Качество ооцитов является одним из основных факторов, ограничивающих фертильность женщины. Морфологическая и структурная зрелость половых клеток определяет дальнейшую судьбу эмбриона, а следовательно, вероятность наступления беременности и рождения здорового ребенка. Доказано, что качество эмбриона в основном зависит от исходного качества ооцита [1].
В литературе активно обсуждается связь между качеством полученных при стимуляции функции яичников ооцитов и неудачными исходами программ экстракорпорального оплодотворения/интрацитоплазматической инъекции сперматозоидов (ЭКО/ИКСИ) [2]. В клинической практике ЭКО качество ооцитов оценивается преимущественно по их морфологическим характеристикам до и после оплодотворения. При этом неинвазивная селекция способных к оплодотворению и дальнейшему развитию ооцитов является существенной задачей, решение которой может значительно повысить эффективность программ вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) в будущем. «Идеальный» зрелый ооцит человека (на стадии МII) имеет светлую цитоплазму средней гранулярности, не содержащую включений, небольшое перивителлиновое пространство с единственным нефрагментированным первым полярным тельцем, а также прозрачную оболочку светлого цвета и правильной круглой формы. Диаметр такого ооцита составляет около 150 мкм.
В повседневной клинической практике лаборатории ЭКО оценка качества полученных при трансвагинальной пункции ооцитов производится достаточно поверхностно. При проведении инсеминации ооцитов in vitro (процедура классического ЭКО) тщательная оценка морфологии ооцитов не проводится, учитывая наличие в препарате клеток кумулюса. И хотя при проведении процедуры ИКСИ оплодотворение ооцитов производится после энзимного удаления клеток кумулюса, оценка качества клеток сводится в основном к определению степени зрелости ооцита (стадия зародышевого пузырька – GV, метафазы I или метафазы II). Даже при наличии грубых морфологических аномалий все зрелые ооциты на стадии MII подвергаются процедуре ИКСИ. При этом потенциал развития эмбрионов оценивается исключительно по морфологии самого эмбриона, без связи с качеством ооцита, из которого данный эмбрион был получен. Нельзя не отметить, что морфологической оценке ооцитов уделяется меньше внимания, чем выбору сперматозоидов для проведения ИКСИ или анализу эмбрионов в процессе культивирования.
Применение контролируемой стимуляции функции яичников дополнительно усложняет ситуацию. Созревание ооцита in vivo является результатом длительной и тщательной селекции. Стимуляция функции яичников подавляет естественную селекцию и приводит к созреванию заведомо аномальных ооцитов, которые физиологически должны были подвергнуться апоптозу.
Созревание ооцита включает в себя два взаимосвязанных процесса: созревание ядра и цитоплазмы. В процессе мейоза в ооците структура ядра меняется, исчезает ядерная мембрана, микротрубочки организуют биполярное веретено деления, и хромосомы выстраиваются на экваторе клетки. После того как происходит первое мейотическое деление, первое полярное тельце отделяется и входит в перивителлиновое пространство клетки. Затем начинается второе мейотическое деление, которое останавливается на стадии метафазы II. Данный процесс известен как созревание ядра ооцита. Синхронное созревание ядра и цитоплазмы необходимо для успешного оплодотворения клетки и формирования эмбриона, способного к дальнейшему развитию и имплантации.
Распространенность морфологических аномалий ооцитов по данным разных авторов достигает 50% [3]. Аномалии строения ооцитов (дисморфизмы) классифицируются на две группы: цитоплазматические и экстрацитоплазматические. К цитоплазматическим относятся повышение гранулярности цитоплазмы, повышение вакуолизации, скопление гладкого эндоплазматического ретикулума (ГЭР), а также наличие разнообразных цитоплазматических включений. Получены данные о том, что данная группа аномалий является признаком цитоплазматической незрелости клетки, а значит, наличие таких аномалий влияет на оплодотворение ооцита и дальнейшее развитие эмбриона. К экстрацитоплазматическим аномалиям относят изменение ширины перивителлинового пространства, наличие гранулярности в перивителлиновом пространстве, темный цвет прозрачной оболочки, а также особенности строения первого полярного тельца. Остается спорным вопрос, влияют ли данные аномалии на частоту оплодотворения, развитие эмбриона и способность его к имплантации.
В качестве возможных факторов риска появления дисморфизмов ооцитов рассматриваются возраст женщины, генетические нарушения, причина бесплодия, а также наличие метаболических нарушений (избыточная масса тела и ожирение) и гинекологических заболеваний (наружный генитальный эндометриоз, синдром поликистозных яичников, ановуляция) [4, 5]. При этом данных за четкую связь между указанными факторами и появлением у пациенток дисморфизмов ооцитов нет.
