Диагностика предраковой патологии шейки матки на стадии интраэпителиальной неоплазии является глобальной актуальной проблемой. Это продиктовано, во-первых, высокой распространенностью рака шейки матки, показатели заболеваемости которым занимают третье место в мире среди женщин репродуктивного возраста [1]; во-вторых, диагностика на стадии цервикальной интраэпителиальной неоплазии (CIN) дает врачу время (10–15 лет) для лечения пациентки и предотвращения развития рака. Следовательно, разработка методов и систем ранней диагностики CIN является первостепенной задачей здравоохранения.
Для ранней диагностики CIN широко применяют цитологический метод – Pap-тест и молекулярные методы выявления ДНК вируса папилломы человека (ВПЧ) [2, 3]. Каждый метод имеет свои сильные и слабые стороны. Цитологический метод, прежде всего жидкостная цитология, отличается повышенной специфичностью, ДНК-тесты – высокой чувствительностью [4, 5]. Недостаточная специфичность ДНК-тестов, особенно у женщин до 30 лет, обусловлена тем фактом, что большая часть ВПЧ инфекций носит транзиторный характер, и лишь 5–10% имеет персистентный статус, вызывая глубокие необратимые неопластические процессы в шейке матки [6].
Поиск новых маркеров патологии шейки матки привел исследователей к белку р16(INK4A) [7, 8], который является продуктом гена CDKN2A и подавляет активность циклин-зависимых киназ 4 и 6, которые регулируют G1-фазу клеточного цикла. Экспрессия этого белка в нормальных клетках ограничена. При ВПЧ-инфекции онкобелок Е7 связывается с белком супрессором опухолей ретинобластомой (Rb), что приводит к деградации последней и, как следствие, к избыточной экспрессии р16 [9]. Выявление атипичных клеток плоского эпителия шейки матки, экспрессирующих одновременно р16 и маркер пролиферации Ki67, указывает на индуцированное дисрегулирование клеточного цикла и обеспечивает более точную диагностику поражений высокой степени тяжести. Первые исследования по определению р16 и Ki67 показали высокую специфичность метода [10]. В связи с этим в настоящее время в Европе проводится многоцентровое исследование по оценке чувствительности и специфичности иммуноцитохимического (ИЦХ) выявления р16/Ki67 в сочетании с цитологией и ВПЧ-тестированием.
Выявление ДНК ВПЧ в настоящее время проводится с помощью реакции гибридизации вирусной ДНК с РНК-зондом (Digene-тест), полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (cobas-тест) и другими способами.
Данные о специфичности и чувствительности всех перечисленных методов неоднозначны.
Целью данной работы была оценка эффективности двойного окрашивания p16/Ki-67 в сочетании с жидкостной цитологией и ВПЧ-тестированием при выявлении CIN.
Материал и методы исследования
Проведено клинико-морфологическое исследование материала, полученного от 4443 женщин, проходивших обследование и лечение в ФГБУ НЦАГиП им. академика В.И. Кулакова Минздрава России за 2013 г. Обследованные женщины были в возрасте от 17 до 42 лет (средний возраст 28,3±4,5 года). Обследование проводили по общепринятому протоколу: клинический осмотр, взятие мазков в SurePath виалы (BD, США), приготовление цитологических препаратов, окрашенных по Папаниколау, с помощью TriPath процессора (BD, США), оценка мазков по системе «Bethesda» [11]. В 148 случаях с выявленной патологией шейки матки помимо цитологического анализа проводили молекулярно-биологическое исследование с целью изучения экспрессии маркеров p16/Ki-67 в цитологических препаратах, приготовленных из остаточного материала виал. Кроме того, выполняли кольпоскопию с прицельным взятием измененных или подозрительных участков цервикального канала для гистологического исследования и в случаях диагноза ≥CIN2 проводили конизацию шейки матки (67 пациенток). Гистологический диагноз рассматривали как золотой стандарт для оценки эффективности р16/Ki-67 двойного окрашивания, жидкостной цитологии и ВПЧ-тестирования. Цитологический и биопсийный материал использовали для постановки ИЦХ-реакций с двойной окраской для выявления экспрессии р16 (INK4A) и Ki-67 по методике, разработанной производителем (CINtec PLUS, mtm laboratories, Германия). Для визуализации мест связывания антител с антигенами использовали реакцию окисления субстрата 3,3-диаминобензидина (ДАБ) пероксидазой хрена в присутствии перекиси водорода с образованием водонерастворимого конечного продукта коричневого цвета (р16) и реакцию взаимодействия щелочной фосфатазы с хромогеном Fast Red c образованием водонерастворимого осадка красного цвета (Ki67). Выявление двойной окраски даже в одной атипичной эпителиальной клетке рассматривали как положительный ответ иммуноокрашивания. Отсутствие одного из маркеров, либо р16, либо Ki67, оценивали как отрицательный признак опухолевой трансформации клеток плоского эпителия.
