Точные причины и механизмы развития преэклампсии до конца не ясны [1], однако в последнее время появились данные о разделении преэклампсии на раннюю (развившуюся до 34 недель беременности) и позднюю (развившуюся после 34 недель беременности) в зависимости от механизма ее развития [2]. Считается, что в патогенезе преэклампсии участвует ряд взаимосвязанных патологических процессов, в том числе нарушения инвазии трофобласта и формирования плацентарного дерева [3].
Инвазия вневорсинчатого трофобласта в ткань матки является ключевым процессом успешного эмбриогенеза и плацентации [4]. Деградация миоцитов вокруг спиральных артерий матки и замена эндотелиальных клеток эндоваскулярным трофобластом приводит в конечном итоге к своеобразному ремоделированию сосудов, обеспечивающему оптимальный маточно-плацентарный и межворсинчатый кровоток. Поверхностная инвазия трофобласта и неполное преобразование спиральных артерий лежат в основе развития преэклампсии [5]. При этом важная роль в процессах плацентации отводится так называемым кисспептинам и их рецепторам [6, 7].
Значительная роль в процессах успешного развития беременности и регуляции инвазии трофобласта в последнее время отводится KISS-1 гену и его рецептору GPR54, который был открыт в 1996 г. J.H. Lee с соавт. как ген супрессор метастазирования в клетках меланомы кожи [8]. Продуктом гена KISS-1 является метастин, который в свою очередь является лигандом для рецептора GPR54. Метастин и GPR54 экспрессируются в плаценте при нормальной беременности и участвуют в модуляции инвазии трофобласта путем ингибирования миграции клеток трофобласта [9].
Плацента является одним из наиболее богатых источников кисспептинов в человеческом организме. В плаценте KISS-1 выявлен в синцитиотрофобласте, а GPR-54 – в синцитиотрофобласте и также в ворсинчатом и вневорсинчатом трофобласте, предполагая возможную паракринную регуляцию [10]. В результате ряда исследований при применении иммуногистохимического анализа было установлено повышение экспрессии KISS-1 только в наблюдениях при раннем начале преэклампсии, а не при позднем ее дебюте. Вместе с тем уровень экспрессии GPR54 у пациенток с ранней (развившейся до 34 недель беременности) и поздней (развившейся после 34 недель беременности) преэклампсией и женщин с нормально протекавшей беременностью не имел достоверных отличий [2].
Цель исследования: изучить иммуногистохимические особенности экспрессии KISS и его рецептора GPR54 в терминальных ворсинах плаценты при преэклампсии.
Материал и методы исследования
В основу работы положен морфологический анализ 55 последов. Первую группу составили последы от 15 пациенток в возрасте от 21 до 38 лет, течение беременности у которых осложнилось развитием ранней (до 34 недель беременности) преэклампсии (табл. 1). Вторая группа – последы от 20 беременных в возрасте от 23 до 41 года с поздней (после 34 недель беременности) преэклампсией. Все наблюдения каждой группы были разделены на подгруппы в зависимости от тяжести течения преэклампсии: умеренная и тяжелая. Контрольную группу составили 20 пациенток (в возрасте от 18 до 40 лет) с физиологическим течением беременности и не имевшие экстрагенитальной патологии.
Критериями включения послужили: умеренная и тяжелая преэклампсия, соответствующая критериям МКБ-10, одноплодная беременность и согласие женщины на проведение исследования. Критериями исключения были: другие гипертензивные и метаболические осложнения беременности, генетические нарушения и пороки развития плода, инфекционная патология матери и/или плода, тяжелая соматическая патология матери и многоплодная беременность.
Макроскопическое изучение последов и взятие кусочков для гистологического исследования проводили в соответствии с рекомендациями [11]. Фрагменты ткани плаценты фиксировали в 10% нейтральном формалине. Гистологическое исследование проводили на парафиновых срезах, окрашенных гематоксилином и эозином.
Иммуногистохимическое исследование проводили на парафиновых срезах толщиной 3–4 мкм с использованием автоматизированной системы окрашивании «BenchMark-XT» (Ventana Medical Systems, Roshe), поликлональных кроличьих антител к KISS1 (разведение 1:500, Abbiotec), GPR54 (KISS-1R) (разведение 1:500, Abbiotec). В качестве фонового красителя использовали гематоксилин. Количественную оценку выраженности экспрессии изученных маркеров проводили в синцитиотрофобласте и эндотелиоцитах капилляров терминальных ворсин плаценты по уровню средней оптической плотности при помощи системы анализа изображения на базе микроскопа «Nicon Eclipse 80i» с использованием программы «Nis Elements 3.2». Статистическую оценку количественных данных проводили с использованием программного пакета «Statistica 8.0».
Результаты исследования
Всем пациенткам в обеих группах проводилась терапия преэклампсии согласно современным клиническим рекомендациям, включающая профилактику судорожной активности с использованием магния сульфата, профилактику респираторного дистресс-синдрома – при родоразрешении до 34 недель беременности, 2–3-компонентную гипотензивную терапию, с использованием α2-адреномиметиков (метилдопа), блокаторов кальциевых каналов (нифедипин), α-адреноблокаторов (метопролол).
