Заболеваемость раком шейки матки (РШМ) в Российской Федерации с 2005 по 2015 гг. возросла на 24,47% случаев, составив 21,27 случая на 100 000 населения в 2015 году [1]. Неблагоприятные эпидемиологические тенденции РШМ диктуют необходимость совершенствования методов ранней диагностики на новом технологическом уровне с внедрением в клиническую практику последних достижений молекулярной биологии.
По данным отечественной литературы даже изолированное тестирование мРНК гена р16 (INK4a) методом количественной полимеразной цепной реакции (ПЦР) (в материале традиционного соскоба шейки матки) может быть использовано в качестве дополнительного маркера прогнозирования распространенных поражений шейки матки [2].
Дифференциально-диагностическая панель маркеров для оценки цервикальной интраэпителиальной неоплазии (CIN) и РШМ должна включать комплексный анализ экспрессии мРНК BCL-2, BAG, циклина В1, Ki-67 и рецепторов эстрогена [3]. Однако указанные исследования, как и большинство других, проведены на образцах биопсийного и операционного материала. В настоящее время особый интерес вызывает возможность анализа нуклеиновых кислот и в особенности РНК в материале, получаемом для жидкостной цитологии.
В литературе описан целый ряд работ, в которых указывается на возможность проведения таких исследований. M. Del Pino и соавт. (2015) впервые сообщили об обнаружении мРНК клеточных биомаркеров в материале консервирующей жидкости флакона с образцом Пап-теста ThinPrep [4]. Исследователи отмечают, что сочетанная оценка TOP2A и CDKN2A/р16 в данном материале обладает достаточным соотношением чувствительности и специфичности для выявления женщин с высокой степенью плоскоклеточного интраэпителиального поражения (HSIL). H.Y. Wang и соавт. (2015) на основе комплексной оценки уровней мРНК онкопротеинов Е6 и Е7 вируса папилломы человека (ВПЧ) и белка теломеразной обратной транскриптазы человека (hTERT) в материале флакона Пап-теста ThinPrep (545 образцов) приходят к выводу, что сочетанная оценка указанных маркеров может использоваться взаимодополняющим образом при диагностике поражений шейки матки высокой степени злокачественности, а также являться прогностическим маркером при мониторинге заболеваний шейки матки низкой степени злокачественности [5].
Таким образом, определение мРНК в материале консервирующего раствора Пап-теста с использованием количественной ПЦР позволит расширить возможности дифференциальной диагностики CIN различной степени тяжести, рака in situ и инвазивного РШМ.
Цель исследования – оценить возможность проведения дифференцировки пациенток с CIN 2+ и CIN1 на основе экспрессии 21-генной панели мРНК методом количественной ПЦР в материале консервирующей жидкости флакона с образцами Пап-теста CellPrep.
Материал и методы исследования
В исследование включены 59 пациенток, проходивших лечение в ФГБУ РНЦРР Минздрава России в 2015–2016 гг.
Для всех образцов проводили ретроспективный анализ материала консервирующей жидкости флакона с образцом Пап-теста CellPrep (Biodyne Co., LTD, Корея). Забор материала для цитологического исследования выполнялся при помощи набора расходных материалов для диагностики онкологических заболеваний шейки матки (Biodyne Co., LTD, Корея).
Подготовка тонкослойных цитологических препаратов из материала флакона с консервирующим раствором выполнена при помощи процессора для приготовления препаратов для тонкослойного цитологического исследования CellPrep Plus 4.63 (Biodyne Co., LTD, Корея). После фиксации в течение 30 минут в 95% растворе этанола окрашивание стеклопрепаратов по Папаниколау выполнено на Autostainer Leica XL (Leica Microsystems Nussloch GmbH) с использованием красителей Leica Surgipath EA-50, OG6, гематоксилин Гарриса. Категоризация цитологических заключений выполнена согласно классификации Bethesda.
Уровень экспрессии мРНК 21 гена (Ki-67, STK-15, CCNB1, CCND1, MYC, MYBL2, P16INK4A, PTEN, BIRC5, BCL2, BAG1, TERT, NDRG1, ESR1, PGR, HER2, GRB7, MGB1, MMP11, CTSL2, CD68) определяли методом количественной ПЦР, описанным ранее с использованием наборов ЗАО «ДНК технология» [6]. Критерием достоверности были результаты сопоставления с плановым гистологическим исследованием биопсийного и операционного материала. Гистологические заключения давались в соответствии с гистологической классификацией опухолей женской половой системы (ВОЗ, 2003 г.) [7].
Хранение материала до начала исследования осуществляли при температуре 4°С.
Статистическую обработку результатов исследования проводили с использованием метода дискриминантного анализа. Различие групп считали статистически значимым при Р<0,05. Обработку полученных результатов проводили в программном пакете Statistica 7.0 (Stat Soft, США).
Распределение пациенток по возрасту и гистологическим заключениям представлено в табл. 1.
