Отсутствие беременности в течение года регулярной половой жизни без контрацепции считается бесплодием и может быть связано как с женским, так и с мужским факторами. В большом количестве случаев мужское бесплодие можно преодолеть с помощью метода интрацитоплазматической инъекции сперматозоида в ооцит (ИКСИ), который позволяет обойти многие препятствия для оплодотворения, но вместе с этим игнорирует естественные механизмы отбора сперматозоидов [1].
Даже в тех клинических центрах, где практикуется перенос нескольких эмбрионов, только треть циклов вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) заканчивается наступлением беременности, причем далеко не каждая из них заканчивается рождением ребенка. Под «повторными» неудачами имплантаций понимают отсутствие беременности после 2 и более циклов ВРТ с переносом эмбрионов «хорошего» и «отличного» качества [2].
Вероятность оплодотворения при ИКСИ определяется качеством используемых ооцитов и сперматозоидов. Оценка репродуктивной функции мужчины осуществляется главным образом по таким показателям спермограммы, как концентрация, подвижность и доля морфологически нормальных гамет. Однако по этим «глобальным» параметрам не всегда можно судить о качестве отдельных половых клеток и прогнозировать результативность применения методов ВРТ. Несмотря на то что для выполнения ИКСИ клинический эмбриолог может отобрать подвижный, морфологически нормальный сперматозоид, эффективность этого метода далека от 100%. Даже морфологически нормальные мужские половые клетки могут иметь функциональные отклонения и нарушения целостности генетического аппарата, что отражается на репродуктивных исходах [3]. Ситуация усложняется при абсолютной тератозооспермии, когда практически все сперматозоиды имеют те или иные морфологические дефекты. Таким образом, селекция субпопуляции мужских гамет с хорошими функциональными характеристиками может оказать серьезное влияние на эффективность ИКСИ.
Методы отбора разнообразны и включают сортировку магнитно-активированных клеток (MACS), оценку связывания с гиалуроновой кислотой (PICSI), микроскопическую оценку морфологии органелл (MSOME) и т.д. [4]. Один из предложенных подходов к отбору сперматозоидов основан на наличии у части из них отрицательного электрического заряда, называемого «дзета-потенциалом». Этот заряд формируется в результате появления на поверхности сперматозоида сиаловых кислот при его окончательном созревании во время прохождения через придаток яичка [5]. Гипотетически дзета-потенциал является маркером полной функциональной зрелости мужской половой клетки. Отобранные по дзета-потенциалу сперматозоиды имеют более высокое качество хроматина, чем полученные при центрифугировании в градиенте плотности (ЦГП), что отражается на качестве полученных эмбрионов [6–8]. В рандомизированном клиническом исследовании было показано, что комбинация методов (отбор по дзета-потенциалу и ЦГП) приводит к более высокой частоте наступления беременности в результате ИКСИ, чем использование только ЦГП [9].
Отбор сперматозоидов по дзета-потенциалу привлекателен своей технической простотой. Полимерная пробирка, содержащая взвесь со сперматозоидами, несколько раз прокручивается в латексной перчатке, что придает ее стенке положительный заряд. Затем среда удаляется из пробирки, после чего в ней остаются только прикрепившиеся к стенке сперматозоиды с отрицательным зарядом мембраны [10].
Для эффективности сравнения новых методов селекции сперматозоидов чаще всего выступает ЦГП, широко применяемое в рутинной клинической практике для классического экстракорпорального оплодотворения, ИКСИ и внутриматочной инсеминации. ЦГП позволяет получить фракцию зрелых и подвижных сперматозоидов [11]. После центрифугирования из образца устраняются лейкоциты и другие клетки, являющиеся «внешними» источниками активных форм кислорода [12]. Однако само по себе механическое воздействие на сперматозоиды может снизить их качество и посредством индукции оксидативного стресса отразиться на целостности генетического материала. Некоторые авторы предлагают компенсировать этот недостаток путем добавления в среду антиоксидантов [13, 14]. В отличие от ЦГП, методика отбора по дзета-потенциалу в ее оригинальном виде не подразумевает длительного центрифугирования и иных видов грубого механического воздействия на сперматозоиды. Она может оказаться более эффективной в тех случаях, когда качество и жизнеспособность сперматозоидов заведомо скомпрометированы, в частности, при наличии у них грубых морфологических изменений.
