Results of preimplatation genetic screening of embryos in married couples with sperm DNA fragmentation

Kiseleva Yu.Yu., Azova M.M., Kodyleva T.A., Ushakova I.V., Kirillova A.O., Ekimov A.N., Rakitko A.S., Volodyaeva T.O., Mishieva N.G., Abubakirov A.N.

1Research Center of Obstetrics, Gynecology, and Perinatology, Ministry of Health of Russia, Moscow 117997, Ac. Oparina str. 4, Russia 2Peoples’ Friendship University of Russia, Moscow 117198, Miklukho-Maklaya str. 6, Russia 3M.V. Lomonosov Moscow State Medical University, Moscow 119991, Leninskie Gory, 1, Russia
Objective. To determine the frequency of aneuploidies (monosomies, trisomies, disomies, nullisomies) from all chromosomes, as well as DNA deletions and amplifications in the embryos from couples with higher and normal sperm nuclear DNA fragmentation levels.
Subjects and methods. An array-based preimplatation genetic screening program was applied to 170 couples; each couple underwent estimation of sperm concentration, motility and morphology according to the 2010 WHO standards, as well as sperm nuclear DNA fragmentation levels by the TUNEL method.
Results. A relationship was found between the level of paternal sperm DNA fragmentation and the frequency of obtaining embryos with a normal karyotype. With the increased level of DNA fragmentation, this figure is 47.96% vs 66.17% with its normal level (p < 0.02). There was also a substantially increased frequency of embryo DNA deletions and amplifications with a higher level of paternal sperm DNA fragmentation (35.89% vs 5.39% with its normal level; p < 0.001). Fragmentation does not have a statistically significant impact on abnormal chromosome number.
Conclusion. This study has demonstrated a correlation between the level of paternal sperm DNA fragmentation and the frequency of structural karyotype abnormalities in embryos.

Keywords

DNA fragmentation
preimplatation genetic screening
aneuploidies
aCGH
TUNEL

Мужское бесплодие является многофакторным синдромом, охватывающим широкое разнообразие расстройств, причина которого в более чем половине случаев неизвестна. Бесплодие у мужчин может быть диагностировано путем анализа спермы. По результатам спермограммы определяется ряд функционально важных параметров, чьи нормы устанавливаются рекомендациями ВОЗ и с течением времени уточняются [1].

В ряде исследований было обнаружено значительное увеличение частоты эмбриональных хромосомных аномалий (полиплоидий, нулисомий, мозаичности и анеуплоидий по половым хромосомам) в парах, где партнер является носителем деструктивных изменений сперматозоидов, таких как повышенный уровень фрагментации ДНК ядра или изменения в морфологии сперматозоидов [2].

Зачастую эякулят содержит сперматозоиды с повреждениями ДНК в виде двойных или однонитевых разрывов, что особенно характерно для субфертильных мужчин [3]. Существует множество работ, посвященных влиянию фрагментации ДНК ядра сперматозоида на репродуктивную функцию. Многие исследователи сходятся во мнении, что присутствует связь между высоким уровнем повреж­дения ДНК сперматозоида и потерей беременности на раннем сроке. Так, мета-анализ, основанный на 16 когортных исследованиях (2969 пар), показал значительное увеличение частоты случаев раннего выкидыша у пациентов с высокой степенью повреждения ДНК мужских половых клеток. Причем наиболее значимые результаты продемонстрировал метод TUNEL, что свидетельствует о его высокой чувствительности [4]. Также обнаружено, что сперматозоиды с численными хромосомными аномалиями более подвержены фрагментации ДНК, однако причина подобной взаимосвязи остается неизвестной. Тот факт, что метод ИКСИ (от англ. ICSI — IntraCytoplasmic Sperm Injection, введение сперматозоида в цитоплазму, интрацитоплазматическая инъекция сперматозоида) позволяет аномальным сперматозоидам достичь яйцеклетки, привел к опасениям, что у полученного таким образом эмбриона возрастет риск появления аномалий генетического материала. В одном из исследований была обнаружена корреляция между долей сперматозоидов с нарушениями кариотипа и уровнем фрагментации ДНК (Р<0,05), в связи с чем было сделано предположение, что в ходе сперматогенеза имеет место апоптоз (процесс, который, как известно, сопровождается активной деградацией ДНК), направленный на устранение генетически аномальных сперматозоидов. Этот важнейший вывод проливает свет на биологические механизмы уничтожения аномальных сперматозоидов [5].

