Ежегодно в мире 500 тыс. женщин заболевают раком шейки матки (РШМ). Заболеваемость РШМ по странам различна и составляет 3,6 на 100 тыс. женского населения в Финляндии, в России этот показатель составляет 16,2 на 100 тыс. женщин. Из года в год растут показатели заболеваемости, особенно среди женщин репродуктивного возраста [1]. Основным фактором риска развития РШМ является инфицирование человека ДНК-содержащим вирусом папилломы человека (ВПЧ), поражающим эпителий шейки матки. В литературе широко обсуждаются подходы к созданию цитологических и молекулярных методов ранней диагностики и скрининга предрака и РШМ. Так, цитологический метод, имея высокую специфичность, уступает молекулярным методам диагностики своей чувствительностью [3]. ВПЧ тестирование позволяет безопасно расширить интервалы скрининга [7]. Таким образом, ВПЧ тестирование, проводимое отдельно, или вместе с цитологическим исследованием дает возможность надежного, более эффективного скрининга РШМ.
Важным аспектом использования ВПЧ тестирования как для первичного скрининга, так и в качестве дополнения к жидкостной цитологии, является мониторинг ВПЧ- положительных женщин. Такие женщины в возрасте 30 лет и старше, имеющие цитологическое заключение – NILM (negative for intraepithelial lesion or malignancy) должны через 1 год сдать повторно анализы [11].
При исследовании механизма проникновения ВПЧ в участки поврежденного эпителия выявили, что на начальных этапах вирус взаимодействует со специфическими гепаран-сульфатными рецепторами базальной мембраны и базальных кератиноцитов многослойного плоского эпителия в зоне трансформации шейки матки [8], которая представляет собой границу между плоским и цилиндрическим эпителием. Здесь происходит замещение и превращение одного вида эпителия в другой и сосредоточены прогениторные клетки. Зона трансформации шейки матки в соответствии с современными представлениями является нишей стволовых клеток эндоцервикса (НСКЭ), то есть ограниченным специализированным микроокружением, которое интегрирует и осуществляет межклеточные сигналы для регуляции и поддержания гомеостаза принадлежащих ей стволовых клеток. Ниша активно участвует в регуляции дормантного состояния и пролиферации тканевых стволовых клеток и дифференцировке их потомства, она обеспечивает самоподдержание пула тканевых стволовых клеток. Одно из назначений ниши в тканях взрослого организма заключается в ограничении пролиферации и установлении баланса между процессами пролиферации и апоптоза
стволовых клеток, что необходимо для поддержания тканевого гомеостаза.
Другое назначение ниши – создание условий для максимальной защищенности стволовых клеток от внешних воздействий. Патологические процессы, вызванные воздействием ВПЧ, начинаются в этой зоне и вызывают ее ремоделирование. Под процессом ремоделирования понимают изменение существующей структуры ткани, ее переустройство или дополнение чем-либо. Несмотря на высочайший интерес к проблеме предрака и РШМ, морфологические и молекулярные механизмы ремоделирования НСКЭ под воздействием ВПЧ остаются мало изученными.
Целью нашей работы было изучение ремоделирования НСКЭ при ВПЧ-ассоциированном предраке и микроинвазивном РШМ.
Материал и методы исследования
Проведено ретроспективное клинико-морфологическое и молекулярно-биологическое исследование на цитологическом, биопсийном и операционном материале от 251 больной различной ВПЧ-ассоциированной патологией шейки матки: плоской кондиломой – 80 женщин, цервикальной
интраэпителиальной неоплазией(CIN) I – 47, CIN II–III – 110, микроинвазивной карциномой –
14 женщин. Средний возраст пациенток составил 42±10 лет. Всем пациенткам проведено цитологическое и гистологическое исследования. Для цитологического исследования цервикальные образцы этих женщин были собраны в среду для жидкостной цитологии и окрашены по Папаниколау в системе TriPath (B&D, USA). Результаты оценивали по классификации Вethesda. Для уточнения цитологического диагноза ASC-US (atypical squamous cells of undetermined significance), а также при L-SIL (low grade squamous intraepithelial lesion) и H-SIL (high grade squamous intraepithelial lesion), проводили иммуноцитохимическое (ИЦХ) выявление онкомаркеров р16INK4a (клон Е6Н4), и Ki-67 (клон
274-11 АС3) с помощью набора CINtecPLUS (mtm laboratories, Германия) на дополнительно приготовленных стеклах из материала, полученного методом жидкостной цитологии. При выявлении
L-SIL и H-SIL поводили кольпоскопию с прицельной биопсией и иммуногистохимическим (ИГХ) исследованием данных маркеров в биоптатах.
