Пациентки с многократными неудачными программами вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) составляют около 30% от всех пациенток, которые лечатся с использованием этих методов [6]. Неадекватная рецептивность эндометрия ответственна приблизительно за две трети неудач имплантации, тогда как эмбрион ответственен только за одну треть [12, 21].
Так как большинство исследователей отрицают роль гистологического датирования эндометрия (определения соответствия морфологической структуры оболочки матки дню менструального цикла) в клинике бесплодия [8, 17], в настоящее время развиваются альтернативные методы оценки функции эндометрия, а также ведется активный поиск биологических маркеров «окна имплантации», способных прогнозировать наступление беременности в программах ВРТ.
Одними из наиболее изученных биомаркеров «окна имплантации» являются пиноподии – структуры, появляющиеся в апикальной части поверхностного эпителия эндометрия в период максимальной рецептивности оболочки матки [20].
Эстрадиол и прогестерон регулируют большинство идентифицированных маркеров имплантации (пиноподии, интегрин αvβ3, LIF, Е-катгерин, HOX гены и др.) путем прямого влияния или опосредованно [7, 11]. Рецептивность эндометрия зависит от адекватной стимуляции эстрогеновых и прогестероновых рецепторов в железах и клетках стромы. Прогестероновая стимуляция эстрогенезированного эндометрия приводит к производству различных маркеров, отображающих «окно имплантации» [19]. Поскольку действие стероидных гормонов осуществляется путем связывания со специфическими ядерными рецепторами, логично предположить, что любой дисбаланс в экспрессии
стероидных рецепторов может привести к нарушению морфологических и/или функциональных свойств эндометрия в период «окна имплантации», поэтому определение экспрессии прогестероновых (ПР) и а-эстрогеновых рецепторов (ЭРα) в средне-лютеиновую фазу цикла может быть лучшим биомаркером дисфункциональной оболочки матки.
В связи с вышеизложенным целью настоящего исследования явилось изучение морфологической характеристики, структурных особенностей поверхностного эпителия и состояния рецепторного статуса эндометрия у пациенток с повторными неудачами имплантации в программах ВРТ, разработка прогностических критериев наступления беременности, а также определение групп пациенток, которым целесообразно применять циклическую гормональную терапию в качестве подготовки эндометрия к следующему циклу ЭКО.
Материал и методы исследования
Всего в исследование включены 97 пациенток репродуктивного возраста с трубно-перитонеальным фактором бесплодия, имевших в анамнезе 2 и более неэффективные попытки ЭКО. На первом этапе работы аспирационная пайпель-биопсия эндометрия выполнена у 62 пациенток в цикле, предшествующем стимуляции суперовуляции, на 7–8-й день после овуляции. Далее сформированы 2 группы сравнения в зависимости от эффективности реализации в дальнейшем программы ЭКО: 1-я группа (n=15) – пациентки, у которых наступила беременность, 2-я группа (n=47) – пациентки с отрицательным результатом.
На втором этапе работы, в соответствии с результатами гистологического и иммуногистохимического (ИГХ) исследований эндометрия была сформирована 3-я группа (n=35), которую составили больные, получившие гормональную терапию в качестве подготовки к следующей программе ЭКО и переноса эмбрионов (ПЭ). У пациенток 3-й группы также проводили контрольную биопсию на фоне приема гормональных препаратов на 21–24-й день менструального цикла (МЦ).
В группу контроля включили 15 фертильных женщин без гинекологической патологии, у которых исследовали структуру эндометрия. Материалы биоптатов фиксировали в 10%-ном нейтральном формалине, заключали в парафин, делали срезы толщиной 5 мкм и окрашивали гематоксилином и эозином. При исследовании гистологических препаратов также оценивали процент клеток поверхностного эпителия с наличием пиноподий в световом микроскопе при увеличении х400.
Для ИГХ реакций парафиновые срезы обрабатывали по стандартной методике, использовали мышиные моноклональные антитела к ЭРα (клон 1D5 «DAKO») и ПР (клон 636 «DAKO»).
