Цервикальная интраэпителиальная неоплазия (CIN) – это предраковое плоскоклеточное поражение шейки матки; главным этиологическим фактором развития CIN и рака шейки матки (РШМ) является вирус папилломы человека (ВПЧ). Заболеваемость и смертность от РШМ снизились в основном из-за программ скрининга, таких как тестирование на ВПЧ и цитология шейки матки (мазок Папаниколау). Большинство видов РШМ возникают в зоне трансформации, где ВПЧ поражает полипотентные стволовые и амплифицирующиеся клетки под цилиндрическим эпителием эктопии, а также в расположенном выше канале и эндоцервикальных криптах. Лишь у небольшого процента женщин, инфицированных ВПЧ высокого риска, развивается РШМ с множеством генетических и эпигенетических модификаций. Недавно проведенные исследования показывают, что на плоскоклеточную метаплазию в зоне трансформации шейки матки влияет холинергическая сигнализация. Это может быть основано на дифференциальной реакции цилиндрического и плоского эпителия и подлежащей стромы на ацетилхолин (АЦХ) [1]. Поскольку никотин и его производные концентрируются в слизи шейки матки, сигнализация никотиновых ацетилхолиновых рецепторов (nAChR) может быть важным молекулярным кофактором канцерогенеза шейки матки, зависящего от ВПЧ.
Целевая терапия РШМ все еще находится в стадии фундаментальных исследований. Выявление заболевания в предраковом состоянии, тщательный мониторинг и лечение имеют первостепенное значение для профилактики РШМ. В данном обзоре представлена актуальная информация о функции ненейрональных nAChR человека и эпигенетических факторах, участвующих в основном патогенезе РШМ.
Эпидемиология
РШМ является одним из наиболее распространенных злокачественных новообразований у женщин; занимает 4-е место в структуре заболеваемости и смертности женщин от онкологических заболеваний (примерно 604 000 новых случаев и 342 000 смертей во всем мире в 2020 г.) [2]. Распространенность РШМ в России в 2023 г. составила 180 случаев на 100 тыс. женского населения. Путем своевременного обнаружения предраковых изменений шейки матки (CIN), в отличие от большинства других онкологических злокачественных новообразований, РШМ можно полностью предотвратить [3, 4].
Патофизиология цервикальных интраэпителиальных неоплазий
CIN представляет собой спектр опухолевых изменений многослойного плоского эпителия матки, которые были признаны предшественниками инвазивной плоскоклеточной карциномы. Различают CIN I, CIN II и CIN III в зависимости от того, какая часть эпителиального слоя содержит атипичные клетки. При CIN I клетки в двух верхних третях многослойного плоского эпителия, хотя и демонстрируют некоторые ядерные аномалии, подвергаются цитоплазматической дифференцировке. В клетках нижней трети отсутствуют признаки цитоплазматической дифференцировки или нормального созревания (потеря полярности клеток). Индекс митотической активности клеток низкий. При CIN II аномальные изменения затрагивают две нижние трети многослойного плоского эпителия. При CIN III клетки становятся недифференцированными, нестратифицированными по всей толщине. Ядерный полиморфизм является распространенным явлением, отмечается большое количество митозов с высокой пролиферативной активностью клеток. Нарушение пролиферации и ядерная атипия клеток многослойного плоского и цилиндрического эпителия шейки матки происходит на фоне длительной персистенции ВПЧ высококанцерогенного риска, особенно 16 и 18 типов.
У человека обнаружено более 200 типов папилломавирусов, из них около 40 типов ВПЧ поражают эпителиальную и слизистую оболочки аногенитального тракта. Среди типов ВПЧ высокого риска 16 и 18 типы в 90% всех случаев ответственны за возникновение РШМ.
