Современные научные открытия все больше демонстрируют значимость микроорганизмов в жизни человека. Множество исследований, проведенных международными консорциумами ученых США и Европы в рамках проекта «Микробиом», продемонстрировали, что организм человека является местом обитания безмерного множества микроорганизмов, которые содружественно эволюционировали с человеком [1]. Каждому индивидууму свойственен только ему присущий микроэкологический гомеостаз, и сохранность этого микробиологического равновесия определяет способность организма человека отвечать на воздействия внешней среды, адаптироваться к различным условиям обитания, проявлять инфекционную резистентность.
Понимание значимости микробиоты для человека в современном мире чрезвычайно велико и вышло далеко за пределы этиологической и патогенетической роли микроорганизмов в возникновении инфекционных болезней. Знание особенностей микробиоты различных локализаций, оценка ее изменений расширяют и совершенствуют понимание патофизиологии, лежащей в основе многих заболеваний – от бактериального вагиноза до цервикального рака [1, 2].
Микробиота влагалища разнообразна и представляет собой пример сложного мутуалистического симбиоза, регуляция которого полностью не изучена до сегодняшнего дня. Это динамическая биосистема, находящаяся в сбалансированных отношениях с макроорганизмом и подвергающаяся изменениям под влиянием эндогенных и экзогенных факторов [3]. В последние годы опубликовано большое количество исследований о применении пробиотиков для коррекции вагинального дисбиоза [4].
Вагинальные бактериальные сообщества у женщин индивидуальны; они богаты разными видами и включают бактерии, которые не обнаруживаются традиционными культуральными методами [3]. В то же время вагинальная микробиота, в отличие от других экосистем, в норме характеризуется доминированием одной группы микроорганизмов – лактобацилл, ответственных за ее стабильность и колонизационную резистентность. Главным механизмом, обеспечивающим колонизационную резистентность вагинального биотопа, является способность лактобацилл к кислотообразованию [2, 5]. Прослеживается выраженная корреляция между распространенностью Lactobacillus spp. и уровнем рН. Кислая среда влагалища (рН<4,5), присутствие антимикробных пептидов, бактериоцинов препятствуют физико-химическим изменениям биотопа [6], распространению транзиторных и некоторых патогенных видов микроорганизмов, таких как Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae [7], вирус папилломы человека (ВПЧ), вирус простого герпеса (ВПГ), вирус иммунодефицита человека [8–10], обеспечивают поддержку метаболической функции эпителия генитального тракта [11]. Следует отметить, что особенности строения женских половых органов формируют уникальность микробного сообщества на каждом уровне. Слизистая пробка цервикального канала служит блокирующим буфером, который может ограничивать свободное перемещение микроорганизмов между влагалищем и полостью матки [12]. Тем не менее в ряде исследований уже установлено, что полость матки, фаллопиевы трубы и яичники нестерильны [12–17]. У здоровых женщин эндометрий содержит микробиоту с низкой биомассой, в которой преобладают несколько видов бактерий, включая Bacteroidota (Flavobacterium spp.) и Firmicutes (Lactobacillus spp.) [18, 19]. В литературе имеются сообщения о возможной взаимосвязи изменений в составе микробиоты матки с возникновением ряда гинекологических заболеваний, таких как эндометриоз, полипы и рак эндометрия, а также с восприимчивостью эндометрия к бластоцисте, что может быть причиной бесплодия [17, 20, 21].
Значимость колонизационной резистентности и микробиологического постоянства для жизни и здоровья индивидуума не подвергается сомнениям, что стимулирует ученых искать новые способы коррекции и лечения заболеваний, ассоциированных с нарушением микробиоты и/или инфекционными агентами. Главными критериями нового терапевтического воздействия являются персонифицированный подход, его эффективность и безопасность. По данному направлению внедрены инновации и достигнуты большие успехи в лечении заболеваний кишечника с использованием трансплантации фекальной микробиоты (ТФМ). Подобный путь, вероятно, принесет успех и в лечении дисбиотических состояний вагинальной микробиоты.
