Предымплантационная диагностика (ПД) направлена на выбор генетически здоровых эмбрионов in vitro и их перенос в полость матки женщины в рамках программы экстракорпорального оплодотворения (ЭКО).
Изначально ПД стала применяться для супружеских пар, имеющих высокий риск рождения ребенка с X-сцепленными заболеваниями и включенных в программу ЭКО [2, 3].
Дальнейшее развитие методов ПД позволило использовать ее не только для определения пола, но и для выявления анеуплоидий, хромосомных транслокаций, генных мутаций [1, 4, 7]. Перенос эмбрионов без хромосомных нарушений может повысить эффективность программ ЭКО и предупредить рождение больных детей в этой группе пациентов.
Цель исследования — определить частоту анеуплоидий хромосом 13 и 21, X, Y, 21 у эмбрионов супружеских пар с нормальным кариотипом, включенных в программы вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ).
Материал и методы исследования
Исследование проведено на эмбрионах 37 супружеских пар с бесплодием в 41 цикле стимуляции суперовуляции.
У 15 супружеских пар ПД эмбрионов была проведена с исследованием хромосом 13, 21 в 19 циклах ВРТ. У одной супружеской пары было проведено 3 цикла ВРТ, у одной — 2. Средний возраст пациенток в этой группе составил 36 лет. Показаниями к проведению диагностики были возраст супругов и в ряде случаев желание самих пациенток (1-я группа).
У 22 супружеских пар в 22 циклах ВРТ была проведена ПД с исследованием хромосом Х, Y и21. Средний возраст пациенток в этой группе составил 34,7 года (2-я группа). Доля женщин в возрасте старше 35 лет в 1-й группе составила 50,4%, во 2-й группе — 34,9%.
Биопсию бластомеров проводили на 3-й день развития эмбриона in vitro. Для диагностики и последующего переноса выбирали эмбрионы, имеющие 6-10 бластомеров и фрагментацию не более 50%. Эмбрионы с фрагментацией бластомеров более 50% в ряде случаев подвергали биопсии по просьбе пациентов.
В качестве основы подготовки ядра и гибридизации in situ служил протокол, рекомендуемый фирмой-производителем. В ходе исследования данный протокол нами был оптимизирован.
Для идентификации хромосом в ядрах бластомеров применяли зонды фирмы «ABBOTТ» (Vysis, каталожные номера: 05J38-010, 32-131023, 32-132024, 32-190002). Микроскопический анализ проводили при увеличении 100×10 с использованием флюоресцентного микроскопа Axioplan 2 фирмы «Zeiss», оборудованного соответствующим набором фильтров фирмы «ABBOTТ» (Vysis) и системой автоматического анализа изображения ISIS, разработанной фирмой «Metasystems».
Результаты исследования и обсуждение
В 1-й группе после проведения ПД перенос эмбрионов был осуществлен в 18 циклах стимуляции суперовуляции (из–за отсутствия цитогенетически здоровых эмбрионов у 1 пациентки перенос был отменен).
Среднее количество эмбрионов, пригодных для переноса, равнялось двум. У7 женщин беременность наступила с первой попытки (36% на цикл или 38% на перенос). У 1 пациентки при переносе 3 эмбрионов была получена беременность тройней. Однако в I триместре 1 плод саморедуцировался.
Несмотря на проведение диагностики, в одном наблюдении беременность в I триместре была прервана в связи с обнаружением анэмбрионии плода (кариотип хориона 46,ХХ) при УЗИ. У 1 пациентки при УЗИ плода во II триместре беременности выявлена гипоплазия почек. Беременность по решению женщины была сохранена, ее исход неизвестен. Остальные беременности закончились родами здоровыми детьми.
Всего в 19 циклах стимуляции суперовуляции было получено 136 ооцитов, из которых после оплодотворения развились 112 (82,4%) эмбрионов, из них пригодных по качеству для диагностики и перспективных для последующего переноса было 80 (71,4%). Однако мы исследовали все доступные для ПД эмбрионы. Биопсия произведена у 107 эмбрионов хорошего и плохого качества. Для диагностики оказались пригодными 74 ядра (часть бластомеров не содержала ядер, часть была многоядерной).
При исследовании 74 ядер из одноядерных бластомеров результат был получен в 68 (91,9%) (рис. 1, см. на вклейке). При этом нормальный набор хромосом определен в 42 (61,8%) ядрах, а в 26 (38,2%) отмечены различные типы анеуплоидии (см. рис. 1). Нарушение числа хромосомы 21 наблюдали в 11 ядрах из 26, при этом трисомия хромосомы 21 выявлена в 6 наблюдениях. Анеуплоидия хромосомы 13 имела место в 10 из 26 наблюдений, из них трисомия обнаружена в 2.
Одновременное присутствие анеуплоидии хромосом 13 и 21 выявлено в 5 (19,2%) из 26 наблюдений. Среди эмбрионов с хромосомной патологией только 3 (11,5%) из 26 морфологически не соответствовали третьему дню развития.
Из 5 эмбрионов с одновременным присутствием анеуплоидий по разным хромосомам у 2 обнаружены отклонения в морфологическом строении.
Средний возраст женщин, у которых были выявлены эмбрионы с трисомией хромосомы 21, составил 32,2 года. У 1 пациентки в возрасте 31 года выявлено 2 эмбриона с данной трисомией. При наличии эмбрионов с трисомией хромосомы 13 (2 наблюдения) возраст женщины составил 35 лет.
