Blocking effect of autologous serum in women with recurrent miscarriage

Krechetova L.V., Nikolayeva M.A., Vanko L.V., Golubeva E.L., Ziganshina M.M., Tetruashvili N.K., Vtorushina V.V., Sukhikh G.T.

Academician V.I. Kulakov Research Center of Obstetrics, Gynecology, and Perinatology, Ministry of Health of Russia, Moscow, Russian Federation
Objective. To investigate the blocking effect (BE) of sera from women with a history of recurrent miscarriage (RM) in their preparation for pregnancy and during pregnancy from its impact on the expression of the early activation marker CD69 by autologous lymphocytes stimulated by mitogen in vitro.
Subject and methods. The BE of the sera were determined by flow cytometry in 31 women with RM and 11 fertile women.
Results. After pregestation preparation using immunocytotherapy (ICT), pregnancy ended in the birth of a live baby in 17 women with RM and a miscarriage occurred in 5. During the current pregnancy, BE was minimal at 8-9 weeks gestation and then increased by the end of the second trimester and in the third trimester.
Conclusion. The assessment of the blocking activity of peripheral blood serum is seemingly promising for use as one of the laboratory criteria for the efficiency of pregestation preparation using ICT and as one of the indicators of threatened miscarriage in the women with RM at 8-9 weeks gestation.

Keywords

recurrent miscarriage
blocking effect (BE) of serum
CD69
flow cytometry

Работа поддержана грантом Президента НШ-366.2012.7.

Важным условием благополучного течения беременности является формирование толерантности к плоду, в частности путем блокирования иммунного ответа материнского организма на антигены плода отцовского происхождения. Наличие феномена иммуносупрессии, сопровождающей развитие нормальной беременности, определяется присутствием в сыворотке крови так называемых блокирующих факторов, среди которых имеются неспецифические и специфические [1–6]. Предполагается, что с недостаточным образованием в организме будущей матери блокирующих факторов может быть связано формирование различных осложнений гестации, в том числе и
самопроизвольное прерывание беременности на ранних сроках [7–9]. Особый интерес представляет изменение супрессивной активности сывороточных растворимых факторов у женщин с привычным невынашиванием под влиянием введения аллогенных лимфоцитов – иммуноцитотерапии (ИЦТ), используемой в предгестационной подготовке женщин с осложненным акушерским анамнезом [10, 11].

Основное внимание при изучении иммуносупрессии уделялось изучению антител, специфичных к аллоантигенам плода (антиотцовских антител), так как в ряде работ показано, что недостаточная аллогенная стимуляция материнской иммунной системы отцовскими антигенами вследствие совпадения у партнеров аллелей генов главного комплекса гистосовместимости HLA I и II класса может являться причиной невынашивания [12, 13]. Однако в настоящее время эта связь ставится под сомнение [14–16]. Поэтому большой интерес приобретает изучение феномена неспецифической иммуносупрессии, которая проявляется в подавлении (блокировании) митогенной активации лимфоцитов матери in vitro в присутствии аутологичной сыворотки.

До последнего времени анализ влияния сывороточных блокирующих факторов на пролиферативный ответ лимфоцитов, индуцированный митогенным стимулом, проводился по включению в синтезируемую ДНК радиоактивно меченного H3-тимидина [17, 18]. Охарактеризовать ответ на пролиферативный стимул можно также по появлению различных мембранных маркеров активации, например, по экспрессии поверхностного антигена CD69 методом проточной цитофлуориметрии [19–21]. Нами был предложен способ оценки блокирующего эффекта (БЭ) сыворотки по ее влиянию на экспрессию раннего маркера активации CD69 аутологичными лимфоцитами, стимулированными in vitro митогеном [22].

Цель настоящей работы – исследование БЭ аутологичной сыворотки на активацию лимфоцитов женщин с привычным невынашиванием в анамнезе при подготовке к беременности и в течение ее.

Материал и методы исследования

В контрольной группе было обследовано вне беременности 11 фертильных здоровых женщин
в возрасте от 25 до 38 лет, имеющих последнего ребенка не старше 2 лет.

В основной группе обследована вне беременности 31 женщина с тремя и более ранними потерями беременности в I триместре. В обследование включены женщины в возрасте от 20 до 42 лет, не имеющие в анамнезе урогенитальных инфекций, аутоиммунных, аллергических и эндокринных заболеваний, которым был поставлен диагноз привычного невынашивания беременности (ПНБ) неясного генеза.

