Одной из причин мужского бесплодия являются аутоиммунные реакции против сперматозоидов, которые сопровождаются выработкой антиспермальных антител – АСАТ [1]. В присутствии АСАТ происходит агглютинация и снижение подвижности сперматозоидов, нарушается проникновение в цервикальную слизь и оплодотворение яйцеклетки; имеются данные, что АСАТ могут оказывать отрицательное влияние на раннее развитие эмбриона, имплантацию и течение беременности [2–7]. Однако патогенез снижения фертильности и невынашивания беременности при наличии АСАТ все еще не ясен.
Цель исследования: показать связь между аутоиммунными реакциями против сперматозоидов, их функциональными характеристиками и реальной фертильностью.
Материал и методы исследования
Выполнено клинико-лабораторное обследование 425 мужчин из бесплодных пар в возрасте 18–45 лет; фертильные мужчины, жены которых были беременны на сроке 8–16 нед, составили контрольную группу (n=82).
Исследование спермы проводили в соответствии с требованиями ВОЗ [8]. Вычисляли индекс качества спермы (ИКС) – количество сперматозоидов с нормальной морфологией и прогрессивной подвижностью в эякуляте (млн/эякулят). Дополнительно оценивали подвижность сперматозоидов с помощью компьютерного спермоанализатора «MTG» (Medical Technology Vertriebs Gmbh, Германия), программы «medeaLAB CASA»: вычисляли криволинейную (трековую) скорость (VCL, мкм/сек), прямолинейную скорость (VSL, мкм/сек), амплитуду горизонтального перемещения головки (ALH, мкм/сек) и линейность (LIN, %). Определение АСАТ IgG и IgA на сперматозоидах осуществляли методом MAR (mixed antiglobulin reaction) (Ferti Pro N.V., Бельгия) и с помощью проточной цитофлуорометрии (ПЦМ) с использованием приборов Facscan (Becton Dickinson, США) и Bryte (Bio-Rad, Италия); в сыворотке крови – с использованием набора «Spermatozoa antibody ELISA» (IBL, Германия). На основании результатов MAR-теста выделяли группу пациентов с умеренно выраженными иммунными реакциями (MAR%IgG=10–49%) и группу с аутоиммунным бесплодием по ВОЗ (MAR%IgG>50%).
Для оценки спонтанной и индуцированной ионофором А23187 акросомальной реакции (АР) применяли способ двойного флуоресцентного окрашивания сперматозоидов с использованием флуоресцин-изотиоционат-меченного лектина P. sativum (Sigma, США) и тетраметилродамин-изотиоцианат-меченного лектина A. hypogaea (Sigma, США) [9]. Оценку оксидативного стресса (ОС) осуществляли путем определения интенсивности свободно-радикальных процессов методом люминолзависимой хемилюминесценции [10] с использованием люминометра «LKB-Wallac 1256» (Финляндия) и «Хемилюминометра-003» (Россия). Об интенсивности хемилюминесценции судили по светосумме и максимальной амплитуде свечения, которые соответствовали скорости образования активных форм кислорода (АФК). Повреждение хромосом сперматозоидов характеризовали по фрагментации ДНК, оцениваемой методом дисперсии хроматина (SCD-test, Испания) в геле инертной агарозы с визуальной оценкой под микроскопом образования ореола после кислотной денатурации ДНК и лизирования протеинов ядра [11]. Оценивали процент сперматозоидов с признаками апоптоза и степень нарушения образования ореола по 5-балльной шкале.
Статистическая обработка данных выполнена с применением пакета прикладных программ «Statistica» (StatSoft, США); вычисляли медиану, M, S, значимость различий оценивали по критериям Стьюдента, Манна-Уитни и Фишера для независимых выборок, Хи-квадрат, выполняли корреляционный анализ (вычисляли коэффициенты R, Gamma).
Результаты исследования и обсуждение
В группах пациентов с АСАТ показатели спермограммы были существенно хуже, чем у фертильных мужчин (p<0,05–0,01), но в большинстве случаев соответствовали нормозооспермии [8] и не отличались при различных значениях MAR-теста (см. таблицу; p>0,05). Корреляция между наличием АСАТ и отдельными показателями спермограммы слабая. Имелись различия при использовании разных методов определения АСАТ: ИКС не зависел от MAR%IgG и IgA (p>0,05), количества АСАТ в крови, по данным ELISA (p>0,05), но отрицательно связан с процентом живых гамет, покрытых АСАТ IgG, по данным ПЦМ (R=-0,29; p=0,0005). Это подтверждает данные, полученные нами ранее [12].
Клинический показатель – длительность вынужденного бесплодия (ДВБ), – наоборот, зависел от результатов MAR IgG-теста даже при нормозооспермии (R=0,39; р=0,00001); причем антитела класса IgG демонстрируют в 2 раза более сильную связь, чем IgA (R=0,20; p=0,03); корреляции ДВБ с данными ПЦМ и содержанием АСАТ в крови (ELISA) нет (p>0,05).
Эти данные свидетельствуют о том, что снижение фертильности на фоне АСАТ обусловлено главным образом функциональными нарушениями сперматозоидов и подтверждают мнение, что методы обнаружения АСАТ на подвижных гаметах наиболее значимо связаны с реальной фертильностью [8, 13].
Для характеристики оплодотворяющей способности спермы использована оценка капацитации сперматозоидов (Кс) и АР, которые являются взаимосвязанными, но двумя отдельными событиями [14].