Для гистологического исследования материал фиксировали в 10% нейтральном формалине и заливали в парафин. Парафинированные серийные срезы толщиной 4 мкм окрашивали гематоксилином и эозином, а также пикрофуксином по Ван-Гизону. Для идентификации клеток с признаками стволовости в шейке матки проводили ИГХ исследования экспрессии следующих маркеров: СK17 (клон Е3, RTU, Dako, Denmark), Оct-4(клонMRQ-10,разведение1:100,СellMarque, USA), SMA (клон 1А4, разведение 1:100, Dako, Denmark), CD34 (class II, клон QBEnd, разведение 1:50, Dako, Denmark), MMP2 (поликлональные антитела, разведение 1:100, Epitomics, USA), Vimentin (клон V9, RTU, Dako, Denmark).
Докраска ядер проводилась гематоксилином по общепринятой методике. Для проведения ИГХ и ИЦХ ставили позитивные и негативные контрольные реакции. Результаты реакций оценивали полуколичественными методами в баллах и с расчетом процента позитивно экспрессирующих маркеров клеток. Провели исследование 79 женщинам по выявлению высоко онкогенных 14 типов ВПЧ методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени на приборе Сobas4800 (Roche, Switzerland). Cobas тест — полностью автоматизированная система, которая выявляет по трем отдельным каналам: индивидуально ДНК ВПЧ16, ДНК ВПЧ18 и общий пул ДНК других 12 ВПЧ генотипов (31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 и 68). Оценивали частоту выявления различных типов высоко онкогенных вирусов в целом в исследуемой группе, а также в зависимости от вида патологического процесса в шейке матки. Выявление вирусной ДНК 16 типа в биоптатах шейки матки проводили методом ПЦР in situ с использованием типоспецифических праймеров к области Е6/Е7 вирусного генома и биотин-меченных трифосфатов на приборе Hybaid OmniSlide (UK).
Результаты исследования
Исследование проводили в несколько этапов: изучали частоту разных типов ДНК ВПЧ в материале жидкостной цитологии, морфологические проявления ремоделирования НСКЭ, интеграцию генома ВПЧ с клетками хозяина и молекулярно-биологические перестройки в зоне НСКЭ.
На первом этапе изучена частота разных типов ДНК ВПЧ при предраке и микроинвазивном РШМ. Исследование проведено с использованием материала жидкостной цитологии от 79 женщин. При цитологическом исследовании определены следующие группы пациенток: NILM, в которую вошли 13 (5,2%) женщин с хроническим цервицитом . Группу женщин с диагнозом ASC-US составил 41 (16,3%) человек, L-SIL – 63 (25,1%) человека, H-SIL– 134 (53,4%) женщин. При выявлении ДНК ВПЧ высоко онкогенных типов в мазках шейки матки результаты получили в 78 (98,7%) из 79 образцов. В одном образце не прошло выделение ДНК из-за наличия сгустков клеток в пробе.
В 78 образцах выявили следующие типы вируса: ВПЧ 16 типа в 14 (37,9%) образцах, другие 12 высоко онкогенных типов ВПЧ – в 18 (48,6%) образцах, сочетание ВПЧ 16 типа с другими 12 высоко онкогенными типами ВПЧ в 5 (13,5%) образцах. ДНК ВПЧ 18 типа не была выявлена ни в одном случае. Изучена корреляция типа вируса с видом патологии шейки матки (рис. 1, см. на вклейке).