ТФМ представляет собой введение микробного сообщества, выделенного из подготовленного донорского биоматериала, для восстановления общего микробного разнообразия и стабильности в кишечнике реципиента. Во многих публикациях продемонстрировано, что ТФМ является надежным и эффективным методом селективного лечения различных желудочно-кишечных заболеваний и на сегодняшний день активно используется для лечения диареи, ассоциированной с Clostridioides difficile, синдрома раздраженного кишечника, воспалительных заболеваний кишечника, псевдомембранозного колита [22–24]. Клинический успех ТФМ привел к исследованиям, позволяющим использовать ТФМ для лечения не только заболеваний кишечника, но и ожирения, заболеваний печени, депрессии, пищевых аллергий, рассеянного склероза, расстройств аутического спектра, нейроиммунных заболеваний, таких как тяжелая миастения, рассеянный склероз, расстройства спектра оптиконейромиелита и других нозологий [25–29]. Этот широкомасштабный пул инноваций в фекальной трансплантологии может быть ориентиром для развития подобного направления в гинекологической практике.
С учетом некоторых сходств в строении слизистой оболочки кишечника и влагалища, в особенностях модуляции иммунной системы человека и поддержании гомеостаза, в патогенезе возникновения некоторых инфекционных заболеваний, обусловленных избыточным ростом определенных возбудителей, логическим продолжением может быть возможность применения трансплантации вагинальной микробиоты (ТВМ), которая может послужить эффективным методом лечения бактериального вагиноза (БВ) и других вагинальных инфекций [22, 30].
Трансплантация вагинального микробного сообщества может произвести революцию и полностью изменить представление о терапевтическом подходе при различного рода заболеваниях [30]. На данный момент опубликованы результаты ряда экспериментальных работ, демонстрирующие большие перспективы развития ТВМ, несмотря на небольшое количество проведенных исследований, в сравнении с ТФМ.
В исследовании Chen T. et al. (2015) разработана модель БВ у крыс, в которой изучалось отдельно влияние ТВМ и комбинации пробиотиков на исход БВ. Результаты продемонстрировали, что ТВМ благоприятно влияет на регуляцию провоспалительных цитокинов во влагалище и нормализует их соотношение до оптимального, способствует увеличению количества Lactobacillus, что предотвращает рецидивы БВ [6]. В 2018 г. исследования по данному направлению продолжились и продемонстрировали, что при проведении ТВМ здоровых женщин во влагалище крыс модельной группы с БВ удалось восстановить здоровое микробиологическое разнообразие слизистой оболочки влагалища, снизить экспрессию факторов апоптоза, тем самым получая выраженный терапевтический эффект [23, 31].
По заключению некоторых групп исследователей, штаммы Lactobacillus, полученные из вагинальной микрофлоры человека, могут колонизировать половые пути быстрее и эффективнее оказывать защиту от различного рода патогенов по сравнению с искусственно культивированными штаммами иного происхождения [22, 23]. В данном вопросе важны высокая жизнеспособность микроорганизмов в соответствующей экологической нише, способность к активному росту in vivo, обладание генетической стабильностью, чтобы максимально сохранять свои свойства во время обработки, лиофилизации и хранения.
В 2019 г. в Израиле Lev-Sagie A. et al. впервые сообщили об удачном опыте ТВМ от здоровых доноров пациенткам с рецидивирующим БВ от здоровых доноров. У 4 из 5 женщин, неоднократно получавших антибиотики в ходе лечения БВ, была достигнута стойкая ремиссия после введения небольшого количества свежих вагинальных выделений на протяжении всего периода наблюдения и даже спустя 2 года после проведенной трансплантации. Авторы не сообщили о побочных эффектах и серьезных нежелательных явлениях [32].
Несмотря на обнаруженную эффективность ТВМ в лечении БВ, оценка проводилась с малой выборкой пациенток. Для достоверного подтверждения эффективности ТВМ и получения надежных клинических результатов необходимы более качественные рандомизированные плацебо-контролируемые клинические испытания с большой выборкой. Подобные клинические работы проводятся в США с 2021 г. [23].
