Diagnostic significance of determining the level of extracellular fetal DNA in pregnant women with preeclampsia and fetal growth restriction

Преэклампсия (ПЭ) и задержка роста плода (ЗРП) являются актуальными проблемами акушерства и занимают одно из ведущих мест в структуре перинатальной заболеваемости и смертности [1, 2]. Единые механизмы развития данных осложнений беременности могут приводить к развитию ЗРП у беременных с ПЭ. Несмотря на то что на данный момент нет однозначных представлений об этиологии и патогенезе ПЭ и ЗРП, предполагается, что центральную роль в их развитии играет недостаточность плаценты [3], в основе которой лежит неполноценная инвазия вневорсинчатого хориона. Неполное преобразование спиральных артерий приводит к сохранению их способности отвечать на вазоконстрикторные агенты и вызывает снижение маточно-плацентарной перфузии [4, 5], что приводит к усиленной скорости материнского кровотока и развитию оксидативного стресса [6]. Данные изменения приводят к нарушению кровотока в системе «мать-плацента-плод». Для оценки резистентности маточно-плацентарного кровотока и выявления групп риска по развитию ПЭ и ЗРП в настоящее время применяют допплерометрию маточных артерий [7, 8]. Для оценки динамики роста плода используют ультразвуковую фетометрию с расчетом предполагаемой массы плода, согласно распространенным формулам S. Warsof, F. Hadlock, В.Н. Демидова [9–12]. Для оценки фетоплацентарного кровотока используется сканирование кровотока артерии пуповины, которое играет важную роль в тактике ведения беременных с ЗРП [13–16]. Однако чувствительность и специфичность данных методов недостаточны для точного прогнозирования перинатальных исходов [16]. В связи с вышеизложенным, ЗРП в 75% случаев диагностируется постнатально [11].

Таким образом, актуальным остается вопрос поиска новых диагностических тестов, обладающих достаточной чувствительностью и специфичностью, которые обеспечивали бы не только раннюю диагностику ЗРП, но и позволяли своевременно выявить группы риска по развитию данного осложнения беременности. Обнаружение внеклеточной фетальной ДНК (фДНК) в плазме и сыворотке крови беременных способствовало дальнейшему изучению последнего как потенциального маркера для неинвазивной диагностики акушерских осложнений [17–19]. Биологические процессы, лежащие в основе попадания внеклеточной фДНК в материнский кровоток, остаются неясными. При этом наиболее вероятной причиной рассматриваются апоптоз и некроз клеток трофобласта. Таким образом, внеклеточная фДНК представляет собой фрагменты ДНК плода и плаценты, циркулирующие в межклеточной среде организма [20]. Для отделения фДНК от общей, перспективным представляется использование гена опухолевого супрессора RASSF1A (Ras association domain family 1A), который гиперметилирован в плаценте и гипометилирован в материнской клетке крови [19, 21]. Следовательно, количественная оценка уровня фДНК в материнской плазме может быть актуальной в качестве нового маркера для неинвазивной пренатальной диагностики акушерских осложнений.

Цель исследования – оценить диагностическую значимость определения внеклеточной фДНК в плазме крови беременных с ПЭ и ЗРП.

Материалы и методы

В исследование были включены 55 беременных женщин, которые поступили и были родоразрешены в ФГБУ «НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова» Минздрава России. Женщин разделили на 3 группы: 1-я группа – беременные с ПЭ и ЗРП, 2-я – пациентки с ПЭ, у которых не была диагностирована ЗРП, и 3-я (сравнения) – женщины с физиологически протекающей беременностью. Численность групп составила соответственно 17, 19 и 19 женщин. Диагноз ЗРП пренатально был поставлен на основании ультразвукового и допплерометрического исследования и подтвержден постнатально согласно центильным таблицам ВОЗ для доношенных и таблицам Фентона для недоношенных детей [22]. Группа сравнения была сформирована из соматически здоровых женщин без отягощенного акушерского анамнеза и осложненного течения беременности. Исследование одобрено этическим комитетом, всеми пациентками подписано информированное согласие на участие в данном исследовании.

