Разработка новых методов оценки яичникового резерва относится к одной из приоритетных научных и практических задач в гинекологической эндокринологии и репродуктологии. В настоящее время существует понятие тотального овариального резерва, которое включает в себя индивидуальный запас фолликулов, зависящий от его внутриутробного развития [1, 2] и функционального резерва, представленного пулом растущих рекрутируемых фолликулов, достигших определенной степени зрелости. Традиционно широко используемый термин «овариальный резерв» эквивалентен понятию «функционального резерва».
С годами тотальный и, соответственно, функциональный овариальный резерв снижается с учетом возрастных коридоров, что приводит к физиологическому овариальному старению в пределах ожидаемых диапазонов (после 45 лет) [3, 4]. Примерно у 10% женщин наблюдаются отклонения от возрастных стандартов [5] и еще до физиологической менопаузы (40 лет) у них развивается преждевременная недостаточность яичников (ПНЯ) [6].
Клинических тестов для оценки объема примордиального пула фолликулов не существует. С помощью доступных лабораторных методов оценивается функциональный овариальный резерв на протяжении непродолжительного времени созревания преантральных и антральных фолликулов. Их маркерами являются возраст женщины, регулярность менструального цикла, уровни ФСГ, АМГ, объемы яичников и число антральных фолликулов в них. При этом АМГ нельзя относить к долгосрочным прогностическим предикторам, так как этот показатель отражает состояние овариального резерва в ограниченном временном диапазоне. На сегодняшний день не существует четких гормональных и ультразвуковых скрининговых тестов, позволяющих точно определить оставшееся количество примордиальных фолликулов в яичнике.
Представленные выше данные стали основанием для поиска новых молекулярно-биологических маркеров, на основании которых возможно задолго до момента снижения тотального овариального резерва предвидеть преждевременное истощение фолликулярного пула.
В последние десятилетия показано, что преждевременное истощение фолликулярного пула генетически предопределено нарушением синтеза белка гена FMR1 (Fragil mental retardation) и зависит от наличия в этом гене триплетных СGG последовательностей [7, 8]. Welt и соавт. в 2004 г. сообщили, что у больных с увеличением длины CGG-повторов в гене FMR1, вплоть до премутации гена (55–199 CGG повторов), отмечается статистически значимое повышение уровня фолликулостимулирующего гормона (ФСГ), снижение уровней ингибина А и В, не соответствующих их возрастной норме. Таким образом, ими было предложено использовать премутацию гена FMR1 в качестве прогностического критерия развития ПНЯ, что было подтверждено временем наступления менопаузы, на 5 и более лет опережающим возраст их сверстниц – носительниц условной нормы CGG-повторов в гене FMR1 [9].
Ген FMR1, впервые описанный в 1991 году, локализован на длинном плече Х-хромосомы в локусе Хq27.8 [10, 11]. В 5-й нетранслируемой области 1-го экзона данного гена содержатся тринуклеотидные CGG повторы [12]. На сегодняшний день наглядно продемонстрировано, что аномальное число CGG-повторов в гене FMR1 является наиболее частой генетической причиной расстройств репродуктивной системы, в частности, развития ПНЯ. Так, N.S. Chen и соавт. предположили, что изменение числа CGG-повторов ведет к уменьшению продукции белка гена FMR1, что приводит к снижению пролиферативной способности фолликулов, блокаде их роста, созревания и развития, в результате чего нарушается биосинтез половых гормонов [13].
В последующем были проведены исследования, демонстрирующие влияние данного гена на овариальный резерв яичников животных. Так, в 2005 году Sullivan и соавт. показали влияние гена FMR1 на овариальный резерв у мышей за счет регулирования пролиферации герминативных клеток [14]. В свою очередь, C. Lu и соавт. в 2012 году также на моделях мышей продемонстрировали, что премутационные аллели гена FMR1 (55–199 число CGG-повторов) ассоциированы с задержкой роста и развития фолликулов и индуцируют апоптоз в клетках [15].
