Возможными генетическими факторами риска развития гестационных осложнений являются полиморфные варианты генов, ответственных за развитие эндотелиальной дисфункции и гиперкоагуляции [3, 9]. Мутации в генах, кодирующих факторы системы гемостаза, приводя к нарушению равновесия в этой системе, могут индуцировать и поддерживать развитие недостаточности кровотока в маточно-плацентарном комплексе [11]. Открытие тромбофилических полиморфизмов позволило по-новому оценить причины и патогенез привычного невынашивания беременности, синдрома задержки внутриутробного роста плода, преждевременной отслойки нормально расположенной плаценты и других акушерских осложнений [2, 5, 6, 10]. В то же время сведения о распространенности и клинической значимости генетических протромботических дефектов нередко противоречивы. Это обусловлено, с одной стороны, различиями в общепопуляционной частоте тромбофилических полиморфизмов в географических регионах, с другой – взаимо- влиянием других врожденных и приобретенных факторов риска тромбозов и коагулопатических состояний [4, 17].
Наиболее изученной является частота встречаемости полиморфизмов генов ключевых ферментов метаболизма гомоцистеина при различных нарушениях репродуктивной функции. Гипергомоцистеинемия сопряжена с повреждением эндотелия и развитием системной воспалительной реакции [8, 12]. Кроме того, патологическое влияние гомоцистеина непосредственно на трофобласт выражается в индукции апоптоза и значительном снижении секреции хорионического гонадотропина [11]. Эндотелиальная дисфункция, наблюдаемая при гипергомоцистеинемии, сопровождается десинхронизацией процессов фибринолиза и фибринообразования, вазоконстрикцией, способствует нарушению нидацииплодного яйца, инвазии трофобласта. Это обусловливает нарушение плацентации, фетоплацентарного кровотока, а во II и III триместрах – развитие хронической плацентарной недостаточности (ПН), преждевременной отслойки нормально расположенной плаценты, хронической внутриутробной гипоксии плода, гипотрофии плода и ряда осложнений периода новорожденности [13, 14]. По данным отечественных авторов, носительство точечной мутации 677Т гена MTHFR в 2 раза увеличивает риск развития неблагоприятных исходов гестационного периода [7]. Влияние полиморфных вариантов гена MTHFR на развитие ПН и отслойки нормально расположенной плаценты было продемонстрировано для финской и норвежской популяций, однако британские исследователи не подтвердили наличия ассоциации полиморфизма 677 C>Т с развитием фетоплацентарной недостаточности [15, 17, 19]. Ряд авторов показали существенное увеличение риска развития синдрома задержки роста плода при наличии полиморфных вариантов 677 C>Т и 1298 A>С, в то же время итальянские ученые не получили подтверждения значения носительства мутации 677 C>Т в патогенезе данного осложнения беременности [13, 16, 20].
Целью настоящего исследования явилось определение патогенетических механизмов реализации врожденных и приобретенных факторов риска развития гестационных осложнений на основе выявления ассоциаций полиморфизма генов-регуляторов обмена гомоцистеина и показателей функционального состояния эндотелия в ранние сроки беременности.