В данной статье описывается клиническое наблюдение, в котором отбор по дзета-потенциалу продемонстрировал свое преимущество перед стандартным ЦГП у пары с неоднократными неудачными попытками ВРТ в анамнезе на фоне абсолютной тератозооспермии у мужчины.
Клиническое наблюдение
Пациентка П., 33 лет, обратилась в отделение вспомогательных технологий в лечении бесплодия имени профессора Б.В. Леонова (заведующая отделением – д.м.н., проф. Е.А. Калинина) ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова» Министерства здравоохранения Российской Федерации (директор – академик РАН, д.м.н., профессор Сухих Г.Т.) с целью достижения беременности в рамках очередного протокола ВРТ. Пара ведет половую жизнь без контрацепции на протяжении 4 лет. За это время у пациентки в возрасте 30 лет наступила самостоятельная беременность, остановившаяся в развитии на сроке 8 недель.
В 2019 г. выполнена попытка экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) по месту жительства, при которой получено 11 ооцитов. Пять ооцитов были оплодотворены классическим методом ЭКО, и еще 5 ооцитов – методом ИКСИ. При ИКСИ был получен один эмбрион хорошего качества, однако клинической беременности после его переноса не наступило.
В 2020 г. выполнена вторая попытка ЭКО по месту жительства, при которой получено 8 ооцитов, 6 из которых были оплодотворены с помощью ИКСИ, в результате чего получено 5 зигот. Все эмбрионы остановились в развитии на 3-е сутки культивирования, в связи с чем отменены перенос и криоконсервация эмбрионов.
У пациентки отмечаются аденомиоз, бронхиальная астма в фазе ремиссии. Пациентка без вредных привычек, с нормальным индексом массы тела (26 кг/м2), с регулярным менструальным циклом, составляющим 30 дней, с продолжительностью менструального кровотечения 5 дней. Инфекций, передающихся половым путем, не было. Уровень антимюллерова гормона на момент обращения – 2,94 нг/мл, фолликулостимулирующего гормона – 5,9 мМЕ/мл.
Возраст мужа – 29 лет. В спермограмме отмечается стойкое снижение количества, подвижности и доли морфологически нормальных сперматозоидов (ОАТ-синдром). При цитогенетическом исследовании подтвержден нормальный мужской кариотип. Мужчина обследован андрологом, признаков инфекции добавочных половых желез, гипогонадизма, варикоцеле и иных поддающихся лечению причин мужского бесплодия не выявлено.
В эякуляте, полученном в день трансвагинальной пункции яичников, концентрация сперматозоидов составила 10 млн/мл, доля сперматозоидов с прогрессивной подвижностью – 26% (по ВОЗ 2010 г.). При микроскопии нативного эякулята сперматозоиды с нормальной морфологией не определялись. Таким образом, в данном клиническом наблюдении идет речь об олигоастенотератозооспермии, при этом доля морфологически нормальных сперматозоидов составила 0%.
Эякулят был разделен на 2 части. Одна часть эякулята была обработана с помощью ЦГП, в результате чего выделена фракция сперматозоидов с концентрацией 1 млн/мл, где доля прогрессивно-подвижных сперматозоидов составляла 5%, но морфологически нормальных гамет практически не было. Вторая часть эякулята была использована для отбора сперматозоидов по дзета-потенциалу. После полного разжижения эякулята производилась оценка подвижности, морфологии мужских половых клеток по строгим критериям Крюгера и ДНК фрагментации сперматозоидов методом TUNEL. К 1 мл нативного эякулята добавляли 3 мл культуральной бессывороточной среды Multipurpose Handing Medium (IrvineScientific, USA) и центрифугировали в течение 10 минут на 300g (Centrifuge CM-6M, ELMI, Latvia). Образовавшийся осадок ресуспензировали с 5 мл культуральной бессывороточной среды MHM. Далее пробирке с эякулятом придавали положительный поверхностный заряд и инкубировали в течение 1 минуты при температуре +37,0°C. Надосадочную жидкость сливали, а мужские гаметы с поверхности пробирки разбавляли 0,2 мл среды Sperm Washing Medium (IrvineScientific, USA) и использовали для ИКСИ. При концентрации 1 млн/мл эта субпопуляция имела значительно более высокую долю клеток с прогрессивной подвижностью (38%), причем при микроскопии удалось выделить даже сперматозоиды с нормальной морфологией (1%) (согласно критериям ВОЗ 2010 г.). Учитывая такие различия в качестве сперматозоидов, для оплодотворения было решено использовать клетки, отобранные по дзета-потенциалу. Кроме того, были подготовлены препараты для оценки индекса фрагментации ДНК методом TUNEL.