ВПЧ поражает базальные клетки плоского эпителия хозяина через микротравму. Вирус интегрируется в базальные эпителиальные клетки хозяина, где инициирует ряд генетических и эпигенетических модификаций в онкогенах и генах-супрессорах опухоли, способствующих репликации вируса. Прогрессирование инфицированных ВПЧ эпителиальных клеток до инвазивного рака – это долгосрочный процесс, связанный с накоплением изменений ДНК в генах клеток хозяев [5]. Геном всех ВПЧ содержит следующие три функциональные части: раннюю (E) область, которая кодирует белки (E1–E7), необходимые для репликации вируса; позднюю (L) область, которая кодирует структурные белки (L1–L2), необходимые для сборки вириона; и в значительной степени – некодирующую часть, называемую длинной контрольной областью, которая содержит цис-элементы, необходимые для репликации и транскрипции вирусной ДНК [6]. Белки E1 и E2 инициируют репликацию вирусной ДНК, а также действуют в качестве активаторов транскрипции [6]. Онкопротеины E5, E6 и E7, кодируемые ВПЧ, являются основными факторами, ответственными за онкогенную трансформацию и прогрессирование РШМ. Белок E5 вызывает уклонение от иммунного ответа и способствует повышенной пролиферации клеток [7]. Белок Е6 связывается с супрессором опухоли р53 [8], а белок Е7 взаимодействует с белками-супрессорами опухоли семейства ретинобластом (RB1, RBL1 и RBL2), одной из функций которых является подавление чрезмерного роста клеток путем ингибирования клеточного цикла. Связывание белков приводит к задержке дифференцировки клеток и способствует репликации ВПЧ. Репликация ВПЧ происходит, когда клетка вступает в S-фазу клеточного цикла. Это достигается путем инактивации белка-супрессора опухоли (pRb) и высвобождения факторов транскрипции (E2F), которые запускают клеточный цикл из контрольной точки G1. Семейство E2F может опосредовать как пролиферацию клеток, так и p53-зависимый или независимый апоптоз. В результате клетка хозяина накапливает все больше и больше поврежденных ДНК. Накопленные клеткой мутации приводят к трансформации клеток в раковые клетки [9].
Эпигенетические изменения при раке шейки матки
Недавние исследования демонстрируют, что эпигенетическая регуляция экспрессии генов играет фундаментальную роль в патогенезе многочисленных злокачественных новообразований, включая РШМ. Например, существуют клинически используемые методы, которые оценивают гиперметилирование или гипометилирование ДНК, связанное с активацией онкогена и геномной нестабильностью при раке молочной железы. Такие наборы могут быть разработаны и использованы для раннего выявления, прогнозирования и лечения РШМ, в связи с обратимостью эпигенетических модификаций [10]. Поэтому эпигенетические модификации могут служить мощным инструментом для стратификации риска, прогнозирования и лечения новообразований шейки матки, вызванных ВПЧ [11].
Эпигенетика – наследуемое изменение экспрессии генов без изменения последовательности ДНК. Это влияет на состояние здоровья и многие заболевания, в том числе рак. Процессы эпигенетической регуляции включают метилирование ДНК, модификацию гистонов и регуляцию микроРНК. Исследования в области эпигенетических изменений показали, что аномальное метилирование клеточной ДНК является распространенным изменением рака, и гиперметилирование конкретных областей ДНК во время канцерогенеза может служить чувствительным инструментом скрининга, особенно потому, что в опухолях, вызванных ВПЧ, были обнаружены различные модели метилирования генов-супрессоров опухолей [12]. Таким образом, маркеры или механизмы эпигенетической регуляции могут помочь исследователям понять инициацию и прогрессирование рака.
Метилирование ДНК привлекло внимание в качестве альтернативного метода молекулярной диагностики и прогнозирования инфекции ВПЧ [11].
Метилирование ДНК – это добавление метилгрупп к ДНК в 5-й позиции цитозина ДНК-метилтрансферазой. Метилирование ДНК, которое включает в себя сайты CpG в регуляторных последовательностях, приводит к заглушению генов, в то время как активные гены имеют гипометилированные или неметилированные сайты. Аномальное метилирование ДНК может произойти уже при плоскоклеточном интраэпителиальном поражении низкой степени (LSIL). Обнаружение измененного метилирования ДНК на данном этапе играет важную роль, поскольку LSIL может либо регрессировать, либо прогрессировать к более высоким поражениям.