В результате проведенного исследования обнаружена ДНК ВПЧ онкогенных типов в 17 (89,5%)
случаяхиз19H-SIL.Чащедругихтиповвыявляли ВПЧ 16 типа – в 10 (58,8%) из 17 образцов. В образцах L-SIL ДНК найдена в 5 (83,3%) случаях из 6. Наиболее часто мы находили общий пул других 12 типов вирусной ДНК – в 4 (80%) из 5 случаев. В группе женщин с цитологическим диагнозом ASC-US основную долю составил отрицательный результат – в 33 (82,5%) из 40. Чаще выявляли общий пул других 12 типов вирусной ДНК – в 4 (66,7%) из 6. В группе женщин с NILM в 8 (61,5%) случаях из 13 выявили ДНК ВПЧ. Мониторинг этих пациенток требует особенно внимательного отношения. ВПЧ 16 типа чаще выявляли в H-SIL – в 10 (71,4%) случаях из 14. ДНК ВПЧ 18 типа не была обнаружена в исследуемых образцах. Большую группу с невыявленной вирусной ДНК составили женщины с ASC-US – 33 (80,5%) случая из 41. Два случая H-SIL и один случай L-SIL с отрицательными результатами cobas теста были перепроверены в другой лаборатории, где методом ПЦР в режиме реального времени на 21 тип ВПЧ подтвердили наши результаты.
Дополнение цитологического исследования ВПЧ тестированием повысило чувствительность диагностики с 83,3 до 93,6%. Полученные нами данные согласуются с результатами американских коллег на большой выборке женщин (47 208 человек) показавших, что жидкостная цитология выявляет патологические процессы в шейке матки в 53,3%, в то время как при комбинированном методе чувствительность возрастает до 96,7% [5].
На втором этапе проведена морфологическая верификация изменений НСКЭ. При морфологическом исследовании обнаружены признаки ремоделирования НСКЭ, складывающиеся из стадийно развивающихся и взаимосвязанных патологических процессов. Первые признаки ремоделирования можно обнаружить при хроническом цервиците и плоской кондиломе. Они включают в себя набухание и отек базальной мембраны под влиянием воспалительного инфильтрата, явления акантоза, неоангиогенез и склероз прилежащей соединительной ткани. Уже на этой стадии появляются черты патологической репарации с нарушением дифференцировки эпителиальных клеток и развитием дис-,
пара- и гиперкератоза, возникновением очагов зрелой и незрелой плоскоклеточной метаплазии,
а также появлением апоптозных телец, включая койлоциты.
Прогрессирование описанных изменений НСКЭ происходит при CIN I–III (рис. 2а, см. на вклейке), когда усугубляются склеротические изменения, усиливается апоптоз эпителия, воспалительная лимфогистиоцитарная инфильтрация, неоангиогенез, а также явления патологической репарации, проявляющиеся в нарастании атипизма клеток плоского эпителия, а также появлении очагов плоскоклеточной метаплазии, что детально описано в литературе [10]. Безусловно, интересным является состояние базальной мембраны НСКЭ, которая в отдельных участках может частично повреждаться воспалительным инфильтратом. Однако очаги повреждения базальной мембраны остаются репарированными за счет стромальных клеток, имеющих морфологический фенотип миофибробластов.
При микроинвазивной карциноме репарация базальной мембраны нарушается и в участки ее разрыва вторгаются с одной стороны, трансформированные эпителиальные клетки, а с другой – воспалительный инфильтрат, которые усугубляют ее деградацию (рис. 2б, см. на вклейке). На третьем этапе нами изучена интеграция генома ВПЧ с клетками хозяина и молекулярно-биологические перестройки в зоне НСКЭ. Было установлено, что при плоской кондиломе ДНК ВПЧ 16 типа обнаруживается в клетках парабазального и отдельных клетках базального слоев, а также в апоптозных тельцах, перемещающихся к поверхности плоского эпителия. При CIN I–III ДНК ВПЧ 16 также выявляется в основном в парабазальных клетках (рис. 2в, см. на вклейке), однако в атипичных клетках, экспрессирующих р16 и Ki67, она отсутствует.
Молекулярно-биологические особенности клеток в НСКЭ при патологии шейки матки, вызванной ВПЧ, проявляются в появлении признаков стволовости как в клетках мезенхимальной природы, так и в эпителии. Так, при плоской кондиломе и CIN I в воспалительном инфильтрате стромы обнаруживались разрозненно лежащие стромальные, а также в виде периваскулярных скоплений клетки с признаками стволовости, одновременно экспрессирующие Ki-67, Oct-4, CD34, SMA, Vimentin и ММP2. Кроме того, выявлялись аналогичные очаговые скопления базальных эпителиальных клеток, которые также одновременно экспрессировали СК17, Ki-67, Oct-4, CD34, SMA, Vimentin .