Для анализа результатов ИГХ реакций использовали метод гистологического счета H-score по формуле: HS=1a+2b+3c, где а – % слабо окрашенных клеток, b – % умеренно окрашенных клеток, с – % сильно окрашенных клеток, 1, 2, 3 – интенсивность окрашивания, выраженная в баллах. Степень выраженности экспрессии ЭРα и ПР расценивали: 0–10 баллов – отсутствие экспрессии, 11–100 баллов – слабая экспрессия, 101–200 баллов – умеренная экспрессия, 201–300 баллов – выраженная экспрессия.
Стимуляцию суперовуляции проводили по короткому протоколу со 2–3-го дня МЦ с использованием препаратов рФСГ и антагонистов ГнРГ. Циклическую гормональную подготовку проводили с использованием натурального трансдермального эстрадиола и микронизированного прогестерона.
Статистическую обработку данных выполняли с помощью пакета прикладных программ «Statistica
for Windows» v. 7.0, StatSoft Inc. Сравнение между группами проводили непараметрическими методами с использованием критерия Манна-Уитни.
Статистически значимыми считались отличия при р<0,05 (95%-ный уровень значимости) и при р<0,01 (99%-ный уровень значимости). Для исследования влияния одной или нескольких независимых переменных на одну зависимую переменную использовали одномерный дискриминантный анализ – метод бинарной логистической регрессии. Относительный шанс (ОШ) наступления беременности вычисляли по методу Woolf.
Результаты исследования и их обсуждение
Возраст обследованных женщин в исследуемых группах не различался и колебался от 22 до 35 лет,
составляя в среднем 32,2±0,3 года. Средняя продолжительность бесплодия у обследуемых женщин колебалась от 2 до 14 лет и составила в среднем 6,3±0,4 года. Существенных и достоверных различий между группами не выявлено.
Среднее число неудачных циклов ЭКО в исследуемых группах статистически и достоверно не различалось и составило 2,7±0,3 в 1-й группе, 2,7±0,2 – во 2-й, 2,6±0,2 – в 3-й группе. Более половины женщин (65%) имели 2 попытки ЭКО в анамнезе, каждая третья пациентка (35%) – 3 и более неудачных циклов лечения.
Изучая параметры стимуляции суперовуляции у обследованных пациенток, мы не выявили статистически значимых различий между группами пациенток в отношении стимуляции суперовуляции, параметров фолликулогенеза, оогенеза и раннего эмбриогенеза. В связи с этим нам представилось важным уделить особое внимание структуре эндометрия у данных пациенток.
В контрольной группе во всех биоптатах эндометрий находился в фазе секреции. Среднее значение уровня ПР составило в клетках поверхностного и железистого эпителия 132,5±9,5, в строме – 208,8±11,6 балла. Показатели ЭРα в среднем составили в клетках поверхностного и железистого эпителия 63,2±6,7, в строме – 89,8±4,1 балла. Во всех биоптатах в группе контроля соотношение ПР/ЭРα было более 2 (среднее значение в поверхностном эпителии – 2,1±0,3, в железах – 2,1±0,3, в строме – 2,3±0,2).
У пациенток, беременных после ЭКО (1-я группа) морфологическая картина эндометрия соответствовала фазе секреции у 93,3%. Как известно, «золотым» стандартом исследования пиноподий является сканирующая электронная микроскопия [18]. Однако размер пиноподий
у человека составляет в среднем 6 мкм [18, 20], и мы в своем исследовании посчитали возможным оценить процент поверхностных клеток эпителия с наличием апикального выпячивания (предположительно пиноподий) при рутинном гистологическом исследовании с использованием световой микроскопии (рис. 1, см. на вклейке). В 1-й группе у 9 пациенток число клеток поверхностного эпителия с наличием пиноподий колебалось от 50 до 70%, у 6 пациенток – более 75%
(среднее значение составило 66,7±2,95).