Фрагментация ДНК сперматозоидов коррелирует со стандартными параметрами спермограммы. Обычно первым шагом в диагностической оценке мужского бесплодия выступает оценка функциональных параметров сперматозоидов. Однако в связи с тем, что повышенный уровень фрагментации ДНК сперматозоидов является потенциальной причиной репродуктивной дисфункции, его исследование было предложено в качестве важного параметра оценки мужского бесплодия, особенно перед применением вспомогательных репродуктивных технологий [6]. Мужчины с высоким уровнем фрагментации ДНК имеют значительно более низкие шансы на зачатие естественным путем или с помощью таких процедур, как внутриматочная инсеминация или ЭКО. Парам с данным нарушением может быть предложен метод лечения ИКСИ, поскольку его использование продемонстрировало хорошие результаты [7].

Несмотря на многочисленные исследования, вклад повышенного уровня фрагментации ДНК сперматозоидов в появление хромосомных аномалий у плода недостаточно изучен. В данной связи целью настоящей работы было изучить встречаемость анеуплоидий (моносомий, трисомий, дисомий, нулисомий), а также делеций и амплификаций ДНК у эмбрионов в парах с повышенным и нормальным уровнем фрагментации ДНК ядра сперматозоидов.

Материал и методы исследования

В исследование были включены 170 пар. Каждая пара прошла полное обследование в соответствии с Приказом МЗ РФ № 107Н от 13/08-2012 «О применении вспомогательных репродуктивных технологий в терапии женского и мужского бесплодия». Средний возраст женщин составил 31,6±3,8 года, мужчин – 35,5±6,5 года. Проведение исследования было одобрено этическим комитетом ФГБУ Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова Минздрава России.

Определение уровня фрагментации ДНК проводилось методом TUNEL, при этом подсчитывалась доля TUNEL-позитивных клеток в препарате. Согласно литературным данным, пациенты, у которых обнаруживают более 15% TUNEL-позитивных сперматозоидов, имеют сниженную результативность ЭКО, и уровень выше 15% признается патологичным [8].

Отобранные для исследования пары были разделены на две группы с учетом уровня фрагментации ядра сперматозоидов: I группа (n=112) – пары с нормальным уровнем фрагментации ядра сперматозоидов, средний возраст женщин составил 31,6±3,8 года, мужчин – 35,5±6,5 года; II группа (n=82) – пары с повышенным уровнем ядра сперматозоидов более 15%, средний возраст женщин составил 31,8±4,1 года, мужчин – 36,5±5,4 года.

Со 2-го дня менструального цикла и до дня введения триггера овуляции пациенткам вводили индивидуально подобранную дозу рекомбинантного ФСГ (пурегон/гонал) от 112,5 МЕ до 200 МЕ в сутки. В процессе стимуляции дозу корригировали в зависимости от ответа яичников. При достижении фолликулами диаметра 14 мм, для предотвращения преждевременного пика ЛГ пациенткам вводился антагонист гонадотропин рилизинг гормона (цетрореликс 0,25 мг). Триггер овуляции вводили при наличии в яичниках ≥3 фолликулов диаметром ≥17 мм. Трансвагинальная пункция яичников выполнялась через 35–36 часов после введения триггера овуляции.

Всем пациентам была проведена программа экстракорпорального оплодотворения методом ИКСИ с последующей биопсией эмбрионов.

Оценку зрелости ооцитов в циклах ИКСИ проводили во время проведения процедуры ИКСИ, в день трансвагинальной пункции. Зрелой (MII) яйцеклетка считается при наличии четко различимого полярного тельца. Контроль оплодотворения проводили через 16–18 часов. Наличие двух четко различимых пронуклеусов (2PN) свидетельствовало о нормально оплодотворившемся ооците. Оценку степени развития и морфологию эмбрионов осуществляли ежедневно. Оценка морфологии проводилась по бальной системе на 2-е сутки. Эмбрионы, не имеющие никаких морфологических аномалий, получали максимальную оценку в 3,5 балла. При наличии отклонений от нормальных параметров в морфологии оценка эмбриона снижалась на 0,5 балла. Оценка эмбрионов 5-х суток осуществляется согласно классификации Гарднера. Эмбрионы, достигшие стадии бластоцисты, подвергались биопсии трофоэктодермы на 5-е сутки развития и криконсервировались по протоколу Kitazato методом витрификации. Культивирование эмбрионов осуществляли в средах ISM1 и BlastAssist, Origio (Дания).