Особенности и механизмы сложного взаимодействия всех компонентов вагинальной жидкости остаются предметом активного изучения [30, 32, 33].
Wei K. и Chen T. (2021) в своем исследовании эффективности ТВМ выдвинули теорию, что гораздо эффективнее проводить терапию БВ с помощью вагинальной микробиоты здоровых женщин без дополнительных вмешательств в биологический материал, не реконструировать микробиоту из отдельных микроорганизмов самих пациенток искусственно для достижения нового баланса [23]. Эта гипотеза была выдвинута на основании исследования Gardner H.L. и Dukes C.D. (1955), в котором было установлено, что при трансплантации вагинальных выделений больных неспецифическим вагинитом во влагалище здоровых добровольцев клинические симптомы заболевания констатированы у 73% [34]. Продукты жизнедеятельности бактерий, молочная кислота, биологически активные вещества, муцины или другие компоненты вагинальной жидкости могут быть не менее важным условием стабильности и эффективности полученного материала и играть важную роль в потенциальном успехе процесса трансплантации [30].
В то же время на сегодняшний день существует очень перспективная гипотеза о внедрении в клиническую практику селективной трансплантации микробиоты [35]. В соответствии с данной концепцией, после проведения секвенирования генома образцов доноров и реципиентов, можно приготовить препараты микрофлоры in vitro, которые могут полностью имитировать здоровый вагинальный микробиом, тем самым достигая еще более успешного терапевтического результата [22, 36]. Таким образом, будет получен препарат микробной флоры, способный имитировать здоровый организм человека, одновременно решая проблему безопасности в процессе трансплантации и обеспечивая индивидуализированное лечение, регулируя относительную численность каждого из микроорганизмов с более высокой специфичностью и управляемостью [37].
Таким образом, предварительные клинические результаты в ряде экспериментальных исследований по теме ТВМ продемонстрировали хороший терапевтический эффект и большие перспективы применения по сравнению с другими методами лечения. При терапии рецидивирующего БВ ТВМ показывает превосходство перед медикаментозным лечением и в то же время решает вопрос, связанный с развитием резистентных бактерий и высокой частотой рецидивов при использовании антибиотиков [23].
Такие перспективы способствуют развитию концепции о новом классе биотерапевтических препаратов [6]. Более того, Humphries C. (2017) утверждает, что необходимо идентифицировать наиболее значимые таксономические единицы влагалищной микробиоты здоровых женщин, на основании которых можно производить промышленный продукт [38].
Можно предположить, что препараты микробиоты, которые представляют собой живые биотерапевтические продукты, могут быть основой для разработки персонифицированных лекарственных средств на основе собственной микробиоты человека, что логично с точки зрения безопасности и доступности и может помочь в лечении заболеваний со сложным патогенезом и этиологией. При этом теоретически допускается несколько стратегий разработки препаратов, а именно:
- полное сохранение в препарате исходного микробиологического консорциума донорского биоматериала;
- частичное сохранение микробного сообщества донорского биоматериала с использованием специальных методов обработки для удаления определенных биологических компонентов;
- создание консорциума микроорганизмов с использованием выделенных у донора и экзогенных штаммов, культивируемых in vitro;
- использование сконструированного штамма с модификацией микробного генома для конкретной терапевтической задачи.
Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (Food and Drug Administration, FDA) рассматривает трансплантацию микроорганизмов, в частности ТФМ, как лекарство и живой биотерапевтический продукт (Live biotherapy product, LBP), так как накоплен достаточно значимый опыт практического применения методики [23].
На сегодняшний день нет единых регламентирующих мер и документов для ТВМ, но с увеличением количества исследований высока перспектива разработки комплексной системы и всего процесса ТВМ, включая отбор и скрининг доноров и реципиентов, транспортировку и хранение образцов, тщательное исследование полученного биологического материала перед использованием [39]. Характеристика фармакокинетических свойств, определение стабильности и безопасности, возможности микроорганизмов размножаться во влагалище, определение дозировки и кратности применения остаются предметом разработки и изучения [40].