При подготовке к беременности этим женщинам была назначена ИЦТ аллогенными клетками партнеров. Процедура ИЦТ заключалась во внутрикожном введении пациенткам в переднюю
часть предплечья 50 млн клеток лейкоцитарной взвеси партнеров на 5–9-й день менструального
цикла. Пациенток обследовали через месяц после процедуры ИЦТ. 3 женщины через 2–3 мес после двух процедур ИЦТ забеременели. При наступлении беременности ИЦТ повторяли в сроки 5, 9 и 12 нед.
17 женщин доносили беременность, у 5 произошел выкидыш на сроке 8–9 нед, у одной на сроке
9–10 нед беременность замерла. Представлены данные проспективного обследования.

Кровь у женщин для анализа брали натощак из локтевой вены в стерильные пробирки.
Мононуклеары (МНК) выделяли стандартным методом центрифугирования в градиенте плотности с использованием смеси фиколл-верографин плотностью 1,077. Сыворотку крови получали стандартным способом и для проведения анализа инактивировали нагреванием при 56ºС в течение 30 мин.

БЭ аутологичной сыворотки определяли вне беременности до и после ИЦТ, а также в 5, 8–9,
11–12, 15–17, 23–25 и 33–35 нед гестации по ингибированию экспрессии CD69 МНК периферической крови при стимуляции митогеном (фитогемагглютинином) in vitro в течение 72 ч [22]. Содержание живых МНК, экспрессирующих CD69 (CD69+), оценивали методом проточной цитофлуориметрии с использованием прямых меченных FITC-антител на цитофлуориметре FACScan (Becton-Dickinson, США). Для оценки жизнеспособности клеток использовали иодид пропидия.

Оценивали содержание СD69+ клеток после инкубации МНК в АВ- или аутологичной сыворотке и в безсывороточной среде. Рассчитывали процент ингибирования экспрессии CD69 как отношение содержания СD69+-клеток в образцах с АВ-сывороткой и аутологичной сывороткой к этому показателю в бессывороточной среде. БЭ аутологичной сыворотки определяли как разницу между процентом ингибирования экспрессии CD69 в присутствии аутологичной сыворотки и АВ-сыворотки.

Статистическую обработку данных проводили по общепринятым методам вариационной статистики. Данные представлены как среднее ± ошибка среднего. Соответствие выборок контрольной и основных групп пациенток нормальному распределению оценивали с помощью критерия Колмогорова–Смирнова с использованием пакета Statistica 6 для Windows XP. Значимость наблюдаемых отклонений средних значений измеренных параметров оценивали с помощью двухвыборочного t-критерия Стьюдента с различными дисперсиями для средних значений с использованием пакета статистического анализа для Microsoft Office Excel 2007. Для оценки диагностической значимости теста определения блокирующих свойств аутологичной сыворотки у женщин с невынашиванием беременности в анамнезе использовали ROC-анализ пакета MedCalc8 для Windows 7.

Результаты исследования и обсуждение

В настоящем исследовании анализировали БЭ аутологичной сыворотки пациенток с ПНБ, забеременевших после проведенной предгестационной подготовки с использованием ИЦТ.

До начала лечения БЭ сыворотки пациенток с ПНБ был сходен с БЭ сыворотки фертильных
женщин (рис. 1).

Рисунок 1. БЭ аутологичной сыворотки на митогенную активацию МНК женщин с ПНБ.

При подготовке к беременности женщинам с ПНБ были проведены два курса ИЦТ. После первой процедуры ИЦТ БЭ сыворотки снизился по сравнению со значением в контрольной группе
(р<0,05), но не с исходными значениями. После второй процедуры эти различия исчезли.

В течение I триместра беременности БЭ сыворотки пациенток, впоследствии доносивших беременность, в целом оставался сходным с контрольными и с исходными значениями, а также не
отличался от значений БЭ после второй ИЦТ, но отличался от значений после первой процедуры
ИЦТ (р<0,05).

БЭ сыворотки женщин с выкидышем в I триместре беременности существенно отличался от
значений БЭ сыворотки пациенток с доношенной беременностью (р<0,01) (рис. 1).

Рассчитана диагностическая значимость оценки БЭ сыворотки женщин с ПНБ в I триместре беременности: чувствительность теста при прогнозировании потери беременности составляла 100%,
специфичность – 46% в том случае, если БЭ был ниже 23,2%.

У 17 женщин в течение данной беременности, завершившейся рождением живого ребенка, прослежена динамика блокирующей активности сыворотки периферической крови. Во время беременности у этих пациенток наблюдались значительные изменения БЭ (рис. 2).