Забранный биопсийный биоматериал был подвергнут преимплатационному генетическому скринингу методом сравнительной геномной гибридизации на чипах (aCGH) с использованием оборудования фирмы Agilent (США). Полногеномную амплификацию ДНК исследуемых клеток проводили с помощью набора PicoPlex SingleCell WGA Kit (Rubicon Genomics, США). Мечение ампликонов выполнялось с помощью набора SureTag DNA labeling Kit Agilent (США) согласно прилагаемой инструкции. Меченые ампликоны наносили на биочип Sure Print G3 8×60 aCGH Agilent (США), гибридизировали в течение 16 часов, после чего проводили отмывку и сканирование на сканере биологических чипов Sure ScanMicroarrayScanner. Интерпретацию полученных результатов проводили с помощью программного продукта Agilent CytoGenomics 2.5.8.1.

В рамках представленной работы определялась частота эмбрионов с численными и структурными аномалиями хромосом. Для сравнения средних в группах применяли модификацию t-теста Стьюдента для наблюдений с весами [9], реализованную в пакете R language [10]. В качестве весов использовали число биопсированных эмбрионов. Для подтверждения полученных результатов также применяли непараметрический критерий Манна–Уитни–Уилкоксона, рассчитанный с помощью программы Statistica 6.0 [11].

Результаты и обсуждение

Данные, полученные в ходе исследования, приведены в таблице.

Статистическая обработка результатов преимплатационного генетического скрининга эмбрионов выявила достоверное отличие группы с повышенным уровнем фрагментации ДНК ядра сперматозоидов (более 15%) от группы с нормальными значениями данного показателя. Была обнаружена корреляция между уровнем фрагментации ДНК сперматозоидов отца и кариотипом полученных эмбрионов. Установлено, что частота нормального кариотипа составляет 47,96% при повышенном уровне фрагментации ДНК против 66,17% при нормальном уровне фрагментации (p<0,02).

Некоторые авторы также связывают нарушения репродуктивной функции мужчин с фрагментацией ДНК. В многочисленных работах была показана корреляция отклонения параметров спермы от нормальных с высоким количеством хромосомных аномалий в сперматозоидах, включая анеуплоидии, полиплоидии и аберрации [12]. Более того, фрагментация ДНК и дисперсия хроматина были повышены у бесплодных мужчин, и в особенности, у пациентов с олигоастенотератоспермией [13]. Проведенный нами анализ частоты трисомий и моносомий как по аутосомам, так и по половым хромосомам, не выявил статистически значимых различий между группами с нормальным и повышенным уровнем фрагментации ДНК. Вместе с тем, в рамках данной работы было обнаружено существенное увеличение частоты делеций и амплификаций у эмбрионов в парах с повышенным уровнем фрагментации ДНК сперматозоидов (35,89% против 5,39% при нормальном уровне фрагментации, p<0,001), что позволяет предполагать возможность передачи нарушений в структуре ДНК сперматозоидов в генетический материал эмбриона. Также немаловажен тот факт, что согласно ряду исследований, повреждение семенной ДНК оказывает отрицательное влияние на оплодотворение и частоту имплантации эмбрионов и играет сопричастную роль в наступлении спонтанных абортов в ситуациях естественного наступления беременности [14].

Заключение

Степень целостности семенной ДНК, таким образом, может стать существенным предиктором для случаев мужского бесплодия. Это особенно значимо в случаях множественных неудачных попыток вспомогательных репродуктивных технологий, либо когда речь идет о пациентах – мужчинах позднего репродуктивного возраста, так как у последних наблюдается значительно большее, в сравнении с нормой, количество дефектов генетического материала сперматозоидов и эпигенетических нарушений [15]. Это позволяет нам предполагать, что общепринятые методы анализа спермы, а именно – определение концентрации, подвижности сперматозоидов и морфологический анализ (все указанные показатели обладают высокой биологической вариабельностью) более не являются достаточными для определения того, в какой степени нарушения в генетическом материале определяют мужское бесплодие. Действительно, в случаях, когда один или большее количество вышеописанных стандартных параметров не соответствуют нормативным, Всемирная организация здравоохранения рекомендует оценку нуклеарной стабильности спермы посредством анализа фрагментации ДНК и дисперсии хроматина спермы [16]. Применение данного исследования позволит семейным парам избежать дорогостоящих процедур, повторяющихся неудач или потерь беременности. Следует также отметить, что одним из наиболее эффективных способов отбора эмбрионов, способных к имплантации и не несущих генетических аномалий, является метод полногеномного генетического скрининга. Результаты представленного исследования позволяют сделать вывод о значимости анализа фрагментации ДНК ядра сперматозоидов отца и последующего преимплатационного генетического скрининга эмбрионов для эффективной реализации программ вспомогательных репродуктивных технологий.

