Construction of an artificial ovary based on human preantral follicules

С каждым годом онкологические заболевания диагностируют у все большего количества детей, подростков и взрослых людей, в то время как смертность от данных болезней неуклонно снижается [1, 2]. Такая ситуация сложилась из-за широкого распространения эффективных методов лечения онкологических заболеваний (химиотерапии, радиотерапии), которые с одной стороны, повысили выживаемость при таких диагнозах, но, с другой стороны, поставили под угрозу фертильность пациенток [2–6]. Для сохранения репродуктивного потенциала женщин, имеющих риск возникновения преждевременной недостаточности яичников (ПНЯ) после лечения онкологических заболеваний, в многочисленных обзорах [7, 8] описаны различные стратегии сохранения фертильности, такие как криоконсервация ооцитов и эмбрионов, криоконсервация и трансплантация ткани яичников. Данные методы широко применяются в клинической практике, в том числе и в НМИЦ АГиП им. В.И. Кулакова [9, 10], однако, они способны помочь не всем. Существует группа пациенток, для которых невозможно провести стимуляцию суперовуляции с целью криоконсервации ооцитов или эмбрионов. Это девочки препубертатного возраста, пациентки с гормон-зависимыми видами опухолей, пациентки, которые не могут перенести или отложить гонадотоксичное лечение. Для этих пациенток представляется возможным криоконсервировать ткань яичника для дальнейшей трансплантации после завершения терапии основного заболевания и достижения стабильной ремиссии. Показано, что трансплантация криоконсервированной ткани яичника способствует восстановлению эндокринной и репродуктивной функции яичников [11, 12], однако она противопоказана онкологических больным с умеренным или высоким из-за возможности повторной имплантации злокачественных клеток, которые могут привести к рецидиву основного заболевания. К сожалению, для этих пациенток на данный момент нет альтернативы для сохранения фертильности [10, 13].

В последние десятилетия многочисленные исследовательские группы по всему миру работали над разработкой стратегии трансплантируемого искусственного яичника для восстановления репродуктивной и эндокринной функции этого органа. Она направлена на создание искусственного яичника на основе изолированных преантральных фолликулов.

Современные подходы для сохранения и восстановления онкофертильности

В жизни огромного количества женщин происходят события, нарушающие естественный процесс созревания фолликулов. Например, репродуктивная система может пострадать из-за агрессивного онкологического лечения (химиотерапия, радиотерапия), особенно если оно было проведено до наступления пубертатного возраста. Также большое негативное влияние на сохранение репродуктивной функции оказывают пограничные опухоли яичника, некоторые аутоиммунные заболевания, иммуносупрессорная терапия при трансплантации костного мозга, а также генетические заболевания (например, талассемия) [14]. В самых тяжелых случаях есть вероятность полной утраты репродуктивной функции организма, так как фолликулы очень уязвимы к жесткому воздействию химических веществ [15]. Иногда овариальный резерв может быть низким без влияния диагнозов, в силу индивидуальных особенностей организма или неустановленных внешних факторов.

Для женщин с онкологическими диагнозами есть возможность перед началом лечения пройти программы ВРТ, чтобы получить зрелые ооцит-кумулюсные комплексы, криоконсервировать их и иметь в будущем шанс на беременность. Однако, у этого метода есть недостатки: для более успешного проведения программы ВРТ требуется гормональная стимуляция суперовуляции, которая противопоказана при наличии гормонально-чувствительных типов опухолей, так как существует риск спровоцировать их рост; противопоказано ее проведение одновременно с химиотерапией, а также ее эффективность снижена у пациенток старше 35 лет.

Еще одна возможность сохранить репродуктивный потенциал – криоконсервация фрагментов кортекса яичника, полученных в процессе овариэктомии или биопсии. Полученную овариальную ткань в будущем можно использовать для трансплантации на место удаленного органа (ортотопическая трансплантация), в перитонеальный карман или в другое подходящее место вне тазовой полости, например, подкожно (гетеротопическая трансплантация) после завершения лечения основного заболевания [16]. Эта методика уже позволила женщинам во всем мире родить после перенесенных заболеваний и удаления яичников [11]. Также существуют свидетельства того, что после трансплантации собственной ткани яичника эндокринная функция этого органа восстанавливается у 95% женщин [17]. Стоит отметить, что это единственный метод сохранения фертильности для пациенток препубертатного возраста.