В настоящее время в мировой литературе рассматриваются три варианта нарушений в числе CGG-повторов, трактуемые как истинная мутация или синдром ломкой Х-хромосомы (число повторов более 200) [16, 17], премутация гена FMR1 (55–199 триплетных повторов) [18, 19] и число повторов в пределах «серой зоны» (45–54 CGG повторов) [20, 21]. Н.Н. Шамилова в своем исследовании предлагает рассматривать наличие аномальных аллелей (менее 28 и более 36 CGG-повторов) в гене FMR1 у женщин как предиктор молекулярно-генетической формы ПНЯ, ассоциированной с нарушениями в Х-хромосоме. Нормативные показатели в данной работе получены на основании генетического анализа образцов крови от 364 регулярно менструирующих женщин-доноров старше 40 лет, проживающих в европейской части России, в результате чего был показан средний диапазон распределения CGG-повторов от 28 до 36 [22].
В исследовании, проведенном в США, на этнически смешанной популяции, было наглядно продемонстрировано, что 26–34 CGG-повторы представляют собой нормальный диапазон для всех этнических групп [23].
В практике акушеров-гинекологов исторически ген FMR1 использовался с целью прогнозирования повторного рождения детей с синдромом Мартина–Белла [14]. Также анализ данного гена используется для диагностики причины неврологических и психических расстройств.
Особый интерес для ученых представляет развитие патологии, сопряженной с аномальным числом CGG-повторов в гене FMR1, а также потенциал передачи последующим поколениям данных аллелей.
В настоящем обзоре обсуждается четыре варианта нарушений триплетных повторов и сопряженная с ними совокупность фенотипических, репродуктивных и неврологических нарушений.
Истинная мутация гена FMR1 встречается в общей популяции в 1: 4000 случаев мужчин и приблизительно 1: 5000-8000 женщин и является причиной развития синдрома ломкой Х-хромосомы – FRAXA (fragile X syndrome) [24], обусловленного резкой экспансией тринуклеотидных CGG-повторов (феномен антиципации), локализованных в 1-м экзоне данного гена [25]. Увеличение числа повторов более 200 сопровождается аномальным метилированием промотора гена одновременным подавлением функции гена FMR1. Данный синдром, трактуемый также как синдром Мартина–Белла, является наиболее распространенной наследуемой формой неспецифической умственной отсталости.
В 1976 году J. Cantu и соавт. впервые была дана детальная характеристика клинических особенностей течения заболевания у больных с синдромом ломкой Х-хромосомы, включающая психопатические и речевые нарушения в виде двигательной расторможенности и признаков аутизма. Характерные особенности фенотипа таких пациентов включают в себя долихоцефалию и макроцефалию, выступающий лоб, удлиненное лицо, крупные ушные раковины, эпикант, светлые радужки, клювовидный нос, массивный подбородок, крупные кисти и стопы, гипермобильность суставов, макроорхизм [26]. С этого времени возрастало число работ, посвященных изучению поведенческого фенотипа при этом заболевании.
Необходимо отметить, что ген FMR1 кодирует РНК-связывающий белок – FMRP, который в литературе описан так же, как «белок умственной отсталости», так как он продуцируется в центральной нервной системе, обеспечивая синаптическую связь между нейронами и их пластичность, тем самым регулируя когнитивные функции организма (обучение, память). Белок FMRP экспрессируется в различных тканях, преобладая в нейронах. Данный белок необходим организму на протяжении всей жизни. Синтез белка FMRP при обсуждаемой патологии резко снижен и составляет от 1 до 70% от необходимого количества [13]. Считается, что увеличение числа CGG-повторов в гене FMR1 приводит к выключению транскрипционной активности гена и остановке синтеза соответствующего протеина (fragile X mental retardation protein) [27].
Литературные данные показывают, что этот протеин выполняет в мозге регуляторную, а не структурную функцию, принимая участие в регуляции процессов трансляции в мозговой ткани. Предполагается, что умственная отсталость и является следствием нарушения процессов трансляции из-за отсутствия FMRР. При изучении пациентов с синдромом ломкой Х-хромосомы также было обнаружено, что данный белок играет важную роль в пролиферации половых клеток, о чем свидетельствует высокий уровень его экспрессии в сперматогониях; в последующем продукция данного белка была обнаружена и в яичниках [28].