Supplementary Materials

  1. Table. The frequency of anomalies in the number and structure of chromosomes in groups with a normal and high level of fragmentation of sperm DNA

References

1. Руководство ВОЗ по лабораторному исследованию эякулята человека и взаимодействия сперматозоидов с цервикальной слизью. Пер. с англ. 4-е изд. М.: МедПресс; 2001. [WHO laboratory manual for examination of human semen and sperm-cervical mucus interaction. 4th ed. WHO; 1999.]

2. Kaarouch I., Bouamoud N., Louanjli N., Madkour A., Copin H., Benkhalifa M., Sefrioui O. Impact of sperm genome decay on Day-3 embryo chromosomal abnormalities from advanced-maternal-age patients. Mol. Reprod. Dev. 2015; 82(10): 809-19.

3. Belloc S., Benkhalifa M., Cohen-Bacrie M., Dalleac A., Chahine H., Amar E., Zini A. Which isolated sperm abnormality is most related to sperm DNA damage in men presenting for infertility evaluation. J. Assist. Reprod. Genet. 2014; 31(5): 527-32.

4. Robinson L., Gallos I.D., Conner S.J., Rajkhowa M., Miller D., Lewis S. et al. The effect of sperm DNA fragmentation on miscarriage rates: a systematic review and meta-analysis. Hum. Reprod. 2012; 27(10): 2908-17. doi: 10.1093/humrep/des261.

5. Enciso M., Alfarawati S., Wells D. Increased numbers of DNA-damaged spermatozoa in samples presenting an elevated rate of numerical chromosome abnormalities. Hum. Reprod. 2013; 28(6): 1707-15. doi: 10.1093/humrep/det077.

6. Evgeni E., Charalabopoulos K., Asimakopoulos B. Human sperm DNA fragmentation and its correlation with conventional semen parameters. J. Reprod. Infertil. 2014; 15(1): 2-14.

7. Gandini L., Lombardo F., Paoli D., Caruso F., Eleuteri P., Leter G. et al. Full-term pregnancies achieved with ICSI despite high levels of sperm chromatin damage. Hum. Reprod. 2004; 19(6): 1409-17.

8. Руднева С.А., Брагина Е.Е., Арифулин Е.А., Сорокина Т.М., Шилейко Л.В., Ермолаева С.А., Курило Л.Ф., Черных В.Б. Фрагментация ДНК в сперматозоидах и ее взаимосвязь с нарушением сперматогенеза. Андрология и генитальная хирургия. 2014; 4: 26-33. [Rudneva S.A., Bragina E.E., Arifulin E.A., Sorokina T.M., Shileyko L.V., Ermolaeva S.A., Kurilo L.F., Chernykh V.B. Fragmentation of DNA in spermatozoa and its relationship with impaired spermatogenesis. Andrologiya i genitalnaya hirurgiya. 2014; 4: 26-33. (in Russian)]

9. Goldberg L., Kercheval A., Lee K. t‐statistics for weighted means in credit risk modeling. J. Risk Finance. 2005; 6(4): 349-65.

10. R Core Team R: A language and environment for statistical computing. Vienna, Austria: R Foundation for Statistical Computing; 2016. Available at: https://www.R-project.org/

11. Mann H., Whitney D. On a test of whether one of two random variables is stochastically larger than the other. Ann. Math. Statist. 1947;18(1): 50-60.

12. Cohen-Bacrie P., Belloc S., Menezo Y.J., Clement P., Hamidi J., Benkhalifa M. Correlation between DNA damage and sperm parameters: a prospective study of 1,633 patients. Fertil. Steril. 2009; 91(5): 1801-5.