Но возможность для такой манипуляции есть не всегда: нельзя трансплантировать обратно ткань яичника, если в ней наблюдались онкологические процессы. Известно, что наибольший риск переноса злокачественных клеток при аутотрансплантации кортекса яичника наблюдается при лейкемии, нейробластоме, лимфоме Беркитта и раке яичника [18]. Также существует риск того, что трансплантированная ткань не приживется в силу ишемии [19].

Для того, чтобы решить вышеописанные проблемы в сфере сохранения и восстановления фертильности у пациенток с онкологическими диагнозами, в последние годы было проведено множество исследований, ставящих своей целью сохранение овариального резерва и избавление от злокачественных клеток. Этого можно добиться путем стимуляции созревания фолликулов in vitro, то есть попытаться воссоздать весь процесс фолликулогенеза ex vivo (технология in vitro growth, IVG), или путем создания овариального конструкта на основе преантральных фолликулов, пригодного для пересадки, – искусственного яичника [16]. Оба подхода имеют важные преимущества по сравнению с трансплантацией ткани яичника: в них есть возможность применения методики даже при онкологических заболеваниях яичника, так как фолликулы полностью отделяются от окружающих их клеток теки, эпителия, соединительной ткани и других типов соматических клеток [20]. Несмотря на то, что в последнее время появляется все больше протоколов искусственного созревания фолликулов, у них есть ограничения: до зрелой стадии, пригодной к оплодотворению, можно довести in vitro не все фолликулы, а только начиная со вторичной стадии [21]. Такой подход не подходит для пациенток препубертатного возраста, а также не решает задачу восстановления эндокринной функции яичника.

Преимущества искусственного яичника по сравнению с другими технологиями

По сравнению с вышеописанными методами, технология искусственного яичника имеет несколько важных преимуществ. В ней отсутствует необходимость гормональной стимуляции цикла, а также ее применение возможно даже при онкологических заболеваниях яичника, так как фолликулы полностью отделяются от окружающих их клеток. Поскольку фолликулы заключены в базальную мембрану, которая предотвращает прямой контакт между фолликулярными клетками, кровеносными и лимфатическими капиллярами и лейкоцитами [22], их изоляция гарантирует, что злокачественные клетки не будут пересажены пациенту. Таким образом, технология создания искусственного яичника на основе выделенных из кортикальной ткани преантральных фолликулов имеет большие перспективы для сохранения и восстановления фертильности пациенток даже в самых тяжелых ситуациях.

Также искусственный яичник может стать незаменимым инструментом, облегчающим и ускоряющим клинические испытания новых противоопухолевых препаратов, а также применяться в исследованиях по влиянию факторов окружающей среды на процесс фолликулогенеза.

Необходимые условия для создания искусственного яичника

На данный момент уже существуют определенные требования к прототипам искусственного яичника [16]. Во-первых, искусственный яичник должен включать в себя фолликулы, выделенные из криоконсервированной или свежей ткани яичника, а также, возможно, соматические клетки яичника для выработки факторов роста, стимуляции ангиогенеза и структурной поддержки фолликулов [23]. Так как изолированные преантральные фолликулы в виде суспензии, без подходящей окружающей среды не способны к росту и развитию, для создания искусственного яичника необходимо подобрать подходящий скаффолд – заменитель естественной ниши фолликулов (рисунок). Он должен быть не токсичным, не вызывать воспаления, способствовать или хотя бы не препятствовать ангиогенезу и рассасываться после пересадки овариального конструкта или не мешать росту и миграции фолликулов [16].

На протяжении трех последних десятилетий были протестированы различные материалы, подходящие на роль заменителя внеклеточного матрикса фолликулов. Их можно разделить на две группы в зависимости от происхождения материала: естественные и синтетические.

К естественным материалам относятся: альгинаты, коллаген, фибронектин, ламинин, матригель, желатин, плазма крови, децеллюляризованная ткань яичника. Эти полимеры в большинстве случаев не вызывают отторжения в организме и быстро рассасываются [24]. Также их важное достоинство – возможность управлять их жесткостью путем изменения концентрации полимера в растворе. На основе альгината, фибрина и матригеля были разработаны специальные двухслойные структуры, с различающимися по плотности слоями, имитирующие кортекс и строму яичника [25, 26]. Одни из скаффолдов естественного происхождения, жесткостью которых можно точно управлять – скаффолды на основе альгинатов и фибрина (фибриноген+тромбин). Выяснено, что более мягкие альгинатные скаффолды в большей степени способствуют росту фолликулов и лучше воспроизводят их естественное окружение [27]. В поисках скаффолда с оптимальными характеристиками проводились работы с использованием смесей различных материалов. Например, были созданы скаффолды на основе фибрина и альгината, фибрина и коллагена [20, 28, 29], фибрина и лизата тромбоцитов [30], фибрина и гиалуроновой кислоты [31]. Эти работы показали выживание и рост преантральных фолликулов мыши, макаки-резуса и человека до антральных стадий. Существует также подход, основанный на культивировании преантральных фолликулов в скаффолде из децеллюляризованного яичника человека [32].