Одним из механизмов патологического воздействия мутаций гена FMR1 является сниженная продукция мРНК. При этом происходит блок одного или нескольких мРНК-связывающих протеинов, в связи с чем истощаются белковые запасы в клетке, что нарушает различные клеточные функции [29].
Вследствие токсического эффекта мРНК, продуцируемой мутантными аллелями гена FMR1, происходит формирование различных патологических состояний в репродуктивной, нейрокогнитивной, эндокринной и психической системах.
С другой стороны, среди родственниц пациентов с синдромом Мартина–Белла были выявлены специфические фенотипы, не характерные для данного заболевания, в частности ПНЯ. Следует отметить, что в области CGG-повторов гена FMR1 возникают так называемые динамические мутации. Суть этого явления заключается в том, что у потомков конкретного индивида в поколении может меняться количество копий CGG-повторов (феномен антиципации) матерей и сестер, больных синдромом Мартина–Белла, определяют премутацию гена FMR1. Полная же мутация, как отмечалось выше, составляет 200 и более повторов, по мнению некоторых авторов, наименьший размер аллеля, который в следующем поколении может трансформироваться в полную мутацию – не менее 59 CGG-повторов [28].
Для акушеров-гинекологов большое практическое значение имеет выявление женщин – носительниц премутационных аллелей. Распространенность данного состояния в общей популяции составляет 1: 130-250 женщин и 1: 250–810 мужчин [18]. В работе Н.Н. Шамиловой при генетическом обследовании 129 женщин с диагностируемой ПНЯ премутация гена FMR1 выявлена в 4 случаях, что составляет 3,1%; при этом, при семейных случаях (38/129 женщин) – у 7,9% (3/38), при спорадических – у 1,1% (1/91) [22].
Премутация была впервые описана M.E. Pembrey и соавт. в 1985 году. В то время было показано, что данное состояние не несет в себе патологических эффектов, за исключением возможного перехода в последующих поколениях в полную мутацию [30]. Потребовались годы, чтобы опровергнуть данные убеждения. В 1991 году было продемонстрировано как женское, так и мужское носительство премутации с различной степенью значимости физических и умственных нарушений [31].
Понятие премутации гена FMR1 на начальных этапах ее изучения было введено в связи с тем, что с одной стороны, у носителей такого числа триплетных повторов не было выявлено нарушений в репродуктивной системе, явной неврологической симптоматики и задержки умственного развития, а с другой – именно это число повторов является критичным в плане перехода в полную мутацию в последующих поколениях [32].
В исследовании S.L. Nolin и соавт. в результате обследования 1500 женщин – носительниц премутационной аллели было продемонстрировано, что самый короткий повтор, приведший к развитию полной мутации, составил 59 CGG-повторов, который наблюдался у двух женщин-носителей; в связи с этим был сделан вывод, что экспансия повторов происходит длительно в течение многих поколений [33].
Следует отметить, что работ, в которых обсуждались бы нарушения как в репродуктивной, так и в нервной системах, сопряженные с аномальным числом CGG-повторов (исключая премутационные варианты) в гене FMR1, крайне мало. Однако именно эти аспекты в настоящее время представляют большой интерес для исследователей. Для премутации гена FMR1 характерно, помимо нарушений в репродуктивной системе, развитие Х-ассоциированного тремор-атаксического синдрома в возрасте после 50 лет (FXTAS), а также формирование нейрокогнитивных, эндокринных и психических расстройств, связанных преимущественно с токсическим действием мРНК, продуцируемой мутантными аллелями гена FMR1 [34]. Кроме того, выявлена связь между развитием ПНЯ и наличием премутантного аллеля у одного из родителей. Так, установлено, что большинство женщин-носительниц премутации в гене FMR1, у которых развивалась ПНЯ, унаследовали мутантный аллель от отца и лишь в редких случаях – от матери [35].
В процессе образования половых клеток у женщин, в отличие от мужчин, число повторов может резко возрасти. Следовательно, в результате экспансии, если число повторов превысит 200, у матери с премутацией может родиться больной ребенок [13].