Во всех наблюдениях ранней преэклампсии родоразрешение осуществлялось путем операции кесарева сечения, что было обусловлено необходимостью досрочного родоразрешения в связи с тяжестью преэклампсии и неготовностью родовых путей, во II группе кесарево сечение было проведено в 14 (70 %) наблюдениях (р<0,05).
На гистологических препаратах плаценты контрольной группы, окрашенных гематоксилином и эозином, ворсинчатое дерево в основном было представлено терминальными ворсинами, порядка 20–30% его площади составляли зрелые промежуточные ворсины. В целом строение ворсинчатого дерева соответствовало сроку беременности. Имелось небольшое количество синцитиальных узелков, отражающих компенсаторно-приспособительные процессы, а также отмечались умеренные отложения фибриноида, преимущественно вокруг стволовых ворсин, и мелкие фокусы кальциноза в области базальной пластинки.
При анализе наблюдений преэклампсии нами было установлено преобладание процессов разветвленного ангиогенеза в структуре ворсин: множество мелких терминальных ворсин с многочисленными синцитио-капиллярными мембранами и большим количеством синцитиальных почек. Более выраженные изменения отмечались при тяжелых формах преэклампсии. Кроме того, в большинстве изученных нами наблюдений установлены нарушения плацентарного кровообращения в виде мелких тромбов в сосудах хориальной пластинки и стволовых ворсин, а также многочисленных мелких инфарктов ворсинчатого дерева. Несколько чаще инфаркты в области плацентарных септ отмечались в наблюдениях ранней преэклампсии и при умеренной степени тяжести. В то же время периворсинчатые отложения фибриноида чаще наблюдались у беременных с тяжелыми формами преэклампсии.
При иммуногистохимическом изучении терминальных ворсин на препаратах плаценты контрольной группы нами установлена более выраженная экспрессия KISS по сравнению с его рецептором GPR54. При этом интенсивность реакции KISS и GPR54 в синцитиотрофобласте выше, чем в эндотелиоцитах капилляров этих ворсин.
В наблюдениях ранней тяжелой преэклампсии отмечается более высокий уровень экспрессии изученных маркеров в синцитиотрофобласте в эндотелии капилляров по сравнению с контрольными показателями: KISS – на 21,4 и 13,2% (p<0,05) (рис. а), а GPR54 – на 33,3 и 32,9% соответственно (p<0,05) (рис. б). В результате таких изменений наблюдается повышение на 7,3% по сравнению с контролем синцитио-эндотелиального градиента экспрессии KISS в терминальных ворсинах. Градиент же экспрессии GPR54 практически остался без изменений.
На препаратах ранней преэклампсии умеренной тяжести экспрессия KISS в синцитиотрофобласте терминальных ворсин на 3,6% ниже контрольного уровня, а в эндотелиальных клетках капилляров, наоборот, выше на 7,4%. При этом уровень экспрессии GPR54 в синцитиотрофобласте превышает на 11,1% контрольные показатели (p<0,05), в эндотелии не отличаются от них.
У беременных, страдающих поздней преэклампсией, экспрессия KISS выше контрольного уровня. При тяжелой форме на 17,9 и 10,3% в синцитиотрофобласте и эндотелиоцитах капилляров соответственно (p<0,05), в наблюдениях умеренной преэклампсии – на 5,7% (p>0,05) и 23,5% (p<0,05) соответственно. Вследствие подобных изменений синцитио-эндотелиальный градиент экспрессии KISS в терминальных ворсинах превышает на 6,8% (p>0,05) значения контрольной группы при тяжелой форме и меньше их на 14,6% (p<0,05) при умеренной преэклампсии.
Уровень экспрессии GPR54 в синцитиотрофобласте ворсин плаценты при поздней преэклампсии ниже контрольных показателей на 9,1% при тяжелой форме и 8,1% при умеренной тяжести (p<0,05). В эндотелиоцитах капилляров интенсивность реакции GPR54 меньше контрольного уровня в наблюдениях умеренной преэклампсии и не отличается от него при тяжелой форме. При этом синцитио-эндотелиальный градиент экспрессии GPR54 меньше (на 8,5%) контрольных значений при тяжелой преэклампсии и практически не отличается от них в наблюдениях умеренной степени тяжести.
При иммуногистохимическом изучении терминальных ворсин на препаратах плаценты контрольной группы нами установлена более выраженная экспрессия KISS по сравнению с его рецептором GPR54. При этом интенсивность реакции KISS и GPR54 в синцитиотрофобласте выше, чем в эндотелиоцитах капилляров этих ворсин (рисунок).
Таким образом, при иммуногистохимическом изучении препаратов плаценты выявлено повышение уровня экспрессии KISS при всех формах преэклампсии. В то же время интенсивность реакции GPR54 была повышена в наблюдениях ранней преэклампсии и снижена при поздней форме.