Во всех исследованных образцах отмечалось ядерное ИГХ окрашивание ПР. В поверхностном
эпителии и в эпителии желез уровень ПР составил в среднем 206,7±20,2 и 230±18,2 балла соответственно, в строме – 242,3±11,8. Количество ЭРα в ядрах клеток поверхностного эпителия
составило в среднем 98,3±15,6, эпителии желез – 102,1±15,2, строме – 100,3±15,6 балла. Интересен
тот факт, что помимо ядерной ИГХ реакции на ЭРα мы также наблюдали апикальное цитоплазматическое окрашивание, которое локализовалось исключительно в клетках поверхностного эпителия, где были сформированы пиноподии (рис. 2, см. на вклейке). Возможно, данное наблюдение связано с наличием мембранных ЭРα в клетках эндометрия. Механизм действия и структурные особенности мембранных эстрогеновых рецепторов (мЭР) в настоящее время точно не определены, однако предполагают, что мЭР отвечают за быструю передачу эстрогениндуцированных сигналов в клетке [14].
Соотношение ПР/ЭРα у 13 пациенток с морфологической картиной секреторной фазы было более 2 (среднее значение: поверхностный эпителий – 2,6±0,3, железы – 2,8±0,3, строма – 3,2±0,2), и только у 1 женщины наблюдалось соотношение ПР/ЭРα<2.
Таким образом, в группе беременных после ЭКО мы наблюдали умеренную или выраженную экспрессию ПР и слабую или умеренную экспрессию ЭРα в поверхностном эпителии и строме, подобную результатам, полученным в группе контроля. Статистически значимое различие (р<0,05) в уровнях ПР и ЭРα отмечалось только в клетках эпителия желез. Существенным представляется тот факт, что показатели стероидной рецепции в строме у пациенток, беременных после ЭКО, не отличались от группы контроля, поскольку современные представления предполагают, что именно строма играет решающую роль в успешной имплантации эмбриона и последующем развитии беременности [1, 2, 15].
При гистологическом исследовании эндометрия у 29,8% пациенток 2-й группы (не беременные после ЭКО) обнаружена поздняя стадия пролиферации (n=14), у 57,5% – стадия секреции (n=27), у 12,8% – неполноценная фаза секреции с асинхронным развитием желез в поздней стадии пролиферации и начала ранней стадии секреции (n=6). Поскольку в МЦ происходят физиологические колебания экспрессии ПР и ЭРα, невозможно оценивать их показатели без учета морфологической характеристики эндометрия. Мы сочли необходимым детально изучить уровни ПР и ЭРα в зависимости от гистологического датирования эндометрия.
Среди пациенток 2-й группы, у которых была обнаружена стадия пролиферации, среднее значение уровня экспрессии ПР составило в поверхностном эпителии 93,2±18,8, в эпителии желез – 95,4±18,2, в строме – 107,5±24,5 балла. Показатели ЭРα были низкими во всех клетках эндометрия (в среднем составили в поверхностном эпителия 67,9±17,7, в эпителии желез – 67,9±17,7, в строме – 64,3±18,4 балла). Соотношение ПР/ЭРα<2, обнаружено у 7 пациенток, в остальных биопсиях наблюдалось соотношение ПР/ЭРα≥2. Таким образом, у пациенток 2-й группы, у которых выявлена стадия пролиферации, обнаружено статистически значимое уменьшение уровня ПР в строме эндометрия (р<0,05) и тенденция к более низкой экспрессии ПР в клетках поверхностного и железистого эпителия, чем в группе контроля. Достоверных различий в количестве ЭРα выявлено не было. Однако, по данным литературы, поздняя стадия пролиферации в нормальном эндометрии характеризуется максимально высокой экспрессией и ПР и ЭРα во всех клетках эндометрия [3–5, 16].
Таким образом, у данных пациенток наблюдалось снижение стероидной рецепции эндометрия, вызванное недостаточной эстрогеновой стимуляцией рецепторного аппарата в I фазу МЦ, так как у них отмечен достоверно более низкий уровень Е2 на 3–5-й день МЦ, чем в группе беременных после ЭКО пациенток (187,9±16,9 и 263,7±18,5 пмоль/л соответственно; р<0,05).