Критерии включения: одноплодная беременность, отсутствие резус-конфликта, тяжелых экстрагенитальных заболеваний, а также трансплантации внутренних органов в анамнезе. Критерии исключения: инфекционные заболевания, обострения хронических воспалительных заболеваний, использование донорской яйцеклетки, миома матки больших размеров. Забор венозной крови для определения уровня внеклеточной фДНК производился до начала родовой деятельности. Для количественного определения внеклеточной фДНК использовали образцы периферической венозной крови с этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА), получали плазму методом двойного центрифугирования (200 и 4500g) и выделяли фДНК из плазмы, используя набор с магнитными частицами («Силекс»). Далее ДНК обрабатывали с помощью метилчувствительных рестриктаз. Количественную оценку фДНК проводили с помощью полимеразной цепной реакции. Последовательности праймеров и условия проведения реакции опубликованы нами ранее [23]. Для расчета уровня значимости между исследуемыми группами сравнительный анализ проводился с использованием критерия Манна–Уитни. Для оценки достоверности разницы двух средних показателей использовался t-критерий Стьюдента. Полученные данные представлены в виде медианы и интерквартильного размаха (1-й и 3-й квартили), средней величины и доверительного интервала. Для определения диагностической эффективности исследуемой модели использовался ROC-анализ. Для статистической обработки данных использовались программы Attestat и Origin.

Результаты

Средний возраст женщин составил 34,8±1,2; 30,1±1,1; 29,3±1,0 года (по группам соответственно). Анализ антропометрических данных не выявил статистически значимых различий между группами. Также нам не удалось обнаружить связь с такими принятыми факторами риска развития ПЭ и ЗРП, как угроза прерывания и кровотечение в течение данной беременности. При сравнении 1-й и 2-й групп с группой сравнения были выявлены 3 фактора риска развития данных осложнений: возраст, наличие экстрагенитальной патологии и паритет. Также следует отметить высокую частоту развития ПЭ без ЗРП среди первородящих пациенток. Клинико-анамнестические данные женщин представлены в таблице.

Исследование уровня фДНК в плазме крови беременных показало, что в группе беременных с ПЭ и ЗРП (1-я группа) уровень фДНК достоверно выше, независимо от показателей допплерометрии, по сравнению с группой женщин с ПЭ (2-я группа) и группой сравнения (3-я группа). Для беременных с ПЭ и ЗРП, у которых были выявлены нарушения фетоплацентарного кровотока, концентрация фДНК составила 284 ГЕ/мл (137; 616), для беременных без нарушений кровотока концентрация фДНК была 339 ГЕ/мл (201; 350). В группе пациенток с ПЭ (2-я группа) концентрация фДНК составила 79 ГЕ/мл (51; 189), в группе сравнения (3-я группа) – 25 ГЕ/мл (14; 44) (рис. 1). Достоверное увеличение уровня фДНК в 1-й и 2-й группах, по сравнению с 3-й группой (р<0,0001), полученное в данном исследовании, также ранее было описано в других работах [19, 24]. Кроме того, обнаружены достоверные различия между группой женщин с ПЭ (2-я группа) и подгруппой беременных с нарушениями фетоплацентарного кровотока (р=0,007), а также с подгруппой беременных без нарушений фетоплацентарного кровотока (р=0,005). Полученные результаты показывают, что уровень фДНК в плазме крови беременных является перспективным маркером для оценки степени риска развития ЗРП при ПЭ, независимо от показателей допплерометрии.

Для оценки диагностической эффективности количественного определения фДНК при ПЭ и ЗРП без нарушений фетоплацентарного кровотока был проведен ROC-анализ с оценкой площади под ROC-кривой, которая составила 89,47 (95% ДИ 70–100). При пороговом значении ДНК 201 ГЕ/мл чувствительность составила 80%, специфичность – 89%. Следовательно, используя данную модель для диагностики ЗРП при нормальных значениях фетоплацентарного кровотока, можно при специфичности 89% диагностировать наличие ЗРП у 80% беременных женщин с ПЭ (рис. 2).