Динамика БЭ аутологической сывортоки на митогенную активацию МНК женщин с ПНБ

Максимальные значения БЭ наблюдались на ранних сроках беременности (5 нед) и на более поздних сроках беременности (23–25 нед и 33–35 нед). Резкое уменьшение БЭ было зарегистрировано на
сроке 8–9 нед, а при дальнейшем развитии беременности наблюдался плавный рост этого параметра.

Проспективное исследование блокирующей активности аутологичной сыворотки у женщин с ПНБ показало наличие динамики этого показателя и во время предгестационной подготовки с
использованием двух процедур ИЦТ, и в течение беременности. Установлено, что низкий уровень
блокирующей активности сыворотки на ранних сроках беременности является маркером угрозы
прерывания беременности: при условии БЭ<23,2% могут быть выявлены практически все пациенты с
угрозой выкидыша (чувствительность теста 100%). При этом с вероятностью 46% (специфичность теста 46%) в эту группу будут попадать и пациентки без такой угрозы. Однако, учитывая, что все женщины с ПНБ в анамнезе в течение I триместра обязательно получают соответствующую терапию, то те из них, у которых на фоне терапии БЭ<23%, должны рассматриваться как группа повышенного
риска. Дальнейшие исследования, как нам представляется, должны быть направлены на изучение
особенностей иммунной системы таких пациенток с ПНБ.

Полученные данные свидетельствуют о важной роли неспецифических растворимых факторов,
обусловливающих БЭ сыворотки при неосложненной беременности.

Ранее нами была показана высокая диагностическая ценность определения БЭ у женщин с ПНБ
вне беременности до назначения лечения [23]. В настоящем исследовании после проведения
предгестационной подготовки с использованием ИЦТ в группе женщин с доношенной беременностью динамика БЭ показала тенденцию к снижению его значений (рис. 1), поэтому выявленный характер динамики БЭ можно связать с «нормализацией» этого показателя после ИЦТ.

Динамика блокирующей активности сыворотки у женщин с доношенной данной беременностью также отмечена в течение I триместра. На сроке 5 нед беременности зарегистрирован максимально высокий уровень блокирующей активности сыворотки в сравнении с последующими периодами I триместра. В работе по оценке значения ИЦТ в оптимизации программы ЭКО у супружеских пар с совместимостью по
антигенам HLA-системы также было показано, что увеличение БЭ после ИЦТ является важным
для прогнозирования успеха имплантации перенесенного после ЭКО эмбриона [24].

Данные о динамике блокирующей активности сыворотки в течение I триместра у женщин с доношенной беременностью подтверждают значимость при имплантации высокого уровня иммуносупрессии. На сроке 8–9 нед происходило резкое падение БЭ до минимальных значений, зарегистрированных в I триместре. Вероятно, высокая блокирующая активность имеет значение именно для периода имплантации, а дальнейший процесс развития беременности, видимо, протекает на фоне снижения иммуносупрессии. Минимальное значение блокирующей активности сыворотки в
8–9 нед гестации может отражать необходимость иммунного контроля первой волны инвазии трофобласта в спиральные артерии матки.

Начиная с 11–12 нед беременности блокирующая активность сыворотки увеличивается, и на
сроке 23–25 и 33–35 нед она значимо выше, чем в I триместре. Такая динамика свидетельствует об изменении функционального состояния иммунной системы женщин в ходе беременности, связанном с увеличением содержания в сыворотке факторов, подавляющих функциональную активность собственных иммунокомпетентных клеток, что согласуется с представлениями о развитии неспецифической гестационной иммуносупрессии [3–6, 17]. Считается, что с развитием беременности пролиферативный ответ на аллоантигены и митогены постепенно ослабевает, и во второй половине беременности начинают преобладать неспецифические иммуносупрессивные эффекты сыворотки, связанные с присутствием в крови белков и гормонов беременности, с наличием блокирующих антител, с повышением уровня кортизола, с усилением синтеза простагландина Е макрофагами и Т-лимфоцитами и др. [4, 7, 17]. Не исключено, что увеличение блокирующей активности в
III триместре может отражать и специфическую активацию иммуносупрессивных механизмов, подавляющих избыточный иммунный ответ на усиленную аллогенную стимуляцию со стороны
развивающегося плода.

Заключение

Таким образом, нами подтверждено наличие феномена неспецифической иммуносупрессии,
сопровождающей развитие неосложненной беременности, и показана важная роль неспецифических растворимых факторов в формировании БЭ сыворотки [3–6, 17]. Полученные данные согласуются с имеющимися в научной литературе представлениями о характере изменений иммунной системы при подготовке таких женщин к беременности и во время беременности. Оценка блокирующей активности сыворотки периферической крови представляется перспективной для использования в качестве одного из лабораторных критериев эффективности предгестационной подготовки с использованием ИЦТ, а также в качестве одного из показателей угрозы выкидыша у женщин с ПНБ на сроке 8–9 нед гестации.