13. Belloc S., Hazout A., Zini A., Merviel P., Cabry R., Chahine H. et al. How to overcome male infertility after 40: Influence of paternal age on fertility. Maturitas. 2014; 78: 22-9.

14. Sakkas D., Alvarez J.G. Sperm DNA fragmentation: mechanisms of origin, impact on reproductive outcome, and analysis. Fertil. Steril. 2010; 93(4): 1027-36.

15. Benkhalifa M., Montjean D., Belloc S., Dalleac A., Ducasse M., Boyer P. et al. Emerging molecular methods for male infertility investigation. Expert Rev. Mol. Diagn. 2014; 14(1): 37-45.

16. World Health Organization. WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen. 5th ed. Geneva: World Health Organization; 2010.

Received 03.10.2016

Accepted 11.11.2016

About the Authors

Kiseleva Yulia Yu., embryologist, Research Center of Obstetrics, Gynecology and Perinatology, Ministry of Health of Russia; graduate student of the Department of Biology and General Genetics Medical Faculty, Peoples’ Friendship University. 117997, Russia, Moscow, Ac. Oparina str. 4. Тel.: +79164171311. Е-mail: 79164171311@yandex.ru
Azova Madina M., DSc, Associate Professor, Head of the Department of Biology and General Genetics Medical Faculty, Peoples’ Friendship University.
117198, Russia, Moscow, Miklukho-Maklaya str. 6. Tel.: +74954345300.E-mail: azovam@mail.ru
Kodyleva T.A., embryologist 1st gynecology department, Research Center of Obstetrics, Gynecology, and Perinatology, Ministry of Health of Russia.
117997, Russia, Moscow, Ac. Oparina str. 4. Tel.: +74954382622. E-mail: t_kodyleva@oparina4.ru
Ushakova I.V., Ph.D., embryologist, department of reproductive, Research Center of Obstetrics, Gynecology and Perinatology, Ministry of Health of Russia.
117997, Russia, Moscow, Ac. Oparina str. 4. Tel.: +79859289287. E-mail: ir_ushakova@oparina4.ru
Kirillova Anastasiya O., embryologist, Research Center of Obstetrics, Gynecology and Perinatology, Ministry of Health of Russia.
117997, Russia, Moscow, Ac. Oparina str. 4. Тel.: +74954382622. Е-mail: a_kozyreva@oparina.ru
Ekimov Alexey N., researcher, Research Center of Obstetrics, Gynecology and Perinatology, Ministry of Health of Russia.
117997, Russia, Moscow, Ac. Oparina str. 4. Тel.: +74954382622. Е-mail: a_ekimov@oparina4.ru
Rakitko Aleksandr S., PhD student, Department of Theory of Probability, Faculty of Mathematics and Mechanics, M.V. Lomonosov Moscow State University.
119991, Russia, Moscow, Leninskie Gory, 1. Tel.: +79104820017. E-mail: rakitko@gmail.com
Volodyaeva Tatiana O., embryologist, Research Center of Obstetrics, Gynecology and Perinatology, Ministry of Health of Russia.
117997, Russia, Moscow, Ac. Oparina str. 4. Тel.: +79993255305. Е-mail: tvolo90@mail.ru
Mishieva Nona G., MD, Senior researcher of 1st gynecology department, Research Center of Obstetrics, Gynecology and Perinatology, Ministry of Health of Russia.
117997, Russia, Moscow, Ac. Oparina str. 4. Тel.: +79104244197. E-mail: nondoc555@mail.ru
Abubakirov Aydar N., PhD, Head of 1-st gynecology department, Research Center of Obstetrics, Gynecology and Perinatology, Ministry of Health of Russia.
117997, Russia, Moscow, Ac. Oparina str. 4. Тel.: +74954382622. Е-mail: nondoc555@yahoo.com

For citations: Kiseleva Yu.Yu., Azova M.M., Kodyleva T.A., Ushakova I.V., Kirillova A.O.,
Ekimov A.N., Rakitko A.S., Volodyaeva T.O., Mishieva N.G., Abubakirov A.N. Results of preimplatation genetic screening of embryos in married couples with sperm DNA fragmentation.
Akusherstvo i Ginekologiya/Obstetrics and Gynecology. 2017; (8): 104-8. (in Russian)
http://dx.doi.org/10.18565/aig.2017.8.104-8

Similar Articles

By continuing to use our site, you consent to the processing of cookies that ensure the proper functioning of the site.