуктивных технологий).
Женщины, включенные в исследование, были сопоставимы по возрасту, исходному индексу массы тела, особенностям акушерско-гинекологического анамнеза и сопутствующим заболеваниям. Забор крови проводился с информированного добровольного согласия пациенток, однократно, в сопоставимые сроки: в первой группе анализ крови взят в 33,1 (32,4;33,6) недели беременности (Me (Q1;Q3)); во второй группе – в 32,9 (31,2;33,4) недели (p=0,358).
Диагноз ЗРП выставлялся на основании данных ультразвукового и допплерометрического исследования с использованием перцентильных кривых (кривые роста Фентона для недоношенных мальчиков и девочек) [14]. Расчет предполагаемой массы плода проводился с применением формулы Хэдлока 2:
m=10exp×(1,335-0,0034×AC×FL+0,0316×BPR+0,0457×AC+0,1623×FL),
где BPR – бипариетальный размер головки; АС – окружность живота; FL – длина бедра.
Беременным с ЗРП проводился мониторинг внутриутробного состояния плода с использованием допплерометрического исследования (пульсационный индекс артерии пуповины и маточных артерий; при обнаружении «критических» нарушений фетоплацентарного кровотока исследовалась также гемодинамика в венозном протоке) и кардиотокографии.
У 25 беременных первой группы (92,6%) была диагностирована поздняя ЗРП; диагноз установлен в среднем в 33,1 (32,2;34,8) недели беременности. У всех беременных с ЗРП в той или иной степени отмечались проявления фетоплацентарной недостаточности: прежде всего повышение пульсационного индекса в артерии пуповины более 95%; реже отмечались признаки централизации кровотока – цереброплацентарное отношение менее 5-го процентиля; у троих (11,1%) женщин выявлены «критические» нарушения фетоплацентарной гемодинамики (нулевой либо реверсный конечно-диастолический кровоток в артерии пуповины). У 7 пациенток (25,9%), вошедших в первую группу, уже после забора крови в рамках данного исследования беременность осложнилась также преэклампсией (у 2 женщин из 7 – тяжелой степени).
26 женщин первой группы (96,3%) были родоразрешены преждевременно, в среднем в 35,0 (34,3;36,0) недели беременности, у 23 выполнялось кесарево сечение (85,2%). Основными показаниями для родоразрешения была декомпенсация фетоплацентарной недостаточности и нарастание степени тяжести преэклампсии. Беременности пациенток из контрольной группы завершены в доношенном сроке, в среднем в 39,3 (38,5;40,2) недели беременности. Большинство пациенток – 12 человек (80%) – были родоразрешены через естественные родовые пути.
Выделение микроРНК
Для анализа были отобраны микроРНК, которые в соответствии с литературными данными могут быть отнесены к плацента-специфичным: микроРНК-10b-5p, микроРНК-145-5р, микроРНК-122-5р, микроРНК-141-3р, микроРНК-125b-5р, микроРНК 205-5р, микроРНК-210-3р, микроРНК-517-5р.
Забор периферической венозной крови для исследования проводили натощак, в утренние часы, в пробирку со стабилизатором РНК Tempus™ Blood RNA (Applied Biosystems, США) в количестве 3 мл. Образцы крови замораживали и хранили при -20°С до проведения исследований. Чтобы избежать деградации, образцы размораживали только один раз.
Экстракцию тотальной РНК проводили при помощи набора реагентов GeneJET Stabilized and Fresh Whole Blood RNA Kit (Thermo Scientific, США). Количество и качество выделенной РНК оценивали спектрофотометрически. OD260/280 образцов РНК колебалось от 1,80 до 2,00. Образцы были нормализованы до концентрации тотальной РНК 10 нг/мкл.
Полиаденилирование тотальной РНК проводили при помощи poly(A) полимеразы E. coli (New England Biolabs, Великобритания) при 37°С 20 минут в объеме 20 мкл. Состав смеси: 15,6 мкл тотальной РНК (10 нг/мкл), 2 мкл poly(A) буфера, 2 мкл АТФ, 0,4 мкл poly(A) полимеразы.
Тотальную полиаденилированную РНК подвергали обратной транскрипции в кДНК c использованием набора реактивов MMLV RT kit («Евроген», Россия), в 20 мкл реакционной смеси следующего состава: 5 мкл поли-А РНК, 1 мкл RT-праймера, 0,5 мкл обратной транскриптазы MMLV, 4 мкл (5Х) реакционного буфера, 2 мкл dNTP, 2 мкл DTT, 4,5 мкл H2O. Реакцию обратной транскрипции проводили при 40°С в течение 40 минут, после чего – при 70°С в течение 10 минут.