Перспективы развития ТВМ весьма обнадеживающие. Однако в связи с отсутствием стандартизации сохраняются опасения по поводу безопасности трансплантации микробиоты от доноров [41]. Необходимо строго концептуализировать процесс скрининга доноров, сформулировать четкие критерии включения и исключения в соответствии с действующими рекомендациями, касающимися трансплантации, которые позволят получить представление о составе вагинальной микробиоты, наличии возбудителей инфекций, передаваемых половым путем (ИППП), вероятном иммунологическом отторжении в ходе трансплантации и иных микробиом-опосредованных факторах риска [23, 30, 42, 43]. Разработка оптимизированных методов сбора и хранения донорского материала, организация биобанка играют не менее важную роль [44]. При этом защита интересов пациентов и безопасность общественного здоровья должны оставаться приоритетом [45].
Следует учитывать анамнез доноров, количество половых партнеров, статус и частоту половой жизни, применение препаратов, влияющих на вагинальную микробиоту, состояние репродуктивной системы, результаты обследований, наличие беременности. Кроме того, любые перенесенные ранее или имеющиеся ИППП должны быть критерием для исключения [22]. В дополнение к интенсивному и тщательному скринингу потенциальных участников-доноров на трансплантацию важно проводить обследование реципиентов для понимания их исходного инфекционного статуса. Данные меры позволят иметь объективные представления о состоянии пациентов в каждой группе и избежать ряда сложных юридических и правовых вопросов. Некоторые контролируемые инфекции, сопутствующие основному заболеванию реципиента, например ВПЧ, ВПГ, скорее, не будут являться критериями исключения [30]. Определение состава вагинальной микробиоты донора и реципиента, собранных во время последующего обследования, может помочь в понимании, приведет ли данная процедура к восстановлению полезной микробиоты влагалища реципиента.
Необходимо проводить динамическое наблюдение за состоянием пациентов с БВ вместе с оценкой микробного состава вагинальной микробиоты, оценкой межвидовых взаимодействий, которые могут влиять как на вероятность обострения БВ, так и на разрешение симптомов [22].
В крупномасштабных исследованиях крайне затруднительно сразу осуществить обработку полученных образцов. Условия хранения, фактор времени могут способствовать значительному перекосу таксономической численности в сторону бактерий, более устойчивых к лизису. А любое влияние на репрезентативность образцов потенциально может влиять на ход исследования и на возможность применения образцов микробиоты человека для терапии [46]. Для минимизации подобных явлений необходимо выбрать оптимальный набор расходных медицинских изделий для забора биоматериалов, адаптировать протокол исследования к ожидаемому микробному сообществу, применять один и тот же протокол на протяжении всего исследования [47].
На примере изучения кишечной микробиоты были созданы практические руководства для осуществления высококачественных и экономически эффективных исследований. При этом достоверных данных о влиянии условий хранения, методов выделения и культивирования микроорганизмов, микробной экстракции, используемых для исследования образцов микробиоты влагалища, существует крайне ограниченное количество, включающее в себя единичные исследования с небольшим количеством пациентов [46]. Надлежащие условия хранения биоматериала позволяют избежать систематической ошибки в составе микробного сообщества после сбора образцов. Быстрая заморозка до -80°C считается наилучшим вариантом для сохранения образцов микробиоты [48].
В научном исследовании Yockey L.J. et al. (2022) представлены протокол обширного скрининга для доноров, оценка безопасности и оценка условий хранения препаратов для трансплантации. Обследование участников проводится до, во время и после периода донорства, чтобы убедиться в отсутствии инфицированности различными патогенами и исключить наличие инкубационного периода заболевания в момент забора материалов. В отношении сохранения жизнеспособности микроорганизмов при температуре минус 80°C до 3 месяцев более стабильную и высокую жизнеспособность показали образцы с доминированием L. crispatus, в отличие от других видов лактобацилл. У исследователей есть версия, что разные штаммы Lactobacillus выживают при замораживании по-разному. Возможно, это связано с индивидуальными особенностями вагинальной жидкости, которые влияют на жизнеспособность микроорганизмов в долгосрочной перспективе. Авторы целенаправленно ограничили любые манипуляции с вагинальной жидкостью и не использовали криопротектор для более точной оценки свойств и особенностей полученного материала. Исходя из полученных результатов, сделаны выводы об отсутствии необходимости использования криопротекторов, если минимальная концентрация L. crispatus составляла 1×106 КОЕ/мг [44].