Среди пациенток 2-й группы, у которых была обнаружена стадия секреции, только у 7 наблюдалось соотношение ПР/ЭРα≥2. У 75% данных пациенток (n=20) выявлено соотношение ПР/ЭРα<2 (рис. 3, см. на вклейке). Уровень ПР в среднем составил в поверхностном эпителии – 213,4±23,1, в эпителии желез – 216,1±21,5, в строме – 223,3±15,3 балла. Средние показатели экспрессии ЭРα имели значение в поверхностном эпителии – 207,3±20,2, в эпителии желез – 187±18,4, в строме – 157,8±16,3 балла.
У пациенток 2-й группы, у которых была обнаружена стадия секреции, наблюдалось достоверно значимое увеличение уровня экспрессии ПР в поверхностном и железистом эпителии (р<0,05), показатели ПР в строме не отличались от показателей группы контроля. В то же время количество ЭРα в клетках поверхностного эпителия и желез превышало норму более чем в 2 раза, в клетках стромы – в 1,4 раза.
Как известно, снижение ЭРα в эндометрии – критическое событие, освобождающее от подавляющего влияния определенные гены и обеспечивающее сигнал для начала внутриматочной рецептивности. Высоко специализированный и специфический средне-секреторный репертуар эндометриальной экспрессии генов совпадает с сокращением экспрессии ЭРα [22]. Гиперэкспрессия ЭРα в лютеиновую фазу цикла вызывает нарушение экспрессии биологических маркеров имплантации, в том числе интегрина αvβ3 [9, 13]. Отсутствие физиологического снижения ЭРα в средне-секреторную фазу МЦ
может быть связано с неадекватными уровнями прогестерона в сыворотке крови, чрезмерной
экспрессией ароматаз, коактиваторов стероидных рецепторов [10], некоторых провоспалительных цитокинов (ИЛ-6, EGF), а также, возможно, с нарушением экспрессии ЭРβ.
Следует отметить, что группа пациенток с гиперэкспрессией ЭРα в лютеиновую фазу цикла единственная, в которой мы не выявили ни одной статистически значимой корреляции между концентрацией эстрадиола и прогестерона в сыворотке крови и показателями экспрессии ПР и ЭРα. Дисбаланс экспрессии стероидных рецепторов в эндометрии на фоне нормального профиля сывороточных гормонов у таких пациенток может свидетельствовать о повреждении рецепторного аппарата на тканевом уровне или локальном нарушении функции паракринных и аутокринных факторов, регулирующих экспрессию ЭРα [2]. Возможно, наличие гиперэкспрессии ЭРα в середине лютеиновой фазы МЦ может быть лучшим биомаркером дисфункциональной оболочки матки у женщин с неэффективными попытками ЭКО в анамнезе.
Среди пациенток 2-й группы, у которых была обнаружена неполноценная стадия секреции,
выявлено статистически значимое снижение уровня ПР в клетках поверхностного эпителия и стромы (более чем в 2 раза), а также наблюдалась тенденция к повышению уровня ЭРα в поверхностном эпителии и эпителии желез (р>0,05) по сравнению с группой контроля.
Среди пациенток 2-й группы, только у 4 обнаружено ≥50% пиноподий, в остальных 43 соскобах
этот показатель колебался от 0 до 30%. Среднее значение процента пиноподий во 2-й группе
было более чем в 3,5 раза меньше, чем у пациенток 1-й группы и составило 18,3±1,9.
В результате многофакторного анализа с использованием метода бинарной логистической регрессии мы построили статистически значимую модель, в которой показано, что на наступление беременности в программе ЭКО влияют показатели соотношения ПР/ЭРα в поверхностном эпителии, в эпителии желез и в строме эндометрия, однако определяющим прогностическим фактором является соотношение ПР/РЭα в строме.
На основании полученных результатов мы также провели расчет ОШ наступления беременности после ЭКО у пациенток с неэффективными попытками в анамнезе при различных показателях соотношения ПР/ЭРα в эндометрии. При соотношении ПР/ЭРα<2 ОШ отрицательного результата составил 9,43 (95% доверительный интервал – ДИ 3,37–26,39). При соотношении ПР/ЭРα в диапазоне 2–3 (3>ПР/ЭРα≥2) ОШ наступления беременности составил 4,38 (95% ДИ 2,31–8,29). При увеличении соотношения ПР/ЭРα более 3 ОШ наступления беременности уменьшается и составляет только 1,22, причем нижняя
граница 95% ДИ – менее 1 (95%, ДИ 0,37–4,02), что говорит о статистически незначимом факте.