Дизайн прямых и обратных праймеров для проведения ПЦР-РВ проводили в соответствии с методикой Baccels [15, 16]. Последовательности праймеров приведены в таблице 1.
Реакция ПЦР-РВ была проведена на амплификаторе CFX-96 (Bio-Rad, США) c использованием реагентов фирмы «Евроген» (Россия) в объеме 25 мкл. Состав смеси: qPCRmix-HS SYBR – 5 мкл, 1 мкл прямого праймера, 1 мкл обратного праймера, 16 мкл Н2О, 2 мкл кДНК. Условия для проведения ПЦР: предварительная денатурация 95°С 5 минут, далее 95°С 15 с, 60°С 10 с, 72°С 20 с, 45 циклов. В качестве красителя был использован SYBR Green I.
Оценку изменения уровня экспрессии исследуемой микроРНК в опытном образце по отношению к контрольному проводили с помощью ∆Ct метода [17].
Статистический анализ
Статистическая обработка полученных данных проведена с помощью пакета прикладных программ IBM SPSS Statistics 21, с использованием статистического критерия Колмогорова–Смирнова для проверки гипотезы о принадлежности исследуемой выборки нормальному закону распределения. Поскольку все анализируемые данные не соответствовали нормальному закону распределения, статистическую значимость различий оценивали с помощью методов непараметрической статистики (U-критерий Манна–Уитни). Использовали общепринятый уровень статистической значимости p<0,05.
Результаты и обсуждение
В таблице 2 представлена экспрессия микроРНК у беременных с нормально протекающей беременностью и с ЗРП. Статистически значимые различия по концентрации получены только по микроРНК-125b-5p (p=0,011), экспрессия которой ниже при наличии ЗРП.
В нашем исследовании для проведения анализа отобрали микроРНК, которые, по данным литературы, можно отнести к плацента-специфичным в силу того, что именно плацентарная недостаточность является важным звеном патогенеза ЗРП. Полученные результаты свидетельствуют об изменении уровня экспрессии микроРНК-125b-5р у беременных с ЗРП по сравнению с женщинами, чья беременность протекает физиологически, неосложненно. Степень изменения уровня экспрессии микроРНК-125b-5р (fold change) составила 5,25.
Результаты, полученные в настоящем исследовании, можно проиллюстрировать следующими клиническими примерами.
Пример 1. Беременная П. была госпитализирована с поликлинического приема в ГБУ РО «Перинатальный центр» в отделение патологии беременности с жалобами на снижение двигательной активности плода (менее 5 шевелений в сутки в течение последних двух дней). По данным ультразвукового исследования выявлена ЗРП I степени по асимметричному типу с нарушением фетоплацентарной гемодинамики. Диагноз при поступлении: Беременность 31 неделя 5 дней. Фетоплацентарная недостаточность, субкомпенсация, ЗРП. Хронический гастрит, ремиссия. Варикозная болезнь вен нижних конечностей, хроническая венозная недостаточность I ст.
Женщина была госпитализирована в стационар, наблюдалась и получала терапию в соответствии со стандартом оказания медицинской помощи. При лабораторном исследовании периферической венозной крови получены следующие показатели экспрессии микроРНК: ∆Ct микроРНК-26а-5р=13,1.
Беременность завершилась преждевременными оперативными родами в сроке гестации 33 недели 4 дня и рождением живого недоношенного ребенка с массой тела 1850 г, длиной 43 см, с оценкой по шкале Апгар 7/7 баллов. Диагноз новорожденного: недоношенность, задержка внутриутробного развития плода по гипотрофическому типу.
Пример 2. Пациентка З. находилась на амбулаторном обследовании в ГБУ РО «Перинатальный центр». Диагноз: Беременность 30 недель 3 дня. Отягощенный гинекологический анамнез (хронический аднексит). Дефицит массы тела.
При лабораторном исследовании периферической венозной крови получены следующие показатели экспрессии микроРНК: ∆Ct микроРНК-26а-5р=3,7.
При дальнейшем наблюдении, по данным ультразвуковых и допплерометрических исследований в течение беременности, состояние плаценты и плода оценивалось как нормальное, соответствующее сроку гестации, беременность завершилась срочными родами через естественные родовые пути в сроке 39–40 недель и рождением живого доношенного мальчика с массой тела 3100 г, ростом 50 см, оценкой по шкале Апгар 8/9 баллов. Диагноз ребенка при рождении: здоров.
МикроРНК-125b-5р у человека впервые была зарегистрирована в 2005 г. в клетках, недавно инфицированных герпесвирусом человека 8 типа, ассоциированным с саркомой Капоши [18]. С этого момента выполнено большое количество научных работ, связанных преимущественно с анализом участия микроРНК-125b-5р в онкологических заболеваниях.