Выявление и генотипирование ДНК ВПЧ проводили на приборе Cobas 4800, представляющем собой полностью автоматизированную систему, выдающую результат по трем отдельным каналам: индивидуально ДНК ВПЧ16, ДНК ВПЧ18 и общий пул ДНК других 12 высокоонкогенных генотипов ВПЧ (31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 и 68) [12].
Большими преимуществами данного типа ВПЧ-тестирования являются выявление высокой вирусной нагрузки, имеющей клиническое значение, и генотипирование, позволяющие находить женщин с ДНК ВПЧ 16-го и 18-го типов, попадающих в группу высокого онкогенного риска.
Для оценки чувствительности и специфичности метода двойного окрашивания при выявлении CIN использовали формулы:
1.Чувствительность=а/(а+с), где а – истинно положительный диагноз, с – ложно отрицательный диагноз.
2. Специфичность=d/(d + b), где b – ложно положительный диагноз, d – истинно отрицательный диагноз.
Результаты исследования и обсуждение
Исследование состояло из нескольких этапов. На первом этапе проведения цитологического исследования мазков из цервикального канала, приготовленных методом жидкостной цитологии, всех пациентов разделили на пять групп: H-SIL, L-SIL, ASC-US-H, ASC-US-R и без признаков атипии NILM.
При цитологическом анализе мазков с диагнозом H-SIL обнаружили крупные комплексы и разрозненно лежащие атипичные клетки плоского эпителия полиморфного вида с резко выраженным дискариозом, а также фигурами митозов (рис. А см. на вклейке). В L-SIL выявили клетки плоского эпителия с легким дискариозом в сочетании с наличием сохранных зрелых клеток парабазального и поверхностных слоев. У женщин с ASC-US-R наблюдали отдельные небольшие группы клеток плоского эпителия с укрупненными и гиперхромными ядрами на фоне явлений воспаления. В ASC-US-H определили комплексы и отдельно лежащие атипичные клетки плоского эпителия с укрупненными и гиперхромными ядрами, подозрительные в отношении H-SIL. Мазки NILM содержали единичные койлоциты, лейкоциты, пласты плоского и цилиндрического эпителия с реактивными изменениями и явлениями лейкопидеза, а атипичные клетки отсутствовали.