Материали методы исследования
Проведен анализ результатов клинического, лабораторного и функционального обследований 187 женщин, наблюдавшихся в ФГБУ Уральскийнаучно-исследовательский институт охраны материнства и младенчества Минздрава России с ранних сроков беременности до момента родоразрешения. В ходе ретроспективного исследования, в зависимости от характера течения беременности и ее исходов, сформированы следующие группы:1-я основная группа – 54 женщины, беременность которых осложнилась субкомпенсированной ПН, в том числе с исходом в задержку роста плода; 2-я основная группа – 22 женщины, беременность которых закончилась ранними репродуктивными потерями (до 12 нед). Забор биологического материала у женщин 2-й основной группы проводился за несколько недель до появления признаков прерывания беременности. Группу сравнения (3-ю) составили 111 женщин, беременность которых протекала без признаков ПН, родивших здоровых доношенных детей. Все пациентки обследованных групп принимали препараты фолиевой кислоты в I триместре по назначению врача в соответствии с современными рекомендациями ВОЗ по нормам потребления витаминов при беременности. Группы не отличались по возрасту и паритету. Информированное согласие на использование биологического материала было получено у всех беременных женщин, проведение исследования было одобрено локальным этическим комитетом. Всем женщинам провели молекулярно-генетическое типирование. Оценку генетических полиморфизмов, ассоциированных с нарушением обмена гомоцистеина (MTHFR: 677С>Т, 1298 A>C; MTRR: 66 A>G; MTR: 2756 A>G), проводили методом полимеразной цепной реакции в режи- ме реального времени с использованием детектирующего амплификатора ДТ-96 с автоматическим программным обеспечением ООО «НПО ДНК-Технология» (Россия). Образцы ДНК получали из буккального эпителия с помощью наборов реагентов и протоколов для выделения ДНК того же производителя. Содержание гомоцистеина определяли с помощью наборов фирмы «Axis-Shield» (Великобритания), концентрацию эндотелина-1 и big-эндотелина – с использова- нием наборов фирмы «Biomedica» (Австрия), уровень стабильных метаболитов оксида азота (NO) оценивали с помощью тест-систем «R&D Systems» (США) методом иммуноферментного анализа.
Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с помощью стандартных методов описательной статистики с использованием программ Microsoft Excel (2007) и Statistica 6.0 (StatSoft, США). Проверку гипотезы о соответствии совокупности количественных признаков закону нормального распределения проводили с использованием критерия Шапиро-Уилкса. Поскольку в ряде случаев нулевая гипотеза о соответствии распределения признака закону нормального распределения отвергалась и принималась альтернативная, данные представляли в виде медианы (Ме) и нижнего и верхнего квартилей (25-го и 75-го процентилей, LQ и UQ). Проверку статистических гипотез об отсутствии межгрупповых различий осуществляли с помощью непараметрического U-критерия Манна-Уитни. Нулевую гипотезу о равенстве долей (в том числе соответствие эмпирического распределения частот генотипов по всем изученным локусам теоретически ожидаемому, рассчитанному по формуле Харди-Вайнберга) проверяли с использованием критерия χ2 с поправкой Йетса. Для бинарных признаков вычисляли отношение шансов (OR) и 95% доверительный интервал (95% CI). Критический уровень значимости различий p, при котором нулевая гипотеза об отсутствии различий отвергалась и принималась альтернативная, принимали равным 0,05.
Результаты исследования и их обсуждение
Результаты проведенного анализа распределения частот генотипов по исследуемым полиморфным маркерам генов MTHFR, MTRR и MTR представлены в табл. 1.
Таблица 1. Распределение частот генотипов полиморфных маркеров генов ключевых ферментов обмена гомоцистеина в зависимости от исходов беременности (n=187).
Частота встречаемости олигонуклеотидной замены 677 C>Т гена MTHFR (гомозиготная форма) у женщин с ранними репродуктивными потерями была статистически значимо выше, чем в группе сравнения. Как известно, 5,10-метил-тетрагидрофолат-редуктаза является ключевым ферментом в процессе синтеза метионина из гомоцистеина. По современным представлениям, гомо- и гетерозиготное носительство аллеля 677Т обусловливает снижение активности энзима и, соответственно, приводит к развитию гиперго моцистеинемии. У лиц с генотипом Т677Т отмечается снижение активности фермента примерно до 70%, а при наличии гетерозиготной мутации – до 35% от среднего значения [18]. Кроме того, в работе отечественных авторов было показано, что у гомозигот по аллелю 677Т уровень гомоцистеина в 2 раза выше, чем у лиц с СС-генотипом [13]. Тромбофилический и атерогенный эффекты гипергомоцистеинемии сказываются в нарушении плацентации и прерывании беременности [7].