Таким образом, шанс наступления беременности после ЭКО у пациенток с ранее неэффективными
попытками при соотношении ПР/ЭРα в диапазоне 2–3 выше в 4,4 раза по сравнению с женщинами,
у которых данная величина не входит в указанный диапазон (т.е. при ПР/ЭРα<2 и ПР/ЭРα>3).
С учетом данных, полученных на первом этапе исследования, была сформирована 3-я группа
пациенток (n=35) с неэффективными попытками ЭКО в анамнезе, у которых при ИГХ исследовании выявлено снижение уровня экспрессии ПР и ЭРα и которым целесообразно назначать препараты эстрогена и прогестерона с целью подготовки эндометрия перед программой ЭКО и ПЭ. Поскольку у пациенток с отсутствием снижения уровня ЭРα в стадию секреции отсутствовали корреляционные связи между концентрациями стероидных гормонов и соответствующих рецепторов эндометрия, мы не включали их в дальнейшее исследование.
До лечения в 3-й группе стадия пролиферации наблюдалась у 19 пациенток, стадия секреции – у 11 и неполноценная стадия секреции – у 5. До лечения в 3-й группе количество пиноподий колебалось от 5 до 30% и только у 1 (2,9%) паентки обнаружено ≥50%, пиноподий, среднее значение составило 21,4±1,9%.
В 3-й группе женщин с эндометрием, соответствующим стадии пролиферации, средние показатели экспрессии ПР составили в клетках поверхностного и железистого эпителия 91,3±14,5, в строме – 81,3±10,3 балла. Количество ЭРα составило в среднем 60,3±16 в поверхностом и железистом эпителии, 49,5±10,9 – в строме, при этом соотношение ПР/ЭРα<2 наблюдалось у 11 женщин.
До лечения в 3-й группе пациенток, у которых по данным гистологического исследования выявлена ранняя или средняя стадия секреции, также наблюдался низкий уровень стероидной рецепции (<100 баллов) во всех клетках эндометрия. Уровень ПР составил в среднем в клетках поверхностного эпителия 50±11, в эпителии желез – 62,7±11,9, в строме – 100,9±10,6 балла. Средние значения уровня экспрессии ЭРα составили в поверхностном эпителии – 34,6±7,9, в эпителии желез – 34,6±6,8, в строме – 22,3±5,8 балла, при этом соотношение ПР/ЭРα≥2, характерное для стадии секреции, наблюдалось у 7 женщин. До лечения у пациенток с неполноценной стадией секреции наблюдалось неравномерная ИГХ реакция в клетках эндометрия и высокие колебания показателей ПР и ЭРα.
Таким образом, 3-я группа была сформирована из пациенток со сниженной стероидной рецепцией, по данным ИГХ исследования. До лечения показатели ПР в клетках поверхностного и железистого эпителия были в 1,5 раза, в строме – в 2 раза ниже, чем уровни экспрессии ПР в группе контроля. Для показателей ЭРα наблюдалось статистически значимое (р<0,05) различие только в клетках стромы (рис. 4, см. на вклейке).
Пациенткам 3-й группы в течение двух МЦ перед программой ЭКО и ПЭ проводили гормональную подготовку препаратами трансдермального эстрадиола (с 5-го по 25-й день МЦ) и натурального микронизированного прогестерона (с 16-го по 25-й день МЦ). После проведенной гормональной подготовки у пациенток 3-й группы во всех полученных соскобах наблюдались секреторные преобразования. После гормональной терапии у 5 (14,3%) пациенток число клеток поверхностного эпителия с наличием пиноподий колебалось от 5 до 30%. У 11 (31,4%) женщин число пиноподий составило 50%, у 19 (54,3%) – от 60 до 100%, среднее значение составило 58,9±3,7%. Таким образом, наблюдалось статистически значимое увеличение числа клеток поверхностного эпителия с пиноподиями после проведенного гормонального лечения (р<0,05).