Важным и сложным аспектом остается расчет дозировки пробиотических продуктов, в которых концентрация (КОЕ/доза) может быть стандартизирована во время селективной процедуры.
При этом можно обнаружить широкий диапазон концентраций (КОЕ/мг) между участниками консорциума в составе микробиоты, что говорит о более выраженных функциональных отличиях у доминирующих микроорганизмов [30].
Немаловажным аспектом является используемый расходный материал, тампоны и инструменты при получении образцов для микробиологического исследования, поскольку качество забора биоматериала является критическим моментом и предопределяет достоверность исполнения последующих аналитических тестов. В настоящее время активно используются тампоны, обернутые нетоксичными синтетическими материалами, такими как дакрон, вискоза, пенополиуретан, флокированный нейлон. Не выявлено достоверной разницы влияния различных буферов, используемых для смывания образцов с тампонов, при выделении ДНК [49].
В другом исследовании Ahannach S. et al. (2021) оценивали тампоны, содержащие лизирующий буфер разной силы стабилизации материала, а также влияние температуры хранения (-80°C, -20°C, 4°C и комнатная температура) на микробный профиль вагинальных образцов. Согласно результатам данного исследования, наблюдался таксономический сдвиг в микробном составе вагинальных образцов с течением времени при использовании тампона с более слабым буфером. В то же время не проводилось изучение влияния на образцы хранения при различных условиях в течение длительного времени (месяцы, годы) [46]. Данные результаты указывают на необходимость дальнейшего изучения возможностей сохранения образцов в долгосрочной перспективе с минимальными изменениями в составе препарата, поиска материалов, сред и оборудования, подходящего для выполнения этих задач.
Главенствующую роль в исследовательских проектах, связанных с микробиотой человека, играют биобанки, которые являются одними из самых инновационных организаций в области биомедицинских технологий. Они позволяют проводить широкомасштабные исследования; в то же время их деятельность лежит в основе индивидуализации диагностических и лечебных процессов посредством полученных биоматериалов, что демонстрирует особую роль биобанков в развитии персонализированной медицины. Биобанки представляют собой учреждения, осуществляющие хранение биологических материалов и клинических данных по образцам, обработку и детальный анализ полученной информации [50].
Процесс получения образца начинается с получения информированного согласия пациента. Забор образца осуществляется во время медицинских процедур персоналом, прошедшим необходимую подготовку для проведения данной манипуляции, в специальные среды или буферы. Транспортировка проводится в строго определенных и контролируемых условиях. В биобанке образец анонимизируется, маркируется и направляется в отделение анализа или хранения.
Заключение
Базируясь на полученных данных, формируется концепция создания препаратов микробиоты, которые могут стать идеальным инструментом для эффективной терапии, сочетая в себе безопасность и широкую представленность микробного сообщества. Традиционные пробиотики на основе лактобацилл кишечного происхождения имеют субоптимальную формулу, в которой жизнеспособность микроорганизмов в вагинальном биотопе возможна не в полной мере, из-за чего присутствует риск не достичь уровня критически важной здоровой микробиоты.
ТВМ лежит в основе абсолютно новой терапевтической стратегии в гинекологической практике. Разработка и производство стандартизированных биотерапевтических продуктов с высокой эффективностью являются приоритетными направлениями при ТФМ, также это возможно и при ТВМ.
Эффективность ТВМ должна быть дополнительно определена и доказана в рандомизированных плацебо-контролируемых клинических исследованиях. Следовательно, у современной науки есть шанс внедрить в технологический процесс и использовать в клинической медицине значительный потенциал нового и уникального класса биологических препаратов, оптимизируя терапию ряда заболеваний, сложно поддающихся лечению.