Особое внимание уделяется влиянию различных протоколов стимуляции функции яичников в программах ЭКО на качество ооцитов. В крупном ретроспективном когортном исследовании были получены данные о том, что длительность стимуляции функции яичников четко коррелирует с качеством ооцитов и эмбрионов 3 суток культивирования: если длительность стимуляции функции яичников меньше девяти дней, фрагментация бластомеров эмбрионов значительно выше [6]. Учитывая, что длительность стимуляции функции яичников связана с длительностью собственного менструального цикла пациентки, которая в свою очередь уменьшается с возрастом или при снижении овариального резерва, можно провести параллель между данными состояниями и качеством эмбрионов. В другом проспективном рандомизированном исследовании связи между различными протоколами стимуляции функции яичников и качеством полученных ооцитов отмечено не было [4].
Активация собственного генома эмбриона человека происходит на 3-и сутки после оплодотворения на 8-клеточной стадии, когда начинают работать более 4000 генов, которые обеспечивают дальнейшее дробление, компактизацию, формирование бластоцисты, имплантацию и все последующее развитие эмбриона [7]. Однако до этого момента важны накопленные в течение оогенеза продукты — мРНК, протеины, субстраты, питательные вещества, которые аккумулируются в ооците. Именно поэтому для оплодотворения и развития эмбриона существенное значение имеет качество женских половых клеток, в том числе полученных при стимуляции суперовуляции в рамках циклов ВРТ.
Цитоплазматические дисморфизмы ооцитов
К наиболее часто встречающимся цитоплазматическим дисморфизмам ооцитов относят центральную гранулярность цитоплазмы, наличие в цитоплазме вакуолей, липофусциновых гранул, а также агрегатов ГЭР.
Центральная гранулярность цитоплазмы является особенностью строения ооцита и представляет собой крупную темную губчатую зернистую область в цитоплазме. Распространенность данного варианта дисморфизма составляет около 30–35% [8, 9]. Основным фактором риска появления данной аномалии ооцитов считался возраст женщины [10], но эти данные не получили подтверждения в последующих исследованиях [11]. Связи между данным дисморфизмом и различными протоколами стимуляции функции яичников также не было отмечено [8, 11]. Зрелые ооциты с гранулярностью цитоплазмы имеют более кислую внутриклеточную среду, а также низкое содержание АТФ в клетке [10], что, по мнению авторов, связано с гипоксией фолликулов в процессе фолликулярного роста.
Существуют противоположные мнения, влияет ли гранулярность цитоплазмы ооцитов на частоту оплодотворения клеток и качество полученных эмбрионов, а также на частоту имплантации [9, 11–13]. При этом во всех исследованиях отмечалась существенно более низкая частота наступления развивающихся беременностей, не превышающая 10%. По данным генетического исследования частота анеуплоидии в бластомерах эмбрионов, полученных путем оплодотворения ооцитов с центральной гранулярностью, достигает 52% [9, 14], что может объяснить высокую частоту прерываний беременности.
Вакуоли представляют собой цитоплазматические включения, окруженные мембраной и заполненные жидкостью, иногда содержащие дегенерирующие органеллы клетки (лизосомы или митохондрии). Вакуоли могут появляться в ооците или бластомерах на любой стадии развития, быть единичными или многочисленными. Размер вакуолей широко варьирует. Появление вакуолей может быть как спонтанным во время созревания ооцита, когда происходит выделение первого полярного тельца, так и искусственным после проведения ИКСИ. Жидкость, заполняющая вакуоли, по составу близка содержимому перивителлинового пространства. Часто вакуоли можно обнаружить в дегенеративных и незрелых ооцитах, распространенность вакуолизации в зрелых ооцитах МII невысока и составляет около 3–4% [8, 15]. Факторы риска появления данного дисморфизма ооцитов не определены.
Потенциал дальнейшего развития ооцитов и эмбрионов с вакуолями значительно снижен. Частота оплодотворения ооцитов с данным дисморфизмом ниже, чем в контрольной группе (49 по сравнению с 65%), и зависит от количества и размера вакуолей [15, 16]. Оплодотворение ооцита отсутствует, если размер вакуолей превышает 14 мкм. По мнению исследователей, занимающихся этой проблемой, крупные вакуоли смещают веретено деления, а также нарушают архитектонику цитоплазмы (приводят к смещению микротрубочек), что препятствует нормальному движению пронуклеусов. Наличие вакуолей в ооцитах также оказывает неблагоприятное воздействие на развитие эмбриона. Такие эмбрионы реже достигают стадии бластоцисты, либо формируется бластоциста низкого качества [15].