Полученные нами результаты согласуются с данными литературы о более высоком содержании мРНК KISS-1 в образцах плаценты беременных с преэклампсией по сравнению с контрольной (нормальной) группой [12]. Однако J.E. Cartwright и P.J. Williams [13] приводят данные о снижении иммуногистохимического уровня экспрессии KISS1 в структурах плаценты при преэклампсии. Возможной причиной подобных расхождений является недоучет данных о виде преэклампсии. Действительно, нами установлено, что уровень экспрессии KISS отличается в наблюдениях ранней и поздней преэклампсии и зависит от тяжести ее течения.
При микроскопическом изучении ткани плацент контрольной группы отмечено соответствие степени созревания ворсинчатого дерева сроку гестации и признаки баланса между процессами разветвленного и неразветвленного ангиогенеза.
Несмотря на увеличивающееся количество теорий патогенеза преэклампсии, большинство исследователей в последнее время поддерживают концепцию о нарушениях цитотрофобластической инвазии. Так, необходимым условием нормального развития и функционирования плаценты является врастание цитотрофобластов в материнские спиральные артерии и замещение им эндотелия и мышечной оболочки. Такое ремоделирование начинается на 18–20 неделях беременности и характеризуется преобразованием спиральных артерий в широкие кровеносные сосуды с низким сопротивлением кровотоку [14].
Недостаточная степень инвазии трофобласта может привести либо к элиминации эмбриона уже в первые недели беременности, либо, в случае прогрессирования беременности, к ограничению ростовых и функциональных возможностей плаценты с последующим развитием различных акушерских осложнений. Недостаточность второй волны цитотрофобластической инвазии, направленной на ремоделирование материнских артерий для поступления достаточного притока крови к плоду, считается основным фактором патогенеза преэклампсии [4].
Следует отметить, что между процессами инвазии трофобласта при беременности и опухолевой прогрессией существует много общего. При этом отличительной особенностью трофобластической инвазии от опухолевой является ее четкая регуляция во времени и пространстве (до 1/3 миометрия). Решающее значение в процессах регуляции инвазии трофобласта и соответственно успешного развития беременности принадлежит балансу между генами, способствующими инвазии и генами-супрессорами [15]. Особая роль в регулировании инвазии трофобласта принадлежит системе кисспептинов, включающей, в частности, KISS-1 ген и его рецептор GPR54. Наиболее высокие уровни мРНК и белка KISS-1 в плаценте отмечаются в первом триместре беременности [16], что и определяет их роль в процессах имплантации и плацентации. По мнению D.-W. Park с соавт. [9], именно кисспептинам и GPR54 принадлежит основная роль в модуляции инвазии трофобласта, которая осуществляется путем ингибирования его миграции.
Следует также добавить, что в результате применения количественных методов полимеразной цепной реакции, Вестерн-блоттинга и иммуногистохимического анализа повышение экспрессии KISS-1 было зарегистрировано только у беременных при раннем начале преэклампсии, а не при позднем ее дебюте. Согласно полученным нами данным у беременных с ранней преэклампсией отмечается более выраженная интенсивность реакции KISS и его рецептора GPR54 в изученных структурах терминальных ворсин и базальной пластинки. При этом более высокие уровни зарегистрированы нами при тяжелой форме, что согласуется с данными [14] о том, что повышение уровней мРНК и белка KISS-1 в плаценте коррелирует с тяжестью преэклампсии.
При анализе иммуногистохимических препаратов плаценты при поздней преэклампсии нами выявлено повышение уровня экспрессии KISS-1 в терминальных ворсинах и снижение интенсивности реакции GPR54 в синцитиотрофобласте ворсин по отношению к значениям контрольной группы, что подтверждает данные литературы о различиях в патогенезе ранней и поздней преэклампсии [17–19].
Следует также добавить, что более высокий уровень экспрессии KISS-1 описан в структурах плаценты при преждевременных родах [17], однако рождение детей с низкой массой тела коррелирует с более низким уровнем кисспептинов в трофобласте [20].
Представляет интерес и тот факт, что уровень циркулирующих кисспептинов у пациенток с ожирением, а также с инсулинорезистентностью, значительно ниже по сравнению с женщинами, имеющими нормальный индекс массы тела. Подобные данные о положительной корреляции между мРНК KISS-1 и индексом массы тела [21] отражают, видимо, недостаточную функцию плаценты у женщин, страдающих ожирением. Считается, что ожирение, а также инсулинорезистентность являются факторами, способствующими развитию преэклампсии [22].
Таким образом, иммуногистохимическими методами установлено повышение экспрессия KISS и его рецептора GPR54 в терминальных ворсинах плаценты при ранней преэклампсии, что, видимо, отражает процессы ограничения инвазии трофобласта и последующей недостаточности спиральных артерий. В наблюдениях поздней преэклампсии выявлено повышение уровня экспрессии KISS и снижение интенсивности реакции GPR54, свидетельствующее о различиях в морфо- и патогенезе ранней и тяжелой форм преэклампсии.