References

1. Chaouat G., Petitbarat M., Dubanchet S., Rahmati M., Ledee N. Tolerance of the foetal allograft? Am. J. Reprod. Immunol. 2010; 63(6): 624-36.
2. Leber A., Zenclussen M.L., Teles A., Brashwitz N., Casalis P., El-Mousleh T. et al. Pregnancy: tolerance and suppression of immune responces. Methods Mol.Biol. 2011; 677: 397-417.
3. Suhih G.T., Van'ko L.V. Immunologija beremennosti. M.: Izdatel'stvo RAMN; 2003. 400s.
4. Shirshev S.V. Mehanizmy immunojendokrinnogo kontrolja processov reprodukcii. t.1-2. Ekaterinburg: UrO RAN; 2002.
5. Sotnikova N.Ju., red. Immunologicheskaja zagadka beremennosti. Ivanovo: Izd-vo MIK; 2005. 275s.
6. Honina N.A. Projavlenija i mehanizmy formirovanija immunosupressii na razlichnyh jetapah reproduktivnogo processa v norme i pri patologii. Dis. … d-ra med. nauk. Novosibirsk; 2007. 195s.
7. Agrawal S., Pandey A. Prevalence of MLR blocking antibodies before and after immunotherapy. J. Hematother. Stem Cell Res. 2000; 9(2): 257-62.
8. Fülöp V., Padányi A., Simsa P., Kotlán B., Rajczy K., Jakab J. et al.
The significance of blocking antibodies in the monitoring of immunotherapy in immune abortions. J. Reprod. Immunol. 2010; 86(2): 87-8.
9. Pandey M.K., Rani R., Agrawal S. An update in recurrent spontaneous abortion. (Review). Arch. Gynecol. Obstet. 2005; 272(2): 95-108.
10. Golubeva E.L., Matveeva N.K., Krechetova L.V., Ziganshina M.M., Petrosjan L.A. Podgotovka k beremennosti zhenshhin s privychnym nevynashivaniem rannih srokov s ispol'zovaniem razlichnyh doz allogennyh limfocitov. Akusherstvo i ginekologija. 2009; 6: 17-20.
11. Chaouat G. Should we re-examine the status of lymphocyte alloimmunization therapy for recurrent spontaneous abortion? Am. J. Reprod. Immunol. 2003; 50(6): 433-8.
12. Clark D.A., Coulam C.B., Daya S., Chaouat G. Unexplained sporadic and recurrent miscarrage in the new millennium: a critical analysis of immune mechanisms and treatments. Hum. Reprod. Update. 2001; 7(5): 501-11.
13. Porter T.F., LaCoursiere Y., Scott J.R. Immunotherapy for recurrent miscarriage. Cochrane Database Syst. Rev. 2006; (2): CD000112.
14. Farquharson R.G., Stephenson M.D., eds. Early pregnancy. Chapter 16: Immunotherapy and early pregnancy. Cambridge; New York: Cambridge University Press; 2012.
15. Koelsch U., Weber C., Ritter C., Viehbahn A., Brune T. Immune reactivity between mother and fetus is independent of MHC haplotype. Am. J. Reprod. Immunol. 2007; 58(3): 179.
16. Shankarkumar U., Pawar A., Gaonkar P., Parasannavar D., Salvi V., Ghosh K. HLA allele associations in idiopathic recurrent spontaneous abortion patients from India. J. Hum. Reprod. Sci. 2008; 1(1): 19–24.
17. Shmagel' K.V., Chereshnev V.A. Immunitet beremennoj zhenshhiny. M.: Medicinskaja kniga; 2003. 225c.
18. Ostanin A.A., Kustov S.M., Tyrinova T.V., Tihonova M.A., Honina N.A., Pasman N.M., Chernyh E.R. Pokazateli immuniteta beremennyh v rannem prognoze razvitija fetoplacentarnoj nedostatochnosti. Akusherstvo i ginekologija. 2010; 1: 33-8.
19. Patent US 7169571, Int. Cl. B2. Methods for measurement of lymphocyte function. Marjorie L.Wier. N 2005/0260563 A1; Appl. 24.11.2005; Publ. 30.01.2007.
20. Schwulst S.J., Muenzer J.T., Chang K.C., Brahmbhatt T.S., Coopersmith C.M., Hotchkiss R.S. Lymphocyte phenotyping to distinguish septic from nonseptic critical illness. J. Am. Coll. Surg. 2008; 206(2): 335-42.
21. Avgustin B., Kotnik V., Skoberne M., Malovrh T., Skralovnik-Stern A., Tercelj M. CD69 expression on CD4+ T lymphocytes after in vitro stimulation with tuberculin is an indicator of immune sensitization against Mycobacterium tuberculosis antigens. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2005; 12(1): 101-106.
22. Patent 2396566, RF. Sposob opredelenija blokirujushhego jeffekta autologichnoj zhenskoj syvorotki.Suhih G.T., Van'ko L.V., Nikolaeva M.A., Ziganshina M.M., Sidel'nikova V.M., Krechetova L.V.; Zajavka № 2009116174; Zajavleno 29.04.2009; Opublikovano 10.8.2010; Bjulleten' 22.
23. Krechetova L.V., Ziganshina M.M., Golubeva E.L., Khodzhaeva Z.S., Vanko L.V., Sukhikh G.T. Influence of autologous serum on mitogen-induced CD69 expression in mononuclear cells of peripheral blood of women with RSA. In: The 13-th International symposium for immunology of reproduction, 22-24 June 2012, Varna, Bulgaria; Am. J. Reprod. Immunol. 2012; 67(Suppl.1).
24. Velieva Je.Je. Znachenie limfocitimmunoterapii v optimizacii programmy jekstrakorporal'nogo oplodotvorenija u supruzheskih par s sovmestimost'ju po antigenam HLA-sistemy: Avtoref. dis…. kand. med. nauk. M.; 2010. 24 s.