Липофусциновые тельца (липофусциновые гранулы) состоят из смеси липидов и плотного материала гранул. Они могут обнаруживаться на различных стадиях созревания ооцитов. Основную роль играет размер гранул: доказано, что наличие липофусциновых телец размеров более 5 мкм сопровождается снижением частоты оплодотворения и развития эмбрионов до стадии бластоцисты [17].
Скопление ГЭР представляет собой круглые гладкие прозрачные диски, находящиеся, как правило, в центре ооцита. Данный вариант дисморфизмов наблюдается только в зрелых ооцитах на стадии МII, распространенность его составляет 0,5–2% [8, 18].
Появление агрегатов ГЭР снижает вероятность оплодотворения клетки и потенциал развития эмбриона [18–20]. В процессе оплодотворения проникновение сперматозоида в ооцит запускает цепь реакций, тесно связанных с метаболизмом внутриклеточного кальция. Выброс кальция необходим для протекания кортикальной реакции, завершения мейоза и формирования пронуклеусов. Более того, способность оплодотворенного ооцита развиваться до стадии бластоцисты регулируется именно амплитудой выброса кальция. В клетке основной органеллой, накапливающей кальций, служит ГЭР, поэтому изменения внутриклеточного распределения данной органеллы могут влиять на выброс кальция, оплодотворение, а также ранние этапы эмбриогенеза. При этом если в процессе оплодотворения не происходит разрыва ГЭР, дальнейшее развитие клетки не нарушается.
Есть данные о том, что появление агрегатов ГЭР коррелирует с высоким уровнем эстрадиола сыворотки крови пациентки в день введения триггера овуляции (по сравнению с женщинами, имеющими морфологически нормальные ооциты) [19]. Ооциты с данным дисморфизмом чаще встречаются в «коротких» протоколах стимуляции функции яичников, при этом не зарегистрировано появления таких ооцитов в циклах без стимуляции функции яичников [19, 20]
Наличие агрегатов ГЭР в ооцитах коррелирует с низкой частотой оплодотворения, низким качеством полученных эмбрионов, при этом эмбрионы редко достигают стадии бластоцисты, реже наступает имплантация и развивающаяся беременность [18–20]. Помимо эмбриологических аспектов, наличие агрегатов ГЭР в ооцитах ассоциировано с частыми акушерскими осложнениями: наблюдается более высокая частота преждевременных родов и рождения детей с серьезными пороками развития, более низкий вес новорожденных [18–20].
По данным генетического исследования, частота анеуплоидии в бластомерах эмбрионов достигает 37% [14].
Большинство авторов рекомендуют отказаться от оплодотворения ооцитов с агрегатами ГЭР, учитывая все вышеописанные факторы [19, 20].
Экстрацитоплазматические дисморфизмы ооцитов
К наиболее часто встречающимся экстрацитоплазматическим дисморфизмам ооцитов относят увеличение перивителлинового пространства, наличие гранулярности (дебриса) в перивителлиновом пространстве, особенности формы и размера ооцита, наличие фрагментации первого полярного тельца, а также аномалии строения прозрачной оболочки ооцита.
Перивителлиновое пространство ооцитов человека может варьировать по размеру, а также по наличию или отсутствию гранулярности (дебриса). Наличие дебриса часто сочетается с увеличенным перивителлиновым пространством. Распространенность увеличенного перивиллинового пространства ооцитов составляет около 32% [8].
Факторы риска появления данного дисморфизма ооцитов неизвестны, при этом существует гипотеза, что риск его появления увеличивается с возрастом женщины, но эта гипотеза пока не получила подтверждения.
Гранулярность перивителлинового пространства наблюдается только в зрелых ооцитах на стадии МII. Причины появления данного дисморфизма ооцитов неизвестны. Существует гипотеза, что наличие гранулярности в перивителлиновом пространстве связано с преждевременным экзоцитозом секреторных гранул при больших дозах гонадотропинов в циклах ЭКО [21].
Большинство исследователей считают, что наличие увеличенного перивителлинового пространства и дебриса в нем не влияет на частоту оплодотворения, развитие эмбриона и его способность к имплантации [21–24]. Существует мнение, что увеличенное перивителлиновое пространство и наличие в нем дебриса коррелируют с образованием эмбрионов низкого качества, но при этом данные дисморфизмы не влияют на частоту имплантации и процент клинических беременностей [25].