В исследованиях было показано, что возможную связь с ранним патогенезом РШМ имеют сайты метилирования ДНК, которые включают молекулу клеточной адгезии 1, молекулу соединительной адгезии В, член семейства доменов ассоциации Ras 1 и хрупкую гистидиновую триаду [13]. Уровень экспрессии метилирования увеличился от CIN I до инвазивного рака, в то время как аномальное метилирование не обнаруживается в нормальной ткани шейки матки [14].
Модификация гистонов при раке шейки матки
Гистоны играют важную роль в определении структуры хроматина. Модификации гистона являются одним из примеров эпигенетического изменения и представляют собой ключевой механизм, с помощью которого регулируется локальная экспрессия генов. Балансировка ацетилирования и деацетилирования гистонов важна для экспрессии генов. Появление гистонового деацетилирования в генах супрессоров опухоли приводит к прогрессированию рака [15].
Инфекция ВПЧ опосредует модификацию клеточного хроматина, что приводит к дифференциальному профилю экспрессии генов-хозяев. Эти изменения часто происходят на островах CpG промоторов генов под воздействием деацилметилтрансферазы.
Белок ВПЧ E2 ассоциируется с деметилазой H3-K4, лизинспецифической деметилазой 5C для деметилирования регуляторной области ВПЧ18, чтобы снизить раннюю промоторную активность, что приводит к снижению экспрессии E6/E7. Еще одним признаком контроля, опосредованного ВПЧ, является снижение глобальных уровней H3-K27me3 под регулированием KDM6A и KDM6B, которые конкретно нацелены на H3-K27, и их экспрессия увеличивается с активностью E7, что приводит к транскрипционному подавлению хроматина. Увеличение ацетилирования гистонов, индуцированное E7, может потребоваться для активации генов, чувствительных к фактору E2F [16].
Некодирующие РНК (ncRNA)
Некодирующие РНК (ncRNA) в основном делятся на два вида: структурные ncRNA и регуляторные ncRNA. Структурные ncRNA включают переносные РНК (тРНК) и рибосомные РНК (rRNA); самыми известными типами ncRNA являются микроРНК (miРНК, miR) и длинные ncRNA (lncRNA). Молекулярные изменения, ведущие к трансформации эпителиальных клеток шейки матки в результате длительной персистенции ВПЧ, приводят к нарушению регуляции экспрессии miРНК, lncRNA, что способствует прогрессированию CIN.
В многочисленных исследованиях было продемонстрировано, что уровень экспрессии miR отличается в клетках РШМ по сравнению с нормальными образцами шейки матки [17–19]. Экспрессия miR-29a, miR-34a, miR-99a-5p, miR-100-5p, miR-199a-3p, miR-203 и miR-218-5p была понижена, экспрессия miR10a-5p, miR 16-5p, miR 25-5p, miR 92a-3p и miR 196a-5p была повышена в CIN I, а также в CIN II–III и в клетках РШМ по сравнению с неопухолевыми тканями шейки матки.
Вирусные онкогены могут влиять на уровень экспрессии микроРНК: белок Е6, кодируемый онкогенными типами ВПЧ, снижает экспрессию miR-34a при РШМ [20]. Таким образом, микроРНК могут быть полезными биомаркерами прогрессирования неоплазий шейки матки.
Несколько видов lncRNA, включая HOTAIR, H19, MALT1, CCAT2, SPRY4-IT1, GAS5, CCHE1, MEG3, LET, EBIC и PVT1, играют важную роль в прогрессировании РШМ [21]. HOTAIR влияет на регуляцию фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), матричной металлопротеиназы-9 (MMP-9), тем самым способствуя агрессивности опухоли при карциноме шейки матки. Уровень HOTAIR выше в сыворотке крови больных РШМ и в значительной степени связан с увеличением размера опухоли, инвазией лимфатических сосудов, метастазами лимфатических узлов и снижением выживаемости [22]. MALAT1 чрезмерно экспрессируется в клетках РШМ у инфицированных ВПЧ высокого риска [23].