Последние достижения в сфере искусственного яичника

На сегодняшний момент с помощью овариальных конструктов на основе преантральных фолликулов были получены зрелые (находящиеся на стадии метафазы второго деления мейоза, MII) ооциты в экспериментах, использующих мышей и свиней в качестве модельного объекта [33–38]. Изолированные преантральные фолликулы культивировали in vitro в каплях плазмы крови и коллагеновых каплях в течение 5–7 дней, а затем пересаживали мышам иммунодефицитных линий на срок от 2 дней до 12 недель [33–35]. После пересадки конструктов мышам с помощью ВРТ и естественным способом было получено живое потомство. Также зрелые фолликулы и потомство из примордиальных фолликулов было получено и при культивировании in vitro в фибриновых каплях с добавлением VEGF (vascular endothelial growth factor, фактор роста эндотелия сосудов) [20].

Зрелые человеческие фолликулы антральной стадии развития были получены после культивирования в капле плазмы [36], фибриновой капле [31] и последующей ксенотрансплантации мышам. Полностью зрелые (MII) фолликулы человека были получены in vitro только из вторичных фолликулов с помощью культивирования в двухфазной системе: 0,5% альгинат до антральной стадии, затем культивирование в чашках с низкой адгезией [37].

Таким образом, технология искусственного яичника имеет подтвержденные результаты, доказывающие ее эффективность: на животных моделях показано, что с ее помощью возможно обеспечить созревание человеческих преантральных фолликулов до антральных стадий роста, пригодных для оплодотворения и получения здорового эмбриона.

Однако, для того, чтобы данная технология получила клиническое применение в области сохранения фертильности женщин, необходимы дальнейшие исследования для поиска более щадящих протоколов выделения ооцитов, оптимального дизайна овариального конструкта для сохранения жизнеспособности и роста фолликулов, восстановления сосудистого снабжения трансплантата. Известно, что клетки эндотелия из сосудов стромы яичника могут способствовать лучшей васкуляризации искусственного яичника [38], но при их переносе существует риск переноса также и злокачественных клеток. С другой стороны, такие клетки наиболее совместимы с организмом пациентки. Также одним из наиболее сложных и критических моментов при разработке биоинженерного искусственного яичника является выбор 3D-скаффолда для трансплантации изолированных фолликулов и клеток [39]. Для создания овариальных конструктов уже были испытаны различные полимеры: как синтетические [40–42], так и натуральные [31, 43–46]. На данный момент нет единого мнения о том, какие полимеры подходят для создания искусственного яичника наилучшим образом, так как они обладают разными свойствами, положительными и негативными.

Более того, скаффолды, созданные для инкапсуляции изолированных фолликулов и соматических клеток яичника, могли бы применяться в работах по биоинженерии других органов репродуктивной системы [47].

Также стоит отметить, что гораздо более быстрому развитию технологии искусственного яичника могут способствовать исследования фолликулогенеза in vivo, а также немаловажно изучить вопросы влияния культивирования фолликулов в условиях овариаль­ного конструкта на генетический материал ооцитов.

Заключение

Подводя итоги, хотелось бы отметить, что технология трансплантируемого искусственного яичника в будущем могла бы принести огромную пользу для восстановления фертильности пациенток с онкологическими диагнозами, имеющих противопоказания для трансплантации криоконсервированной ткани яичника. Также важно подчеркнуть, что эта технология может иметь и другие важные применения: например, с ее помощью можно было бы проследить в реальном времени механизмы фолликулогенеза и оогенеза, а ее применение в токсикологических исследованиях могло бы пролить свет на влияние различных лекарств на репродуктивную функцию женщин.

Таким образом, создание искусственного яичника станет революционным шагом в области инженерии репродуктивной ткани.