Следует отметить, что из 6 эмбрионов с трисомией хромосомы 21 только один эмбрион морфологически не соответствовал третьему дню развития, а оба эмбриона с трисомией хромосомы 13 не имели отклонений.
После проведения процедуры забора бластомера дальнейшее развитие пригодных для переноса эмбрионов наблюдали в 83% случаев.
Во 2-й группе ПД эмбрионов на анеуплоидию хромосом X, Y, 21 была проведена у супружеских пар, страдающих вторичным бесплодием. У части супружеских пар ранее проводили лечение бесплодия методами ВРТ.
Перенос эмбрионов осуществлен в 20 циклах, в 2 случаях переноса не было в связи с отсутствием цитогенетически здоровых эмбрионов. Среднее количество эмбрионов, пригодных для переноса, составило 2, беременность наступила у 6 женщин (27,3% на цикл, 30% на перенос). У 3 пациенток диагностирована беременность двойней, у одной из них в I триместре произошла саморедукция одного плода.
Всего в 22 циклах было 210 ооцитов, из которых после оплодотворения было получено 150 (71,4%) эмбрионов. Пригодных по качеству для диагностики было 114 (76%) эмбрионов. Биопсия была произведена у 143 эмбрионов морфологически нормального строения и у эмбрионов, морфологически не соответствовавших третьему дню развития.
При исследовании 107 ядер из одноядерных бластомеров результат был получен в102 (95,3%). Среди 102 проанализированных ядер 71 содержало нормальный набор изучаемых хромосом, что составило 69,6%, в 31 (30,4%) отмечены различные типы анеуплоидии (рис. 2, см. на вклейке).
Изменения в комплексе гоносом выявлены в 11 ядрах из 31, при этом трисомия по половым хромосомам была отмечена в 6 наблюдениях (в 4 случаях — XXY, в 2 случаях — ХХХ), тетрасомию и моносомию хромосомы Х наблюдали в 2 случаях, в 1 наблюдении обнаружена моносомия хромосомы Y.
Анеуплоидия хромосомы 21 обнаружена в 12 (38,7%) наблюдениях из 31, из них трисомия и моносомия были представлены в равных долях (по 6 наблюдений).
Одновременное присутствие анеуплоидии гоносом и хромосомы 21 было выявлено в 8 (25,8%) наблюдениях из 31.
Возраст женщин, у которых были выявлены эмбрионы с трисомией хромосомы 21, варьировал от 36 до 43 лет, в среднем составил 40,2 года. У 1 женщины 38 лет выявлено 2 эмбриона с данной трисомией.
Из 6 эмбрионов с трисомией хромосомы 21 не соответствовали нормам морфологического строения 2 эмбриона. Среди эмбрионов с анеуплоидией гоносом 3 из 11 морфологически не соответствовали третьему дню развития.
Среди эмбрионов с одновременной анеуплоидией разных хромосом отмечено самое большое число эмбрионов с отклонениями в морфологическом строении (3 из 8).
После проведения процедуры забора бластомера дальнейшее развитие пригодных для биопсии эмбрионов наблюдали в 84% случаев.
ПД в клинической практике для исключения рождения генетически больного ребенка должна стать неотъемлемой частью ВРТ. Однако при проведении ПД у женщин старше 35 лет мы отметили ряд проблем. С одной стороны, учитывая возраст пациенток и высокий риск рождения ребенка с генетическими нарушениями, необходимость проведения ПД не вызывает сомнений. С другой стороны, у женщин старшего репродуктивного возраста в программе ВРТ получают мало эмбрионов, а их качество нередко не подходит для проведения ПД.
Проведенное исследование показало, что эмбрионы, имеющие в хромосомном наборе анеуплоидии, нередко (71‒88,5%) могут быть морфологически нормальными. При отсутствии проведения генетического исследования их можно было бы в дальнейшем использовать в программе ВРТ. Так, эмбрионы с трисомией хромосомы 21 имеют отклонения в морфологическом строении только в 16,7 — 33% наблюдений, в остальных наблюдениях они вполне соответствуют критериям визуального отбора для переноса в полость матки.
Среди эмбрионов с одновременной анеуплоидией различных хромосом несоответствие по морфологическому строению отмечается чаще, чем при анеуплоидии одной хромосомы: от 37,5 (при исследовании хромосом Х,Y, 21) до 40% (при исследовании хромосом 13, 21) против 16,7 и 33% соответственно. Такого же мнения придерживаются и другие авторы. По результатам исследования V. Baltaci и соавт. [6], 36,1% эмбрионов, визуально соответствовавших морфологическим нормам, могут иметь генетические нарушения.
Средний возраст женщин, у которых при исследовании хромосом 13 и 21 выявлена анеуплоидия хромосомы 21, составил 32,2 года. В связи с этим мы считаем, что проведение ПД с исследованием эмбрионов на различные типы анеуплоидии можно предлагать всем пациентам программы ВРТ в виде скрининга. Женщинам старше 35 лет следует обязательно рекомендовать ПД при наличии достаточного количества эмбрионов визуально нормального морфологического строения. Уже показано, что у женщин после проведения скрининга эмбрионов частота наступления беременности выше, чем у женщин, у которых такой анализ не проводили. По мнению многих авторов, селекция и перенос эмбрионов с нормальным хромосомным набором увеличивают частоту имплантации, снижают риск спонтанных абортов и предупреждают рождение детей с генетической патологией при проведении программы ВРТ [4-6].