Повышение числа триплетных повторов, классифицируемое в мировой литературе как «серая зона», встречается в общей популяции в 5–9%. В работе Н.Н. Шамиловой при генетическом обследовании женщин с ПНЯ увеличение числа триплетных повторов от 45 до 54 выявлено у 16 из 129 больных, что составило 12,4% [22]. В исследовательской работе K. Bretherikc и соавт. (2005) и B. Bodega и соавт. (2006) было показано, что развитие ПНЯ определяется не только премутацией гена FMR1, но и числом CGG-повторов в пределах «серой зоны» [36, 37]. В данных работах авторы утверждают, что чем выше число триплетных повторов, тем чаще выявляется ПНЯ или снижение овариального резерва. При невыраженном повышении числа CGG-повторов возможно раннее снижение овариального резерва без развития финальной стадии ПНЯ. Некоторые авторы утверждают, что аномальное число CGG-повторов в пределах серой зоны характерно не только для классической формы ПНЯ, но и для пациентов с периодическими колебаниями концентрации уровня ФСГ (биохимическая форма преждевременного старения яичников) [38].
Однако в исследовании C. Bennett и соавт. при FMR тестировании 366 женщин с диагностируемой ПНЯ не было обнаружено никаких существенных различий в числе повторов в гене FMR1 по сравнению с контрольной группой. Авторы данного исследования на основе полученных результатов считают нецелесообразным рассмотрение триплетных повторов в пределах «серой зоны» аллелей гена FMR1 в качестве предиктора развития ПНЯ [39]. В Женеве было проведено исследование на 27 женщинах с бесплодием и диагностируемой ПНЯ и контрольной группой из 32 женщин с сохраненной фертильностью. В результате генетического FMR тестирования было показано, что в 22% при ПНЯ число CGG повторов находилось в диапазоне от 40 до 54, в сравнении с 3% из контрольной группы [40]. В работе Г.И. Табеевой в 2008 году у больных со стойким повышением ФСГ до 125 МЕ/л и продолжительностью аменореи 5 и более лет в возрасте до 40 лет, в 9% случаев отмечалось носительство аномального числа CGG повторов в пределах «серой зоны» [38].
Помимо нарушений в репродуктивной системе, внимание ученых было сосредоточено на выявлении корреляционной взаимосвязи аномального числа CGG-повторов в пределах «серой зоны» и развития различной соматической патологии и изменений фенотипа. Так, в исследовании X. Zhang и соавт. была выявлена связь болезни Паркинсона с носительством CGG-повторов в диапазоне от 41 до 54. В исследование вошли 360 пациентов с наследственным дрожательным параличом, из них 147 женщин и 213 мужчин, а также 295 человек из контрольной группы. В результате было выявлено 11 (3%) пациентов с паркинсонизмом, у которых число триплетных повторов варьировало от 41 до 54 в сравнении с одним носителем из контрольной группы [41]. В исследовании D.A. Hall и соавт. был проведен FMR-скрининг 335 пациентов с двигательными расстройствами, тремор-атаксическим синдромом и/или паркинсонизмом и 273 человек, не имевших на момент исследования никаких двигательных расстройств. Авторы не выявили корреляционной связи между наличием двигательных расстройств и аномальным числом CGG-повторов [42]. Исследователи из США представили три клинических случая болезни Паркинсона у женщин, которым была определена длина CGG-повторов в гене FMR1. В двух случаях длины повторов составили 23/41 и 21/51, в то время как третья женщина была носительницей премутационной аллели равной 60 [43].