Изменение уровня экспрессии микроРНК-125b-5р в различные сроки беременности было выявлено при исследовании ткани плаценты [19]. Экспрессия микроРНК-125b-5р динамически меняется в течение гестации, и она статистически значимо выше в трофобластах в III триместре беременности, чем в I триместре. Это может свидетельствовать об участии микроРНК-125b-5р в нормальном развитии плаценты на поздних сроках беременности, тогда как снижение ее экспрессии (что было выявлено в нашем исследовании) говорит о нарушении нормального формирования плаценты, предрасполагая к осложнениям беременности.
По данным многих авторов, микроРНК-125b-5р
можно отнести к группе «ангио-микроРНК», то есть к тем микроРНК, которые играют роль в процессе ангиогенеза, пролиферации эндотелиоцитов и других функциях [20, 21]. Одним из генов-мишеней, на который действует микроРНК-125b-5р, является EDN1, кодирующий эндотелин-1 [22]. Эндотелин-1 играет ключевую роль в поддержании гомеостаза кровеносных сосудов через высвобождение ионов кальция, приводя к вазоконстрикции, а также повышая адгезию и агрегацию тромбоцитов. МикроРНК-125b-5р является негативным регулятором, а значит, при снижении ее экспрессии уровень эндотелина-1 возрастает. Последующее развитие патологических процессов в эндотелиальных клетках обуславливает нарушение эндотелий-зависимой релаксации сосудов, в том числе в системе «мать-плацента-плод», вызывая плацентарную недостаточность, которая клинически реализуется в формирование ЗРП.
Полученные нами результаты расходятся с данными Гусар В.А. и соавт. в исследовании 2019 г. [23], выявившими повышенную экспрессию микроРНК-125b-5р в тканях плаценты женщин с ранней ЗРП. Наблюдаемые изменения могут быть обусловлены влиянием данной микроРНК на регуляцию сбалансированной работы про- и антиоксидантной системы путем повышения образования свободных радикалов [24]. Вероятно, противоречивые результаты обусловлены иным локусом (определялась экспрессия в ткани плаценты, а не циркулирующие в периферической крови микроРНК) и меньшим объемом выборки пациенток.
Роль микроРНК-125b-5р в генезе ЗРП исследовалась в 2015 г. Hromadnikova I. и соавт. Наряду с микроРНК-122-5p и микроРНК-195-5p, экспрессия микроРНК-125b-5р была статистически значимо (р=0,005) снижена в ткани плацент пациенток с ЗРП, потребовавшей родоразрешения до 34 недель гестации, в сравнении с беременными без осложнений, а также с беременными с преэклампсией, показав более высокую специфичность именно в отношении ЗРП [25]. В другом исследовании в 2016 г. этой группой ученых было продемонстрировано изменение уровня экспрессии микроРНК-125b-5р не только при ЗРП, но и при преэклампсии и гестационной артериальной гипертензии. В данной работе анализировалось изменение профиля плацента-специфичных микроРНК уже не в плацентарной ткани, а в периферической крови беременных женщин [26]. Предполагаемым механизмом, с помощью которого может быть опосредовано участие микроРНК-125b-5р в развитии гипертензивных расстройств и плацентарной недостаточности, приводящей к ЗРП, авторы считают гипоксию, эндотелиальную дисфункцию и нарушение ангиогенеза, что и было рассмотрено нами выше на примере эндотелина-1, а также изменения иммунного статуса беременной. По-видимому, эти процессы, действуя индивидуально, синергически или кумулятивно, приводят к нарушениям эпигенетического контроля в плаценте, в частности, к изменению профиля экспрессии микроРНК.
Заключение
Беременность – это сложный физиологический процесс, и мы только начинаем понимать функции микроРНК во время беременности. МикроРНК являются «дирижерами», регулирующими «включение» и «выключение» экспрессии генов, управляя всеми процессами, в том числе, в ходе развития беременности. Таким образом, сбои и нарушения в этом сложном, многоступенчатом механизме могут приводить к серьезным последствиям, обуславливая ряд осложнений беременности, включая ЗРП.
Наше исследование продемонстрировало изменения в профиле плацента-специфичных микроРНК при ЗРП. Роль микроРНК-125b-5р в генезе ЗРП, по-видимому, связана с влиянием на сосудистый гомеостаз и нарушением процессов эндотелий-зависимой релаксации сосудов, в том числе в гемодинамической системе «мать-плацента-плод», что обуславливает развитие плацентарной недостаточности. Учитывая важность микроРНК как диагностических и прогностических маркеров необходимы дальнейшие исследования, проясняющие конкретные механизмы влияния данных молекул на развитие осложнений беременности, что, несомненно, поможет раскрыть в более полной мере диагностический и терапевтический потенциал микроРНК.