Ацетилхолиновые рецепторы
АЦХ был впервые идентифицирован как классический нейромодулятор, передающий сигналы через две подгруппы рецепторов – мускариновые (mAChRs) и никотиновые (nAChRs). АЦХ синтезируется в клетках нервной системы и за ее пределами, скорость его синтеза в клетках ограничена поступлением холина, который транспортируется внутри клеток нервной системы с помощью высокоаффинного транспортера холина 1 (CHT-1), а вне нервной системы – холиноподобных белков CTL1-5 и органического транспортера катионных ионов (OCT).
nAChR – это лиганд-закрытые ионные каналы, состоящие из пяти различных типов субъединиц, включая α, β, δ, ε или γ, где α и β являются основными субъединицами. Первоначально считалось, что nAChR существуют только в нервной системе; но в настоящее время появляется все больше доказательств того, что nAChR также присутствуют в клетках и тканях за ее пределами. Это свидетельствует о том, что nAChR может играть роль в других биологических процессах: регуляции воспаления, пролиферации клеток, дифференциации, миграции и апоптозе [24, 25].
Различные подтипы nAChR также оказывают влияние в контроле процесса метаболизма и канцерогенеза. Синтез и секреция АЦХ раковыми клетками создают холинергическую аутокринную петлю, стимулирующую пролиферацию раковых клеток. Сверхэкспрессия nAChRs в различных типах опухолей опосредует в раковых клетках пролиферацию, апоптоз, ангиогенез и эпителиально-мезенхимальный переход [26–28].
На плоскоклеточную метаплазию в зоне трансформации шейки матки влияет холинергическая сигнализация. Это может быть основано на дифференциальной реакции цилиндрического и многослойного плоского эпителия и подлежащей стромы на АЦХ. В исследовании с помощью реагента TRIzol полимеразной цепной реакцией с обратной транскрипцией была выделена мРНК для 10 из 16 субъединиц nAChR из клеток РШМ. Высокие концентрации были получены из мРНК, кодирующих α-5, α-7, α-9, β-1 и эпсилонные субъединицы; низкие концентрации – из мРНК, кодирующих α-4, β-2, β-4, γ и дельта субъединицы. Было выявлено, что в нормальных плоскоклеточных эпителиальных клетках и опухолевых плоскоклеточных клетках субъединицы nAChR α-5 и β-1 экспрессировались в высоких концентрациях; при этом гораздо более слабая экспрессия или вообще ее отсутствие наблюдалась в цилиндрическом эпителии [1]. Однако экспрессия субъединиц nAChR α-5 и β-1 может меняться во время канцерогенеза, так как в клетках аденокарциномы шейки матки, развивающихся из клеток железистого типа, экспрессия субъединиц была повышена [1].
Китайскими учеными из Хайнаньского университета проведено исследование с использованием метода Вестерн-блоттинга, которое выявило высокую экспрессию субъединиц α-3, α-9, α-10 и β-4 nAChR в клетках РШМ по сравнению с нормальными клетками шейки матки [4, 29].
Альфа-9 nAChR
Нейрональные nAChR, содержащие субъединицы α-9, экспрессируются не только в нейрональных тканях. Кроме того, большинство раковых клеток и тканей высоко экспрессируют α-9-содержащие рецепторы, и ряд исследований показал, что они являются мощными регуляторами реакций, которые стимулируют онкологические процессы, такие как пролиферация, ингибирование апоптоза и метастазирование [1, 30, 31].