На втором этапе проводили двойное иммуноокрашивание цитологических препаратов с использованием двух антител р16 и Ki67. Экспрессию р16/Ki67 выявляли в атипичных клетках плоского эпителия как в отдельно лежащих клетках, так и в комплексах клеток. Количество положительных клеток с двойной окраской не превышало 30% общего числа клеток при L-SIL и было от 30 до 100% в H-SIL (рис. Б см на вклейке). В NILM выявляли отдельные р16-положительные клетки, а также атрофические и дистрофические изменения, что позволило отнести их в категорию «стареющих» клеток [13]. Диагноз ASC-US по результатам проведения двойного иммуноокрашивания уточняли либо в L-SIL, либо в NILM. Кроме того, в трех случаях диагноз L-SIL изменили на H-SIL, так как количество атипичных клеток с двойным окрашиванием составляло до 90% всех клеток комплекса. Это было верным решением непростой диагностической задачи, подтвержденное гистологическим и ИЦХ заключениями ≥CIN2. В другом случае цитологический диагноз L-SIL изменили на NILM из-за отсутствия экспрессии онкомаркеров р16 и Ki67 в клетках плоского эпителия шейки матки. Гистологический ответ «хронический цервицит» подтвердил правильность изменения диагноза. Метод двойного иммуноокрашивания не требует подсчета позитивных клеток согласно инструкции производителя. Тем не менее, мы увидели прямую взаимосвязь числа р16/Ki-67-положительных клеток со степенью поражения шейки матки. Так, в цитологических препаратах с диагнозом H-SIL содержание позитивных клеток с двойной окраской в комплексах атипичных клеток плоского эпителия шейки матки cоставляло 80–100%. Наши наблюдения совпали с результатами T. Yoshida [14].
ИЦХ-исследование образцов с ≥CIN2 показало повышенную экспрессию белка р16 по всей глубине эпителиального слоя, а Ki67 – от 60 до 100% эпителиальных клеток шейки матки.
На третьем этапе провели выявление ДНК ВПЧ в цитологическом материале с помощью cobas-теста и сравнили полученные результаты с гистологическим заключением. В мазках с диагнозом NILM получили положительный результат в 1 образце из 22 (4,55%), ASC-US-R – в 8 случаях из 26 (30,77%), ASC-US-H – в 2 из 4 (50,0%). Причем чаще всего в 8 из 11 (72,72%) в этих образцах выявляли общий пул 12 типов высокого онкогенного типа ВПЧ. В образцах с диагнозом L-SIL тест был положительным в 34 случаях из 39 (87,18%). Более часто наблюдали сочетание общего пула 12 типов высокого онкогенного типа ВПЧ и ДНК ВПЧ 16-го типа – в 23 из 34 мазков (67,65%). В материале с H-SIL cobas-тест выявил ДНК ВПЧ в 63 образцах из 67 (94,03%), причем преимущественно ДНК ВПЧ 16-го типа в 50 случаях из 63 (79,37%).
Четвертым этапом было проведение гистологического исследования всего биопсийного и хирургического материала. Гистологическое заключение является «золотым стандартом» в диагностике CIN. Хронический цервицит выявили в 42 образцах из 148 (28,38%). Он характеризовался лимфомакрофагальной инфильтрацией стромы ткани, часто с примесью плазматических клеток. В эпителии встречали признаки акантоза, гиперкератоза, клеточного полиморфизма. В 39 образцах (26,35%) обнаружили патологию шейки матки <CIN2 со слабо выраженными изменениями строения эпителия при умеренной пролиферации базальных клеток. Морфологическими признаками папилломавирусной инфекции являлись: паракератоз, койлоцитоз, явления дискариоза и фигуры митозов. В 67 случаях (45,27%) выявили ≥CIN2 с выраженными морфологическими изменениями шейки матки, которые охватывали свыше двух третей эпителия и характеризовались появлением патологических митозов, наличием многократно увеличенных (гиперхромных) ядер клеток (рис. В см. на вклейке).
На пятом этапе проводили оценку чувствительности и специфичности методов жидкостной цитологии, двойного окрашивания р16/Ki67 и ВПЧ-тестирования. При этом гистологическое и ИЦХ-заключения служили критерием достоверности диагноза (рис. Г см. на вклейке). В литературе описаны случаи расхождения гистологических ответов биопсийного материала и последующей конизации шейки матки [15]. При интерпретации двойного иммуноокрашивания возможны ложноположительные результаты, так как отдельные клетки плоскоклеточной метаплазии, трубной метаплазии и эндоцервикальные клетки могут экспрессировать р16 и Ki67, а также антитела могут дать неспецифическое связывание с неубранной слизью из цервикального канала. Последнюю проблему решает жидкостная цитология, так как транспортная среда содержит мягкий компонент, лизирующий слизь. Ложнонегативные результаты возможны при условии повреждения цитоплазмы клеток, а также в случаях, когда сильная экспрессия р16 (коричневая окраска) в ядре клеток перекрывает красную окраску ядра (Ki67).