CIN III и микроинвазивная карцинома отличались от всех предыдущих патологических процессов появлением в НСКЭ среди пластов р16 и Ki-67 положительных атипичных клеток, клеток с признаками стволовости в виде колоний, экспрессирующих Oct-4, CD34, SMA, Vimentin и ММP2. Описанные колонии клеток имели округлую форму, состояли из 10–45 клеток, располагались как на уровне базальной мембраны (рис. 2д, см. на вклейке), так и в толще эпителиального пласта (рис. 2г,д,е, см. на вклейке ). В тех случаях, когда описанные колонии клеток обнаруживались в базальных отделах, они плавно переходили на строму и приобретали фенотип мезенхимальной клетки, что может быть проявлением феномена эпителиально-мезенхимального перехода, описанного в литературе [12]. В ткани CIN III и
в воспалительном инфильтрате стромы обнаруживались разрозненно лежащие стромальные, а также в виде периваскулярных скоплений клетки, одновременно экспрессирующие Ki-67, Oct-4, CD34, SMA, Vimentin и ММP2.
Обсуждение
Ремоделирование НСКЭ при ВПЧ инфекции – длительный и многостадийный процесс, занимающий, по данным литературы, не менее 10–15 лет. Следует отметить, что даже для осуществления внедрения вируса в ткани хозяина состояние НСКЭ имеет решающее значение. Известно, что с помощью белков L1 и L2 вирус прикрепляется к гепаран-сульфатным рецепторам, расположенным на базальной
мембране и базальных эпителиальных клетках [8]. Последнее становится возможным только в
условиях повреждения эпителиального пласта и наличия незрелой плоскоклеточной метаплазии. Интеграция генома вируса и генома базальных эпителиальных клеток хозяина является одним из ключевых событий, что манифестируется экспрессией белков вируса Е6 и Е7. Наше исследование показало, что при этом возможно вовлечение тканевых стволовых клеток.
Персистирующая вирусная инфекция поддерживает в зоне трансформации шейки матки хроническое воспаление, склеротические изменения с усилением апоптоза и пролиферации эпителия, неоангиогенеза, что, в конце концов, приводит к ремоделированию НСКЭ, а затем к патологической репарации, развитию предрака и РШМ. Следует отметить, что пролиферация клеток является необходимым условием накопления мутаций, приводящих к злокачественной трансформации клеток. Поэтому роль ВПЧ инфекции заключается не только в блокаде генов супрессоров рака р53 и Rb, но и в индукции пролиферации клеток, способствующей накоплению в них мутаций.
Ремоделирование НСКЭ сопровождается повреждением базальной мембраны, что, по всей видимости, является важнейшим стимулом для активации пролиферации мезенхимальных клеток типа миофибробластов, обладающих признаками стволовости и осуществляющих «латание дыр». Подтверждением того, что эти клетки обладают признаками стволовости, является экспрессия ими Oct-4, CD34, SMA, Vimentin и ММP2. Кроме того, отдельные СК17 позитивные базальные эпителиальные клетки также экспрессируют те же маркеры. Местами клетки с признаками стволовости распространяются по обе стороны базальной мембраны, что следует рассматривать проявлением феномена эпителиально-мезенхимального перехода. Последний наиболее четко прослеживается при CIN III и микроинвазивной карциноме. Наше исследование расширило данные литературы о специфических маркерах стволовости цервикальных клеток. Так, к таким маркерам стволовости, как p63 и цитокератин 17 [9], а также СК17, CD49 и CD71 [4] следует добавить и Oct-4, CD34, SMA, Vimentin. Экспансия опухолевых клеток с признаками стволовости носит клональный характер. По всей видимости, именно эти клетки и могут являться «раковыми стволовыми клетками».
Заключение
ВПЧ инфекция вызывает ремоделирование НСКЭ, что приводит к патологической репарации эпителия, развитию предрака и РШМ. Ключевую роль в этих процессах играет интеграция вируса с тканевыми стволовыми клетками эпителия, а также декомпенсация работы прогениторной мезенхимальной клетки. Развитие плоскоклеточного РШМ сопровождается возникновением клонов опухолевых клеток с признаками стволовости. Для улучшения ранней диагностики и профилактики РШМ следует рекомендовать комплексное обследование женщин, включающее в себя цитологический анализ с ВПЧ тестированием с оценкой состояния НСКЭ.