Αльфа-9 является интегральным мембранным белком. Согласно результатам исследований, nAChR, присутствующие в эпителиальных и эндотелиальных клетках легких, играют непосредственную роль в раке легких [26, 32, 33]. Было обнаружено, что уровни мРНК субъединиц α-3, α-5, ß-4 и α-9 значительно увеличиваются в мелкоклеточном раке легких [32] и уровни мРНК субъединиц α-7, α-9 и α-10 также увеличиваются в ряде клеточных линий, полученных из опухолей мелкоклеточного и немелкоклеточного рака легких. Количественный анализ экспрессии субъединиц nAChR при РШМ методом полимеразной цепной реакции показал, что экспрессия субъединицы α-9 nAChR была повышена в клетках аденокарциномы шейки матки. В клетках плоскоклеточного РШМ уровень экспрессии был таким же, как в нормальных клетках [29].
Анализируя литературные данные, можно сделать вывод, что α-9-содержащие nAChR играют важную роль при различных видах рака. Эти рецепторы очень проницаемы для Ca2, что указывает на то, что α-9-рецепторы модулируют различные процессы в передаче сигнала; это делает их мощными регуляторами ответов, которые стимулируют ряд онкологических процессов, включая пролиферацию клеток, распространение метастазов и ингибирование апоптоза [30, 33].
Aльфа-5 nAChR
Субъединица α-5 nAChR, которая является продуктом гена CHRNA5, участвует в пролиферации опухолевых клеток, ингибировании апоптоза, прогрессировании метастазов и индукции ангиогенеза в некоторых солидных опухолях [31]. Согласно результатам исследований, субъединица α-5 nAChR тесно связана с раком легких. Активация α-5 nAChR участвует в росте и метастазах опухоли и важна для формирования, метастазирования и рецидивирования рака легких [31]. Также было показано, что α-5 nAChR связана с раком желудка, предстательной железы. Например, воздействие никотина на клетки рака желудка ингибирует апоптоз, вызванный цисплатином, через сигнальный путь α-5 nAChR/AKT [34].
Liu K. et al. изучалась экспрессия фермента, катализирующего холинацетилтрансферазу (ChAT), везикулярного переносчика АЦХ (VAChT) и ацетилхолинэстеразы (AChE) в клеточных линиях РШМ человека. Было обнаружено, что уровни ChAT и VAChT были значительно повышены в раковых клетках по сравнению с нормальными клетками шейки матки. Также результаты данного исследования показали, что α-5nAChR была высокоэкспрессирована в образцах без патологии и в клетках РШМ [35].
Calleja-Macias I.E. et al. из Калифорнийского университета провели исследование, где были использованы клеточные линии плоскоклеточного РШМ и аденокарциномы шейки матки. Были проанализировали препараты РНК из клеток с помощью полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией с парами праймеров, которые нацелены на все мРНК субъединиц nAChR. В результате эксперимента во всех клеточных линиях обнаружили сильные сигналы, полученные из мРНК, кодирующих α-5 nAChR [36].
Альфа-7 nAChR
Альфа-7 nAChR представляет собой мембранный белок, участвующий в физиологических реакциях во многих нейронных и ненейрональных клетках. Классический α-7 nAChR является наиболее распространенным гомологичным nAChR-подтипом в мозге, где он был первоначально обнаружен и изучен, как нейронный рецептор. Однако α-7 nAChR также экспрессируется в различных ненейрональных клетках, включая Т-клетки, макрофаги, сосудистый эндотелий, гладкомышечные клетки сосудов и другие [37], где участвует в холинергическом противовоспалительном пути, ангиогенезе, ремоделировании сосудов и окислительном стрессе [38]. Этот рецептор обладает относительно высокой проницаемостью для Ca2 [32, 39, 40]. Ряд исследований показали, что α-7 nAChR считается важным в патофизиологии воспалительных заболеваний, включая ревматоидный артрит, сепсис и атеросклероз [41]. Никотин стимулирует пролиферацию нормальных и раковых клеток рецепторзависимым образом. Было показано, что активация α-7 nAChRs никотином вызывает эпителиально-мезенхимальный переход. Кроме того, активация α-7 nAChR никотином и нитрозаминами не только стимулирует пролиферацию и миграцию опухолевых клеток, но и способствует росту новых кровеносных сосудов. Рост новых сосудов необходим для снабжения быстро делящейся опухолевой массы кислородом и факторами роста и в конечном итоге приводит к экстравазации отделившихся опухолевых клеток в просвет сосуда и метастазированию в различные органы [42]. Через α-7 nAChRs-опосредованные пути передачи сигнала никотин вызывает дозозависимое увеличение пролиферации клеток рака легких, молочной и поджелудочной железы.