Результаты данного исследования были получены уже после выполнения ИКСИ и не повлияли на тактику ведения пары, но подтвердили более высокое качество сперматозоидов при отборе по дзета-потенциалу, после которого доля сперматозоидов с фрагментированной ДНК составила 6,8%, тогда как после ЦГП он составил 14,4%.
При трансвагинальной пункции получено 8 ооцит-кумулюсных комплексов, после денудации 7 ооцитов оказались на стадии MII и были пригодны для дальнейшего оплодотворения. Произведено ИКСИ сперматозоидов, отобранных по дзета-потенциалу, в результате чего получено 7 зигот. На 5-е сутки культивирования был перенесен один эмбрион на стадии бластоцисты класса 4АА согласно классификации Д. Гарднера. Два эмбриона криоконсервированы на стадии бластоцисты класса 3АА и 4ВВ. Остальные 4 эмбриона утилизированы в связи с качеством, не соответствующим условиям криоконсервации (4СС, 4СС, 12b, ATR). Наступила клиническая беременность, протекавшая без особенностей и завершившаяся срочными родами оперативным путем, извлечена живая доношенная девочка с массой тела 3440 г, длиной 52 см, 8/9 баллов по шкале Апгар. Операция кесарева сечения выполнена по медицинским показаниям.
Обсуждение
Неоднократные неудачные протоколы ВРТ на фоне мужского фактора бесплодия являются одним из основных вызовов в современной репродуктивной медицине. Новые методы отбора сперматозоидов призваны решить эту проблему с помощью достижений клинической эмбриологии. Часть из них направлена на селекцию отдельных сперматозоидов по функциональным или морфологическим характеристикам. Другие, в том числе отбор по дзета-потенциалу, направлены на выделение субпопуляции наиболее качественных сперматозоидов [4, 15]. Наше клиническое наблюдение демонстрирует, что даже в пределах одной группы эти методы неравнозначны, и в некоторых ситуациях отбор по дзета-потенциалу превосходит общепринятую методику ЦГП. Благодаря ему удалось выделить единичные морфологически нормальные сперматозоиды из образца, в котором доля морфологически нормальных сперматозоидов составляла 0% (по ВОЗ 2010 г.).
Из-за дефицита доказательной базы рано говорить о внедрении подобных методов в рутинную практику, выработке показаний и противопоказаний к каждому из них. Опубликованы статьи, в которых описываются эмбриологические конечные точки (частота оплодотворения, качество эмбрионов и т.д.), которые, по сути, являются суррогатными. Метод отбора по дзета-потенциалу является одним из немногих, по которому проводились полноценные клинические исследования с оценкой частоты наступления беременности [9]. Необходимо проведение исследований, в которых будет оцениваться частота рождения детей как истинная конечная точка. Наработка доказательной базы осложняется недостаточной стандартизацией существующих методов отбора сперматозоидов. Полагают, что одними из основных преимуществ отбора по дзета-потенциалу являются отсутствие необходимости в центрифугировании образца и снижение степени механического воздействия на сперматозоиды. Однако в нашем клиническом исследовании проводилось предварительное центрифугирование нативного эякулята с культуральной бессывороточной средой Multipurpose Handing Medium (IrvineScientific, USA), что не помешало выделить качественные сперматозоиды и добиться хорошего результата ВРТ.
Сепарация сперматозоидов по мембранному заряду основана на относительно простом физическом принципе, и ее легко осуществить в лаборатории. Однако появляются приборы, объективно оценивающие дзета-потенциал сперматозоидов с целью определения фертильности [16]. Внедрение такого теста в клиническую практику было бы полезно для определения пар, которые могут получить положительный эффект от отбора сперматозоидов по дзета-потенциалу, так же, как это возможно для теста на связывание с гиалуроновой кислотой (HBA-тест) и технологии ПИКСИ.
Заключение
Остается открытым вопрос о том, какой метод отбора сперматозоидов работает лучше остальных у пар с неоднократными неудачными попытками ВРТ в анамнезе. Вероятно, в каждом случае необходим индивидуальный подбор методики исходя из результатов спермиологических исследований и особенностей анамнеза. Необходимо дальнейшее накопление клинического опыта по применению современных методов отбора сперматозоидов с обязательной регистрацией результатов ВРТ, что позволит реально оценить их эффективность и найти им нишу для применения.