Известно, что феномен антиципации характерен не только для носителей премутации, но и для носителей аномальных повторов в пределах серой зоны с фенотипическими признаками синдрома Мартина–Белла. В исследовании Fernandez-Carvajal и соавт. в 2009 году был продемонстрирован переход от серой зоны к полной мутации на протяжении двух поколений от деда к внуку. В качестве пробанда был представлен 17-летний юноша с клиническими проявлениями синдрома ломкой Х-хромосомы. Пробанд прошел тщательное клинико-анамнестическое обследование, в результате которого были выявлены признаки, характерные для синдрома ломкой Х-хромосомы. У сестры, матери и отца пробанда при проведении клинического обследования не было отмечено каких-либо патологических нарушений. Дед пробанда демонстрировал клинику тремор-атаксического синдрома. В ходе генетического исследования было выявлено, что мать и сестра являлись носителями премутационных аллелей (мать – 34–56 CGG-повторов и сестра – 91 CGG-повтор), в то время как у деда по материнской линии длина CGG-повтора равна 52, что входит в «серую зону» распределения. При этом у отца было нормальное число триплетных повторов. У пробанда зарегистрировано число повторов, которое превышало 538, на основании чего подтверждена полная мутация гена FMR1. Авторы отмечают, что при передаче мутационных аллелей от матери к сыну отмечается резкая нестабильность экспансии. В данной работе был наглядно продемонстрирован переход мутационных аллелей от серой зоны к полной мутации в двух поколениях. Частота данных переходов крайне редкая и составляет 1,1% [44].
Экспансия триплетных повторов на протяжении двух поколений была также доказана в исследовании A. Terracciano и соавт., в котором проведено FMR тестирование трех поколений семьи 8-летнего пробанда с признаками, характерными для синдрома Мартина–Белла. Ни у кого из родственников пробанда ранее случаев умственной отсталости выявлено не было. В результате исследования показано, что у матери пробанда число повторов равнялось 29/61, в то время как у ее двух сестер – число триплетных повторов составило 31/44. У одной из сестер была дочь, которая также явилась носительницей аномальных аллелей 22/44. У бабушки по материнской линии число триплетных повторов находилось в пределах нормативных значений. Ни одного случая ПНЯ у респондентов выявлено не было. Дедушка по материнской линии и двое его братьев скончались, оставшейся брат был носителем короткого аллеля, равного 23. У пробанда выявлена полная мутация. Несмотря на отсутствие информации о числе повторов у деда пробанда по материнской линии, интерпретация результатов исследования становится очевидной. Более вероятно, что дед являлся носителем длины CGG повторов, равной 44, которая была стабильно передана двум дочерям, а затем и внучке. Авторы предположили, что расширение триплетных повторов до 29/61 у матери пробанда в данной семье произошло вследствие митотического проскальзывания репликации, что привело к тому, что мать стала носителем премутационного аллеля с последующим развитием полной мутации у сына [45].
На основе вышеизложенного становится очевидным, что число триплетных повторов в диапазоне от 45 до 54 на сегодняшний день является фактором риска по развитию неврологической симптоматики и экспансии тринуклеотидного повтора в последующих поколениях, что представляет большой интерес для исследователей.
В литературе последних лет появились научные изыскания, в которых обсуждается роль коротких повторов в гене FMR1 (менее 26–28), оказывающих воздействие на репродуктивную и нервную системы. Начиная с 2009 года показано, что у женщин с коротким числом CGG повторов развивается ПНЯ [29, 46]. Однако работ, в которых прослеживалась бы корреляционная зависимость между короткими повторами в гене FMR1 с генотипическими и фенотипическими особенностями у их носителей, крайне мало. В исследовании J.Y. Wang и соавт. (2013 г.) показано, что у мужчин с коротким числом CGG повторов даже в пределах нормативного его распределения наблюдается умственная отсталость. Данное исследование продемонстрировало влияние коротких триплетных повторов в гене FMR1 на структуры мозга, отвечающие за умственные способности [47]. Наиболее полновесная работа, посвященная данному вопросу и представленная в 2014 году M.R. Mailick и соавт., была проведена на этнически однородной популяции, включающей 10 317 человек в возрасте от 17 до 18 лет, окончивших Висконсинскую среднюю школу. Время наблюдения составило 54 года, возраст обследуемых к финалу достиг 72 лет. Анализ был проведен с учетом 5 конечных точек с интервалом 18, 17, 12 и 7 лет соответственно. При этом изучались когнитивные и познавательные способности, а также психическое здоровье испытуемых в динамике. На финальном этапе исследования дополнительно был проведен анализ числа триплетных повторов в гене FMR1 в слюне методом полимеразной цепной реакции 6732 респондентов, из них 3263 (48,5%) были мужчинами и 3469 (51,5%) составляли женщины. Нормальный диапазон варьировал от 24 до 40 CGG-повторов, медиана 30,6. В дальнейшее исследование были включены 46 женщин (1.8%) и 341 мужчина (11%): носители коротких CGG повторов. Для мужчин наименьший аллель был 9, в то время как для женщин он составил 11.