Взаимосвязь курения и развития рака шейки матки
Существует достаточно доказательств того, что риск развития различных видов рака выше среди курильщиков, чем среди некурящих [39]. Табачный дым содержит не менее 4000 соединений (никотин и ряд канцерогенных соединений, таких как табачные нитрозамины, полициклические ароматические углеводороды и альдегиды), которые инициируют канцерогенез и усиливают распространение метастазов. Риск и тяжесть рака зависят от продолжительности и активности курения табака [9]. Основным механизмом, лежащим в основе действия никотина как промотора опухоли, является связывание и активация nAChRs [35], которые вызывают секрецию факторов роста и цитокинов, изменяющих физиологию различных систем органов и способных активировать ряд внутриклеточных митогенных сигнальных путей, способствующих росту клеток, ангиогенезу и другим тканевым реакциям.
При инкубировании клеток РШМ никотином в концентрациях от 0,1 до 100 мкм определялось увеличение клеточной массы через 48, 96 и 120 ч [1]. Согласно данным статьи Prokopczyk B. et al., опубликованной в 1997 г., в шейке матки курильщиц присутствуют значительно более высокие уровни ДНК-аддукта по сравнению с таковыми у некурящих пациенток [43]. Биологическим механизмом, с помощью которого канцерогены в сигаретном дыме могут влиять на риск РШМ, является стойкая инфекция ВПЧ за счет нарушения иммунологической функции. Альтернативно холинергическая передача сигналов может активировать каскад киназ, в свою очередь, активирующий один из факторов транскрипции, таких как AP-1, от которых зависит экспрессия онкопротеинов ВПЧ, что приводит к косвенной стимуляции клеточного цикла никотином через папилломавирусную инфекцию [1, 44, 45].
Последние исследования доказали, что lncRNA могут играть важную роль в патогенезе РШМ. Так, высокий уровень циркулирующего HOTAIR9, снижение СASС2 были связаны с неблагоприятным прогнозом РШМ. Известно, что CASC2 участвует в подавлении пролиферации и индукции апоптоза, выполняя роль опухолевого супрессора. HOTAIR – онкоген, способствующий ускорению прогрессирования клеточного цикла, ингибированию апоптоза, эпителиально-мезенхимальному переходу и другим процессам, провоцирующим канцерогенез.
Заключение
Несмотря на проведенные многочисленные фундаментальные исследования, посвященные проблемам злокачественного перерождения предраковых заболеваний шейки матки, и повсеместное внедрение скрининговых программ, смертность от РШМ продолжает занимать лидирующие позиции. В настоящий момент не определены достоверные прогностические критерии озлокачествления плоскоклеточных CIN.
Анализ данных литературы показал, что на плоскоклеточную метаплазию в зоне трансформации шейки матки влияет холинергическая сигнализация. АЦХ и его рецепторы не только регулируют процессы воспаления, пролиферации нормальных клеток, но и играют важную роль в ответе при онкологических процессах путем увеличения экспрессии определенных субъединиц рецепторов, тем самым ингибируя апоптоз и увеличивая вероятность метастазирования.
Таким образом, nAChR, HOTAIR9 и СASС2 могут играть потенциальную роль в патогенезе РШМ. Разработка панели молекулярных предикторов для точной дифференциальной диагностики степени тяжести поражения, а также выявления группы риска перехода дисплазии в рак позволит усовершенствовать алгоритмы обследования и своевременно начать патогенетическую терапию у пациенток с ВПЧ-ассоциированными заболеваниями шейки матки.