После лечения показатели ПР в клетках поверхностного эпителия и эпителия желез составили
в среднем 179,9±9,3, в строме – 215,1±6,1 балла. Количество ЭРα в среднем составило в поверхностном эпителии 88,3±6,1, в эпителии желез – 88±6,1, в строме – 97,4±3,1 балла.
В 3-й группе после проведенного лечения соотношение ПР/ЭРα≥2 во всех клетках эндометрия наблюдалось у 80% пациенток (n=28), у 8,6% (n=3) во всех клетках эндометрия было соотношение ПР/ЭРα<2, у 11,4% (n=4) женщин в стрме наблюдалось соотношение ПР/ЭРα≥2, а в поверхностном эпителии и эпителии желез – ПР/ЭРα<2. В среднем в 3-й группе после проведенного лечения ПР/ЭРα составило в поверхностном эпителии 2,1±0,1, в эпителии желез – 2,1±0,1, в строме – 2,3±0,1.
Таким образом, после проведенной гормональной подготовки наблюдалось статистически значимое (р<0,05) увеличение показателей ПР и ЭРα во всех клетках эндометрия. В поверхностном эпителии, эпителии желез и строме показатели ПР увеличились более чем в 2 раза. Уровень экспрессии ЭРα повысился в 1,6 раза в поверхностном и железистом эпителии и более чем в 2 раза в клетках стромы. Данные гистологического исследования свидетельствуют о нормализации структурно-функционального состояния эндометрия, формировании более полноценных морфологических реакций поверхностного эпителия, железистого и стромального компонентов оболочки матки у данной категории пациенток на фоне гормональной подготовки. Полученные результаты говорят в пользу того, что циклическая гормональная терапия обеспечивает адекватное поступление половых стероидных гормонов и повышает чувствительность к ним клеток эндометрия путем увеличения экспрессии прогестероновых и эстрогеновых рецепторов, что позволяет гормонам реализовать их действие в виде адекватной и равномерной морфофункциональной реакции оболочки матки.
В 3-й группе пациенток после предварительной гормональной подготовки эндометрия в результате программы ЭКО беременность наступила у 26 (74,3%) женщин. Следует отметить, что беременность наступила у всех пациенток, у которых до лечения в эндометрии была выявлена стадия пролиферации и соотношение ПР/ЭР<2 (n=11) или стадия секреции и соотношение ПР/ЭР≥2 (n=7).
Из 8 женщин, у которых до лечения в эндометрии обнаружена поздняя стадия пролиферации
и соотношение ПР/ЭР≥2 беременность наступила у 4. Из 4 пациенток, у которых до лечения
в слизистой оболочке тела матки наблюдалась ранняя или средняя стадия секреции и соотношение ПР/ЭР<2, нехарактерное для данной фазы МЦ, беременность наступила у 1.
Таким образом, у пациенток с повторными неудачами имплантации наблюдаются различные варианты дисбаланса экспрессии ПР и ЭРα в эндометрии (снижение стероидной рецепции или гиперэкспрессия ЭРα), наиболее выраженные в строме. Относительный шанс наступления беременности после ЭКО у них в 4,4 раза выше при соотношении ПР/ЭРα в диапазоне от 2 до 3.
Основными прогностически благоприятными критериями наступления беременности в программе ЭКО являются соотношение ПР/ЭРα, соответствующее морфологической структуре эндометрия и число клеток поверхностного эпителия эндометрия с наличием пиноподий ≥50%, а наиболее неблагоприятным прогностическим признаком у них является персистирующая гиперэкспрессия ЭРα в средне-лютеиновую фазу МЦ.
Применение циклической гормональной терапии с использованием препаратов натурального эстрадиола и натурального микронизированного прогестерона у пациенток со сниженным рецепторным статусом позволяет нормализовать структурно-функциональное состояние эндометрия и формирование полноценных морфологических реакций поверхностного эпителия путем увеличения экспрессии ПР и ЭРα.