Обсуждение

В настоящее время актуальным остается вопрос поиска новых диагностических методов, обладающих достаточной чувствительностью и специфичностью, которые обеспечивали бы не только раннюю диагностику ПЭ и ЗРП, но и выявляли группы риска по развитию данных осложнений беременности для обеспечения более эффективных ранних профилактических мер. Так, в работе E. Litwińska и соавт. [25] в качестве раннего предиктора ПЭ и ЗРП предлагают в комбинации с данными допплерометрии использовать такие биохимические маркеры крови, как фактор роста плаценты (PlGF), плазменный протеин, ассоциированный с беременностью (PAPP-A), и свободную β-субъединицу хорионического гонадотропина, которые изменяются при патологических состояниях во время беременности и косвенно отражают состояние плода и плаценты. R. Muñoz-Hernández и соавт. [26] в качестве предиктора ПЭ и его тяжести в комбинации с уровнем фДНК также предлагают исследовать биомаркеры повреждения клеток, ангиогенеза и антиангиогенеза (эндоглин, растворимая форма рецептора эндотелиального фактора роста сосудов и фактора роста плаценты). В работе R. Smid и соавт. [27] была обнаружена достоверная корреляция между уровнем фДНК и нарушением кровотока в пупочной артерии. Авторы предположили, что, наряду с допплерометрией, нарушения которой являются маркерами плацентарной недостаточности и хронической гипоксии, уровень фДНК также может служить маркером разрушения плаценты и, соответственно, использование этих двух параметров одновременно позволит своевременно диагностировать ЗРП во II и III триместрах беременности. В данном исследовании мы также обнаружили корреляцию между уровнем фДНК и нарушением кровотока по данным допплерометрии, что согласуется с ранее описанными в литературе данными [27, 28].

На сегодняшний день достаточно много работ, в которых исследовали динамику накопления фДНК при беременностях, осложнившихся ПЭ и ЗРП. Ранее мы показали, что уровень фДНК относительно стабилен до 26 недель гестации и значительно возрастает по второй половине беременности [23]. M. Alberry и соавт. [3] было показано, что уровень фДНК увеличивается с гестационным сроком, и его уровень достоверно выше при ПЭ и ЗРП, по сравнению с нормальной беременностью. Кроме того, уровень фДНК является маркером плацентарной недостаточности при сочетании ПЭ и ЗРП, и достоверное увеличение уровня фДНК наблюдается после 28 недель беременности [28]. В нашей работе также было обнаружено, что в III триместре беременности уровень фДНК достоверно выше в группах беременных с ПЭ и ПЭ в сочетании с ЗРП, по сравнению с группой сравнения. Полученные нами данные об увеличении фДНК при осложненной беременности согласуются с ранее описанными результатами в литературе [24, 26].

Невозможно оставить без внимания работы, в которых исследователи не находили связи между уровнем фДНК и осложнением беременности при ПЭ и ЗРП [29–31]. Очевидно, это связано с методическими сложностями, с которыми исследователи столкнулись при постановке методики количественного определения уровня фДНК.

Заключение

Таким образом, изложенные выше данные показывают, что содержание фДНК в III триместре позволяет диагностировать ЗРП у беременных с ПЭ как с нарушенными, так и с нормальными показателями допплерометрии. Кроме того, уровень фДНК наряду с другими методами оценки состояния плода помогает выбрать оптимальный срок родоразрешения с целью предотвращения ухудшения состояния плода и осложнений в постнатальном периоде. Полученные результаты демонстрируют перспективность определения уровня фДНК в сочетании с такими инструментальными методами исследования, как ультразвуковая фето- и допплерометрия, для выявления группы риска по развитию ЗРП у беременных с ПЭ.