У женщин, беременность которых закончилась ранними репродуктивными потерями, чаще регистрировался аллель 1298С гена MTHFR в гетерозиготном состоянии. Совокупность генотипов, содержащих полиморфный аллель 1298С в гомо- и гетерозиготном состоянии (АС+СС) также встречалась достоверно чаще у женщин второй основной группы. По данным литературы, точечная мутация А1298С сопровождается небольшим снижением ферментативной активности: так, у лиц, гомозиготных по аллелю 1298С, отмечается снижение каталитической активности MTHFR до 60% от нормы [13]. Носительство низкофункциональных аллелей 677Т и 1298С предрасполагает к умеренной гипергомоцистеинемии и повышению риска развития осложнений, прежде всего, на фоне снижения фолатного статуса [14]. Поскольку все обследованные женщины принимали препараты фолиевой кислоты, фактор дефицита фолатов в проведенном исследовании нивелировался.
Статистически значимое увеличение доли генотипов, содержащих аллель 2756G гена метионин- синтазы (MTR), выявлено как в группе женщин, беременность которых осложнилась ПН, так и в группе с ранними репродуктивными потерями, причем различия с группой сравнения были характерны для гетерозиготной формы данной мутации и совокупности генотипов AG+GG. MTR является ферментом, катализирующим реакцию превращения гомоцистеина в метионин. Недостаточность этого фермента приводит к развитию гипометионинемии и гипергомоцистеинемии. Для восстановления функции фермента необходимо дополнительное метилирование при участии фермента метионин-синтазы-редуктазы (MTRR). Достоверных отличий в частоте встречаемости низкофункционального аллеля 66G гена MTRR в зависимости от исходов беременности не выявлено.
Изучаемые гены ответственны за активность ферментов единого метаболического процесса – фолатного цикла, поэтому негативный фенотипический эффект может наблюдаться не только при наличии мутантных аллелей в отдельных генах, но и при их сочетании в силу межгенного взаимодействия. Некоторые авторы отмечают значительное увеличение риска развития патологических состояний, связанных с гипергомоцистеинемией, в случае комбинаций низкофункциональных аллелей в нескольких генах фолатного обмена по сравнению с полиморфизмом только в одном гене [1, 4, 14]. Сочетание нескольких полиморфизмов генов-регуляторов обмена гомоцистеина достоверно чаще встречалось в группе женщин с ранними репродуктивными потерями.
Таким образом, полученные данные свидетельствуют о наличии ассоциации низкофункциональных аллелей генов обмена гомоцистеина с развитием таких гестационных осложнений, как ПН и ранние репродуктивные потери. Следующий этап исследований был связан с доказательством реализации генетической составляющей нарушения функции участвующих в фолатном обмене ферментов MTHFR, MTRR, MTR в зависимости от исхода беременности. Содержание гомоцистеина в ранние сроки беременности, осложненной впоследствии ПН, обнаруживало тенденцию к повышению, в то время как в группе с ранними репродуктивными потерями выявлено статистически значимое повышение уровня этой аминокислоты (табл. 2).
Таблица 2. Показатели функционального состояния эндотелия в I триместре беременности в зависимости от исходов, Ме (LQ–UQ) (n=187).
Поскольку патофизиологическое действие гомоцистеина в значительной степени связано с нарушением функции эндотелия, была проведена оценка функционального состояния внутренней выстилки сосудов. Известно, что эндотелий обладает уникальной способностью реагировать на различные гуморальные стимулы окружающей среды продукцией сосудосуживающих и сосудорасширяющих факторов, баланс которых и определяет тонус гладкомышечных клеток, являясь весьма важным в регуляции сосудистого тонуса. При длительном воздействии повреждающих факторов происходит постепенное истощение компенсаторной «дилатирующей» способности эндотелия и преимущественным ответом эндотелиальных клеток на обычные физиологические стимулы становится гиперпродукция вазоконстрикторных медиаторов. Наряду с этим в результате нарушения функции эндотелиальные клетки продуцируют аномальные количества коагуляционных факторов, что приводит к смещению баланса между тромбогенными и тромборезистентными свойствами сосудистой стенки в сторону увеличения тромбогенного потенциала.