Результаты исследования и обсуждение
Во всех 59 (100%) случаях методом количественной ПЦР определена экспрессия мРНК 24 генов, включая 3-хаускипинга, в материале консервирующей жидкости флакона с образцами Пап-теста CellPrep (табл. 2).
Анализ полученных результатов экспрессии 21 гена выявил достоверные отличия уровней экспрессии большей части исследованных генов в группах CIN 2+ и CIN1 или менее. Так, пошаговый дискриминантный анализ свидетельствует, что использование полученного алгоритма, включающего оценку уровней экспрессии мРНК 17 генов (ESR1, MYBL2, CD68, PTEN, CCND1, BCL2, HER2, MMP11, TERT, STK15, P16INK4A, BAG1, CTSL2, KI67, CCNB1, GRB7, NDRG1) позволяет с точностью до 98,3% случаев провести дифференцировку групп CIN 2+ и CIN1 или менее. Совпадение классификации с данными гистологического исследования для группы CIN2+ составило 100,0% случаев, а для группы с гистологически подтвержденной CIN1 или менее – 96,0% случаев.
В 1 случае гликогеновой дистрофии значения молекулярно-биологических параметров ошибочно отнесли наблюдение к группе CIN 2+ при совпадении данных цитологического и гистологического исследования.
Итоги анализа дискриминантных функций выявили, что наибольшее значение на правильность классификации оказывает оценка мРНК экспрессии генов ESR1, CD68, PTEN, CCND1, BCL2, HER2, STK15, BAG1.
Нашей задачей было оптимизировать практическое применение полученных данных для будущего практического использования. Пошаговый дискриминантный анализ мРНК 21 гена с исключением оставляет 2 переменных в модели, позволяющих дифференцировать CIN2+/CIN1 или менее с суммарной точностью 86,44% случаев (табл. 3).
Достоверное снижение экспрессии рецепторов эстрогена характеризовало группу с гистологически установленными изменениями не менее чем CIN2+ (p=0,00001). Наши результаты согласуются с данными I. Zhai и соавт. (2010), отмечающими низкий уровень экспрессии ESR1 в большинстве случаев инвазивного РШМ в сравнении с неинвазивными цервикальными изменениями [8].
Помимо оценки экспрессии мРНК рецепторов эстрогена α, модель включает оценку экспрессии мРНК гена MYBL2, являющегося членом семейства протоонкогенов MYB, участвующих в пролиферации и контроле клеточной дифференцировки. Группа CIN2+ характеризуется более выраженной экспрессией данного маркера (p=0,001433).
K. Astbury и соавт. (2011) выявили гиперэкспрессию MYBL2 при помощи TaqMan ПЦР в клеточных линиях РШМ [9]. Авторы отмечают, что при иммуногистохимическом исследовании окрашивание с антителами к MYBL2 преимущественно отсутствует в нормальном эпителии шейки матки при выраженной позитивной экспрессии в CIN и инвазивном РШМ, позволяя относить оценку его экспрессии к потенциальным биомаркерам РШМ.
Использование сочетанной оценки экспрессии только двух генов ESR1 и MYBL2 позволяет верно классифицировать группу CIN2+ в 88,24% случаев, а группу CIN1 или менее – в 84,0% случаев. С точки зрения практической реализации внедрение данной двугенной модели, как дополнительной тест-системы, представляется наиболее перспективным в практике плановых и скрининговых обследований.
Заключение
Таким образом, в данной работе впервые показана возможность анализа экспрессии мРНК большой группы генов методом количественной ПЦР в материале жидкостной цитологии Пап-теста CellPrep. Полученные результаты оценки уровня экспрессии группы генов (всего проанализирована экспрессия 24 генов, из которых 3-хаускипинги, использованные для нормировки) позволили дифференцировать образцы на группы, соответствующие CIN 2+ и CIN1 или менее. Проведенный дискриминантный анализ показал, что в дифференциальную диагностику больший вклад вносит оценка экспрессии мРНК генов ESR1 и MYBL2 методом количественной ПЦР, что позволяет отличить группу CIN 2+ от группы CIN1 или менее с точностью 86,44% случаев. Следовательно, оценка экспрессии панели 21 генов, дополняющая морфологическую дооперационную диагностику предраковых процессов и РШМ по материалу жидкостной цитологии, позволяет с высокой точностью проводить дифференциальную диагностику патологических процессов шейки матки.
Дифференцированный подход ведения пациенток с CIN различной степени тяжести используется и представлен как консервативными, так и оперативными подходами. Выбор каждого метода должен быть строго обоснованным, особенно у пациенток репродуктивного возраста, ориентированных на органосохраняющее лечение. Молекулярно-биологическое тестирование по материалам жидкостной цитологии позволяет провести внутринозологическую диагностику и определить тактику дальнейшего лечения. Дополнительные исследования на большем объеме клинического материала позволят верифицировать пороговые значения экспрессии для каждого из анализируемых генов, что создаст дополнительный метод уточняющей дифференциальной диагностики клинически значимых изменений эпителия шейки матки, перспективный с точки зрения плановых и скрининговых исследований.