Наконец, в других исследованиях ооциты с широким перивителлиновым пространством и дебрисом имеют более низкую частоту оплодотворения [12, 26], имплантации и клинических беременностей [27]. Частота генетических нарушений в клетках с дебрисом в перивителлиновом пространстве не отличается от таковой в морфологически нормальных ооцитах. При этом в ооцитах с увеличенным перивителлиновым пространством несколько повышена частота анеуплоидий 18-й хромосомы [28].
Нормальный ооцит человека имеет правильную круглую форму, его размер около 150 мкм. Распространенность ооцитов овальной формы составляет около 2% [8]. Наличие данного дисморфизма не влияет на частоту оплодотворения и ранние этапы эмбриогенеза [8, 22, 29], а также на частоту имплантации и процент клинических беременностей [25]. По данным генетического исследования, частота анеуплоидии в ооцитах овальной формы не отличается от нормы [30].
В редких (0,3%) случаях размер ооцита на 30% превышает норму и составляет около 200 мкм, такие ооциты принято называть гигантскими. Неоплодотворенные гигантские ооциты, по всей видимости, являются диплоидными, следовательно, после оплодотворения в них обнаруживается три пронуклеуса – это феномен известен под названием «триплоидия вследствие дигинии» [31]. Образующиеся зиготы способны к нормальному дроблению и развитию до стадии бластоцисты. Несмотря на это, в связи с наличием хромосомной патологии не рекомендуется переносить такие бластоцисты во избежание случаев невынашивания беременности [31, 32].
По наличию первого полярного тельца в циклах ИКСИ можно судить о готовности ооцита к оплодотворению. Только ооциты на стадии профазы I второго мейотического деления (MII) пригодны для оплодотворения методом ИКСИ. Существуют различные аномалии первого полярного тельца: фрагментация, увеличение размера, нарушение формы.
Распространенность фрагментации первого полярного тельца достигает 50%, а других аномалий – около 4% [8]. Фрагментация первого полярного тельца, по данным исследований, не влияет на частоту оплодотворения и качество полученных эмбрионов [8, 33], хотя есть данные, что такие эмбрионы развиваются несколько хуже [10]. При наличии других аномалий строения (гигантское или дегенеративное первое полярное тельце) снижается частота оплодотворения, но сохраняется нормальная морфология пронуклеусов [8]. Предполагается, что наличие дегенеративного первого полярного тельца является признаком асинхронности процессов созревания в ядре и цитоплазме, что объясняет низкий процент оплодотворения таких клеток. Гигантское первое полярное тельце отображает дислокацию мейотического веретена деления в клетке. Таким образом, ооциты с наличием данных аномалий строения имеют сниженный потенциал к оплодотворению, но если оплодотворение произошло, дальнейшее развитие таких эмбрионов не нарушено.
Зона пеллюцида, или прозрачная оболочка – внешняя оболочка ооцита, конгломерат из гликопротеинов, синтезируемых и секретируемых растущим ооцитом и клетками гранулезы, который утолщается по мере роста ооцита. В норме толщина прозрачной оболочки варьирует от 10 до 31 мкм и не зависит от диаметра цитоплазмы. Распространенность аномалий строения прозрачной оболочки составляет около 4–5% [8].
При утолщении прозрачной оболочки может нарушаться проникновение сперматозоида в яйцеклетку. Известно, что лучше всего оплодотворяются ооциты, имеющие толщину прозрачной оболочки не более 18,6 мкм. На развитие эмбриона после проведения оплодотворения методом ИКСИ толщина прозрачной оболочки влияния не оказывает [34]. Не получено данных о том, что темный цвет прозрачной оболочки негативно влияет на частоту оплодотворения, качество эмбрионов и частоту имплантации [29].
Увеличенное двойное лучепреломление внутреннего слоя прозрачной оболочки коррелирует с высокой эффективностью программ ВРТ, в том числе с частотой оплодотворения и качеством эмбрионов [35, 36]. При использовании ооцитов с высоким лучепреломлением внутреннего слоя прозрачной оболочки увеличивается процент развивающихся беременностей, при этом низкое светопреломление коррелирует с высокой частотой прерываний беременностей на раннем сроке [35–37].
Изучение патологии ооцитов человека является важной задачей, решение которой может повысить эффективность программ ВРТ, повысить процент наступления развивающихся беременностей и рождения здоровых детей. Неинвазивная оценка качества ооцитов – первый шаг в селекции эмбрионов для переноса в полость матки. Учитывая наличие контраверсий в изучении различных вариантов дисморфизмов ооцитов и их влиянии на исходы программ ВРТ, необходимо проведение дальнейших исследований в данном направлении.