Результаты наших расчетов чувствительности и специфичности различных методов диагностики представлены в таблице.
Чувствительность цитологического метода исследования при выявлении хронического цервицита составила 90,0%, при патологии шейки матки <CIN2 – 92,11%, при ≥CIN2 – 96,97%. Чувствительность ВПЧ-тестирования с использованием cobas-теста составила в случаях хронического цервицита 88,89%, при патологии шейки матки < CIN2 – 97,14%, при ≥CIN2 – 95,45%. Чувствительность двойного окрашивания р16/Ki67 при хроническом цервиците составила 92,68%, при патологии шейки матки <CIN2 – 94,73%, при ≥CIN2 – 98,48%. Наиболее чувствительным методом выявления хронического цервицита является ИЦХ, так как морфологические изменения имеют не столь очевидный характер при данном заболевании, а ВПЧ-тестирование дает информацию только о наличии вирусной ДНК. И лишь двойное окрашивание позволяет правильно оценить реакцию организма на присутствие инфекции и воспалительные процессы. Наибольшую чувствительность при <CIN2 обнаружили при ВПЧ-тестировании, а для ≥CIN2 – при использовании ИЦХ. Сobas-тест уступал ИЦХ по чувствительности в силу того, что система выявляет только 14 типов высокоонкогенных ВПЧ, но были выявлены случаи ≥CIN2, в которых вирусная ДНК не была обнаружена. По-видимому, исследуемые образцы содержали другие типы ВПЧ.
Специфичность цитологического метода составила 90,9% при выявлении хронического цервицита и была абсолютной (100,0%) при обнаружении <CIN2 и ≥CIN2. Специфичность cobas-теста при выявлении хронического цервицита была 41,67%, при <CIN2 – 50,0% и 100,0% при обнаружении ≥CIN2. Специфичность ИЦХ р16/Ki67 составила 100,0% при всех рассматриваемых в данной работе видах патологии шейки матки.
Эффективность метода выявления патологии – это совокупность чувствительности и специфичности. Наше исследование показало, что двойное окрашивание р16/Ki-67 имеет большую эффективность с высокой чувствительностью и высокой специфичностью, чем обычная жидкостная цитология и ДНК ВПЧ-тестирование в выявлении эпителиальных поражений шейки матки высокой степени тяжести (≥CIN2). Количество позитивных р16/Ki-67 атипичных клеток ассоциируется с гистологической степенью тяжести цервикального интраэпителиального поражения. р16/Ki-67-иммуноокрашивание – маркер нарушения регуляции клеточного цикла и не контролируемой клеточной пролиферации наблюдается только в диспластических клетках, которые подверглись ВПЧ-ассоциированной трансформации. Выявленная нами эффективность метода имеет такую же высокую чувствительность и специфичность, как и эффективность двойного окрашивания, выявленная другими исследователями [16–18].
При сравнении эффективности метода двойного иммуноокрашивания с ВПЧ-тестированием группой исследователей [19] было выявлено и нами также подтверждено, что ИЦХ анализ с помощью CINtec PLUS более специфичен, так как позволяет определить не только присутствие вируса, но и ответ клеток эпителия шейки матки на его вторжение.
Заключение
Эффективное использование всех трех методов выявления патологии шейки матки – цитологии, ВПЧ-тестирования и ИЦХ позволяет максимально решить проблему не только диагностики, но и скрининга предрака и рака шейки матки. Двойное иммуноокрашивание р16/Ki67 – эффективный и высокоспецифичный метод выявления CIN.