Содержание эндотелина-1, обладающего мощной вазоконстрикторной активностью, в группе женщин с ранними репродуктивными потерями обнаруживало тенденцию к повышению, превышая аналогичный показатель группы сравнения практически в 2 раза. Уровень big-эндотелина, который является предшественником эндотелина-1, в этой группе был существенно выше, чем при беременности, протекавшей без признаков ПН.
Оксид азота (NO) является физиологически значимым вазодилататором, ингибитором агрегации и адгезии тромбоцитов. Содержание стабильных метаболитов NO в обеих группах было снижено, что свидетельствует о выраженном дисбалансе в системе регуляции сосудистого тонуса (преобладании вазоконстрикторного эффекта над вазодилатирующим). Так, содержание эндогенного NO2¯ в сыворотке крови женщин с ранними репродуктивными потерями было в 1,7 раза ниже аналогичного показателя в группе сравнения. Уровень общего нитрита был снижен как в первой, так и во второй основной группах (в 1,2 и 1,3 раза соответственно; p<0,5). Кроме того, при беременности, осложненной впоследствии ПН, выявлено снижение содержания NO3¯ (в 1,2 раза по сравнению с аналогичным показателем при беременности, протекавшей без осложнений).
Дефицит NO в ранние сроки беременности, осложненной впоследствии ПН или прерыванием, может свидетельствовать о нарушении функции эндотелия, развивающемся в условиях повышенного содержания гомоцистеина. Сниженная продукция NO в ответ на стрессовое воздействие приводит к повышению тонуса сосудов, ухудшению микроциркуляции, гипоперфузии тканей, в том числе и фетоплацентарного комплекса. Снижение про- дукции NO на фоне увеличения продукции эндотелина-1 свидетельствует о смещении баланса в системе регуляции сосудистого тонуса в сторону преобладания прессорных факторов. Длительное воздействие активирующих факторов, в том числе таких агрессивных субстанций, как гомоцистеин и повреждение эндотелиальных клеток обусловливает прогрессирование патологического процесса.
Заключение
Анализ результатов, полученных в ходе настоящего исследования, позволяет предположить, что однонуклеотидные замены в генах обмена гомоцистеина и их сочетания являются структурными элементами генетической составляющей предрасположенности к осложненному течению беременности, а сама беременность является состоянием, которое обусловливает реализацию снижения активности ферментов, контролирующих метаболизм регуляторов функции эндотелия.
Общие патогенетические механизмы развития ПН и ранних репродуктивных потерь могут быть связаны с повышенной частотой встречаемости низкофункционального аллеля 2756G гена MTR, ассоциированной с повышением уровня гомоцистеина, и нарушением функционального состояния эндотелия, которое характеризуется смещением баланса в системе вазоконстрикторы/вазодилататоры в сторону преобладания прессорных факторов. Наряду с этим прерывание беременности в ранних сроках ассоциировано с гомозиготной мутацией 1298С и носительством аллеля 677Т гена MTHFR. Повышение уровня гомоцистеина, связанное с реализацией полиморфизмов генов- регуляторов фолатного обмена, приводит к нарушению функционального состояния эндотелия и, в результате, усилению прокоагуляционного потенциала крови и тромбофилическим осложне ниям, риск реализации которых повышается при носительстве полиморфизмов факторов сверты вания крови и других генов системы гемостаза. Эндотелиальная дисфункция и активация каскада внутрисосудистого свертывания обусловливают нарушение процессов ангиогенеза, формирование ПН и, при несостоятельности механизмов сохранения беременности, ранние репродуктивные потери. Дальнейшее изучение патогенетических механизмов реализации врожденных и приобретенных факторов риска развития гестационных осложнений позволит более эффективно прогнозировать различные патологические состояния с целью своевременной их профилактики.