About the Authors

Krechetova Lyubov V., Ph.D. in medical sciences, Head of Laboratory of Clinical Immunology, “Research center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology” Ministry of Health of Russia.
Address: 4, Acad. Oparin St., Moscow, Russian Federation 117997. Telephone: 8(495) 438 11 83.
E-mail: k_l_v_@mail.ru, l_krechetova@oparina4.ru.
Nikolaeva Marina A., Doctor of Science, Leading researcher, Laboratory of Clinical Immunology, “Research center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology” Ministry of Health of Russia.
Address: 4, Acad. Oparin St., Moscow, Russian Federation 11799.
Telephone: 8(495) 438 11 83. E-mail: nikolaeva_ma@mail.ru
Professor Vanko Lyudmila V., M.D., Leading researcher, Laboratory of Clinical Immunology, “Research center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology” Ministry of Health of Russia.
Address: 4, Acad. Oparin St., Moscow, Russian Federation 117997.
Telephone: 8(495) 438 11 83. E-mail: LVanko@oparina4.ru.
Golubeva Elena L., Ph.D. in medical sciences, doctor of laboratory diagnostics in Laboratory of Clinical Immunology, “Research center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology” Ministry of Health of Russia.
Address: 4, Acad. Oparin St., Moscow, Russian Federation 117997.
Telephone: 8(495) 438 11 83. E-mail: e_golubeva@oparina4.ru
Ziganshina Marina M., junior researcher in Laboratory of Clinical Immunology, “Research center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology” Ministry of Health of Russia.
Address: 4, Acad. Oparin St., Moscow, Russian Federation 117997.
Telephone: 8(495) 438 11 83. E-mail: mmz@mail.ru
Tetruashvili Nana K., Doctor of Medicine, Head of the Department of Pregnancy Loss Prevention and Therapy, “Research center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology” Ministry of Health of Russia.
Address: 4, Acad. Oparin St., Moscow, Russian Federation 117997.
Telephone: 8(495) 438 11 83. E-mail: n_tetruashvili@oparina4.ru.
Vtorushina Valentina V., Ph.D. in medical sciences, doctor of laboratory diagnostics in Laboratory of Clinical Immunology, “Research center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology”, Ministry of Health of Russia.
Address: 4, Acad. Oparin St., Moscow, Russian Federation 117997.
Telephone: 8(495) 438 11 83. E-mail: vtorushina@inbox.ru
Sukhikh Gennady T., MD, PhD, Professor Academician of Russian Academy of Medical Sciences, Director “Research center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology” Ministry of Health of Russia.
Address: 4, Acad. Oparin St., Moscow, Russian Federation 117997.
Telephone: 8(495) 438 18 00. E-mail: gtsukhikh@mail.ru.

Similar Articles

By continuing to use our site, you consent to the processing of cookies that ensure the proper functioning of the site.