Компьютерная оценка подвижности показала (рис. 1), что с увеличением доли АСАТ-позитивных сперматозоидов увеличиваются их прямолинейная и криволинейная скорости, амплитуда горизонтального перемещения головки, т.е. наблюдаются начальные признаки гиперактивации, которую считают проявлением Кс [15, 16]. В норме Кс происходит в женском половом тракте при действии цитокинов, прогестерона и рецепторов zona pellucida и является условием для АР – необходимого процесса для пенетрации яйцеклетки [16, 17]. Преждевременная Кс до попадания в женский организм может рассматриваться как фактор, снижающий фертильность.
Ранее было показано, что существует положительнаясвязьмеждупроцентомАСАТ-позитивных сперматозоидов и процентом гамет, преждевременно утративших акросому [18, 19]. Согласно нашим уточненным данным, при аутоиммунных реакциях против сперматозоидов имеют место нарушения двух типов: избыточность спонтанной и недостаточность индуцированной АР. Как видно на рис. 2, нередко эти нарушения наблюдаются вместе. Чем больше сперматозоидов покрыты АСАТ, тем больше выражены эти нарушения: только у 40% мужчин с иммунным бесплодием по ВОЗ сохраняется нормальная АР, что существенно меньше, чем у фертильных (p<0,001) и в группе с MAR%IgG=10–49% (p<0,01).
Остается неясным принципиальный вопрос: сами аутоиммунные реакции против сперматозоидов вызывают нарушения АР, или АСАТ взаимодействуют с гаметами, акросома которых неполноценна в результате действия каких-то других факторов – генетических или экзогенных.
Полученные данные об отрицательном влиянии аутоиммунных реакций на Кс и АР объясняют результаты исследований, в которых было получено снижение успеха оплодотворения яйцеклетки in vitro спермой с АСАТ [5, 7]. В то же время ясности в этом вопросе нет, поскольку, по мнению авторов недавнего систематического обзора и мета-анализа [20], наличие АСАТ не влияет на процент беременностей при ЭКО и переносе эмбриона.
Полученные нами данные позволяют объяснить обнаруженное некоторыми авторами увеличение процента неудачных беременностей при наличии АСАТ [2, 3]. Установлено, что при аутоиммунных реакциях против сперматозоидов растет доля гамет с нарушениями структуры хромосом. В среднем, процент сперматозоидов с фрагментацией ДНК при иммунном бесплодии (MAR%>50%) в 1,6 раза больше, чем при MAR%=10–49% (р=0,003); в пределах нормы – 10 и 55% значений у пациентов этих групп (p<0,01) соответственно. Для степени фрагментации ДНК различия выражены меньше – в 1,25 раза (р=0,01); в пределах нормы – 21 и 55% образцов соответственно. Зависимость между MAR IgG и повреждением ДНК – прямая: R=0,48 (p=0,003) для процента сперматозоидов с фрагментацией ДНК и R=0,43 (p=0,007) для степени дисперсии хроматина (рис. 3).
Вероятной причиной преждевременной АР и повышенной фрагментации ДНК при аутоиммунных реакциях против сперматозоидов является ОС. Известно, что избыточная продукция АФК при инфекционно-воспалительных процессах, варикоцеле, диабете и некоторых других заболеваниях приводит к повреждению мембраны сперматозоидов, снижению их подвижности и нарушению оплодотворяющей способности [21–23]. При этом АФК способны непосредственно повреждать ДНК хромосом и инициировать апоптоз сперматозоидов [23–25], в результате чего беременности чаще заканчиваются спонтанными абортами [26], могут возникать врожденные аномалии и детские раки [25, 27]. Способность АСАТ нарушать развития зародыша обсуждается давно [4], имеются подтверждающие это экспериментальные данные [28]; иммунные реакции против сперматозоидов у женщин считают фактором нарушения имплантации [29]. Но имеются ли повреждения структуры ДНК при аутоиммунных реакциях против сперматозоидов, не известно. Нами впервые было установлено [22, 30], что у пациентов с иммунным бесплодием продукция в сперме АФК существенно повышена: между MAR% IgG и продукцией АФК имеется прямая зависимость (R=0,34; p=0,03); еще более сильна связь продукции АФК с количеством IgG на гаметах, по данным ПЦМ (R=0,81; p=0,0007).
Роль ОС в патогенезе мужского иммунного бесплодия подтверждает использование антиоксидантов, способных химически связать избыток АФК и предотвратить повреждение клетки. На фоне лечения происходит быстрое уменьшение доли АСАТ-позитивных сперматозоидов и нормализация АР [31].
Полученные данные уточняют патогенез снижения фертильности при аутоиммунных реакциях против сперматозоидов, и заставляют более осторожно относиться к применению методов ЭКО, в т.ч. интрацитоплазматической инъекции сперматозоида при иммунном мужском бесплодии, когда имеет место ОС сперматозоидов и повышена фрагментация ДНК. Целесообразны дальнейшие исследования в этом направлении, чтобы подтвердить и количественно охарактеризовать взаимосвязь фрагментации ДНК, с одной стороны, и результатов лечения иммунного бесплодия у мужчин методами ЭКО, с другой.
Заключение
Фертильность мужчин при аутоиммунных реакциях против сперматозоидов снижена пропорционально доле подвижных гамет, покрытых АСАТ, и обусловлена функциональными нарушениями сперматозоидов: преждевременной гиперактивацией, нарушениями АР и повышенной фрагментацией ДНК, связанными с ОС.