В процессе сравнительного анализа носители коротких повторов в юном возрасте не выделялись по IQ коэффициенту с респондентами с нормальным числом CGG повторов с учетом гендерной принадлежности. Однако с возрастом в равной степени, как мужчины, так и женщины продемонстрировали снижение когнитивных способностей.
Анамнестически у женщин с коротким числом триплетных повторов в два раза чаще выявлялся рак молочной железы и в 4 раза чаще – рак эндометрия, в сравнении с группой женщин с нормальным числом триплетных повторов в гене FMR1. Особенно важно подчеркнуть, что дети, рожденные носительницами коротких длин CGG-повторов, гораздо чаще (отношение шансов 1,68, р<0,05) страдали различной степенью инвалидности, связанной с нарушениями интеллектуального развития (умственная отсталость, биполярные расстройства, различные варианты психоневрологической симптоматики). Не было выявлено влияния длин CGG-повторов на возникновение тревожных и депрессивных состояний. При этом было продемонстрировано, что женщины с коротким числом CGG-повторов в 6 раз чаще страдали повышенной тягой к алкоголю. В то время как у мужчин данная корреляция не прослеживалась [48].
На основе вышеизложенного становится очевидным, что знание о длине CGG-повторов в гене FMR1 крайне важно не только для генетиков, но и для акушеров-гинекологов, неврологов и психиатров. Так, в 2009 году N. Gleicher и соавт. было показано, что при каждом снижении на 5 CGG-повторов ниже 30 относительный риск преждевременного снижения уровня АМГ возрастает на 60% (p<0,002), а для каждого повышения на 5 CGG-повторов – возрастает на 40% (p<0,01) [49].
Американский комитет акушеров-гинекологов (ACOG) предлагает проводить FMR тестирование всем женщинам с установленным диагнозом ПНЯ неятрогенного генеза. [50]. В свою очередь, комитет медицинских генетиков США рекомендует проводить FMR скрининг всем женщинам с беcплодием и повышенным уровнем ФСГ, особенно с семейной историей ПНЯ, а также наличием у ближайших родственников клинических признаков, характерных для синдрома ломкой Х-хромосомы и/или умственной отсталости [51].
В связи с вышеизложенным, во многих клиниках ЭКО в США и в Израиле тестирование на ген FMR1 входит в обязательный перечень обследования перед включением пациенток в программу ЭКО. Проведение подобного скрининга, с нашей точки зрения, необходимо всем пациенткам, которые имеют клинико-анамнестические факторы риска формирования ПНЯ, включающие наличие в анамнезе ПНЯ у матери (RR=8,33), олигоменореи с менархе (RR=3,6), эпидемического паротита и краснухи в анамнезе (RR=2,88, RR=2,82), аутоиммунного тиреоидита (RR=4,5), а также наличие аутоиммунной патологии неэндокринного генеза (миастении, витилиго, системной красной волчанки, тромбоцитопенической пурпуры, злокачественной анемии, алопеции, болезни Крона и др.) и носительства аллелей комплекса гистосовместимости HLA II класса DRB1*01, DRB1*03, DQB1*0501, DQB1*0302 (RR=2,11, 2,08, 1,81, 2,16).
При выявлении аномального числа CGG повторов в гене FMR1 в сочетании с клиническими факторами риска развития ПНЯ пациенткам показано определение уровня АМГ в крови 1 раз в 6–12 месяцев с учетом уровня ФСГ. При крайне низких уровнях АМГ необходимо предлагать экстренное включение в программу ЭКО или криоконсервацию яйцеклеток, что позволит сохранить собственный генетический материал пациенток, либо реализовать репродуктивную функцию.
