Необходимость своевременной постановки диагноза с минимальным риском для матери и плода определяет актуальность разработки и внедрения методов неинвазивной пренатальной диагностики. Инвазивные методы пренатальной диагностики, обладая высокой информативностью, тем не менее повышают риск прерывания беременности, особенно у женщин с осложненным течением гестационного процесса. Согласно данным английских авторов, за период 2002–2003 гг.всвязисразличнымипоказаниями у 30 тыс. женщин проведена процедура амниоцентеза, у 8 тыс. – хориоцентеза, что привело к самопроизвольному прерыванию 460 желанных беременностей с нормальным кариотипом плода [16]. При выполнении этих процедур даже опытными специалистами риск потери беременности составляет около 1–2% [15]. С целью ранней постановки генетического диагноза и снижения риска самопроизвольного прерывания беременности в различных лабораториях проводились поиски неинвазивных методов пренатальной диагностики.
Еще в 1893 г. G. Schmorl впервые высказал предположение, что клетки плодового происхождения
могут проникать в кровь матери [36]. Эта гипотеза основывалась на обнаружении клеток плацентарного происхождения в легочной ткани женщин, умерших от эклампсии. Только во второй половине ХХ века эти клетки начали активно использовать для выявления анеуплоидии и хромосомных
аберраций у плода. Однако это направление не получило широкого распространения в связи с
тем, что эмбриональных клеток в кровотоке матери мало (1–6 на мл крови) и они продолжают циркулировать в крови женщины многие годы и после окончания беременности, что может приводить к ложно-позитивным результатам при последующих беременностях [4].
Выявление в 1997 г. свободной (внеклеточной) эмбриональной ДНК (сэ-ДНК), циркулирующей в плазме крови матери, открыло новые возможности неинвазивной пренатальной генетической диагностики плода во время беременности [27]. При физиологической беременности от 3 до 6% всей свободной ДНК в материнской плазме имеет эмбриональное происхождение. Она может быть обнаружена уже на 4–5 нед беременности и ее количество нарастает до родов [28]. В отличие от эмбриональных клеток сэ-ДНК быстро исчезает из материнской плазмы после родов. Сэ-ДНК имеет период полужизни 16 мин и не определяется уже через 2 ч после родоразрешения, что указывает на ее специфичность конкретно для данной беременности.
Имеются убедительные доказательства тому, что сэ-ДНК имеет плацентарное происхождение
и поступает в кровь беременной вследствие плацентарного апоптоза [22, 23, 32]. В пользу этого
говорят результаты исследований, согласно которым сэ-ДНК выявляется еще до установления фетоплацентарного кровотока [35], а также при анэмбрионии [1]. Более того, проведение лазерной аблации анастамозов в плаценте сопровождается увеличением концентрации сэ-ДНК в кровотоке беременной [40]. Согласно результатам другого исследования, отцовский аллель, присутствующий в плаценте с подтвержденным генетическим мозаицизмом, выявлялся в материнской плазме, но отсутствовал у новорожденного, что также свидетельствует о плацентарном происхождении сэ-ДНК [29].
В связи с этим логично предположить, что различные нарушения состояния плаценты будут сопровождаться повышенным выбросом сэ-ДНК в кровоток матери. Действительно, было показано, что такие нарушения плацентации, как предлежание плаценты или различные формы врастания ее в миометрий сопровождаются значительным повышением концентрации сэ-ДНК в плазме беременной [8, 30, 38].
В связи с тем что сэ-ДНК в кровотоке беременной присутствует вместе с материнской внеклеточной ДНК, применение ее для клинической диагностики на сегодняшний день имеет определенные ограничения. Основное отличие между этими фракциями в том, что сэ-ДНК на 90% представлена в виде апоптотических фрагментов длиной до 200 пар нуклеотидов, тогда как материнская ДНК более длинная и может быть результатом как апоптоза, так и некроза [5, 11]. Современные технологии не позволяют пока эффективно разделять эти фракции.
Наиболее достоверным способом идентификации сэ-ДНК в настоящее время является выявление в плазме генов Y-хромосомы у женщин, вынашивающих плоды мужского пола. В нескольких лабораториях были разработаны методы пренатального определения пола плода с помощью технологии полимеразной цепной реакции в реальном времени с праймерами для генов Y-хромосомы SRY (sex-determining region Y) и TSPY (testis-specific protein, Y-linked) или DYS-14 [34, 17]. Ген SRY представлен в геноме в одной копии и позволяет с 95% эффективностью идентифицировать пол плода после 10 нед гестации [17, 34, 10]. Более высокая эффективность выявления ДНК Y-хромосомы в плазме матери достигается при амплификации многокопийного (от 15 до 35 копий) гена TSPY. По данным британских исследователей, выявление этого гена позволяет достигнуть точности определения пола плода в 97,6 % в сроках 6–7 нед беременности [18].
Определение пола плода приобретает клиническую значимость в случаях сцепленных с половыми хромосомами наследственных заболеваний, таких как гемофилия, миодистрофия Дюшенна, Х-сцепленная задержка умственного развития, адренолейкодистрофия, Х-сцепленный тяжелый
иммунодефицит, Х-сцепленная гидроцефалия, и других [6, 19, 7, 41]. Установление пола плода
также важно в случаях, когда наружные половые органы плода развиты нетипично и при ряде эндокринных нарушений, как, например, врожденная гиперплазия коры надпочечников, сопровождающаяся вирилизацией плода женского пола, что требует антенатального лечения
[7]. Кроме того, на сегодняшний день имеются убедительные данные в отношении особенностей течения беременности в зависимости от пола плода. У беременных, вынашивающих плод мужского пола, в 1,5–2 раза повышен риск как ранних, так и поздних гестационных потерь, преэклампсии, что требует тщательного мониторинга во время беременности [8, 30, 38].
Из аутосомно-наследуемых генов в ряде зарубежных клиник хорошо разработана и внедрена в качестве лабораторной диагностики пренатальная диагностика резус-D гена плода путем исследования сэ-ДНК в плазме крови матери [21]. Методика определения резус-принадлежности плода по крови матери и пренатальное определение пола плода практически схожи. В европейской популяции резус-отрицательный фенотип обусловлен полным отсутствием в геноме локуса резус-антигена, поэтому выявление в крови резус-отрицательной беременной этой ДНК будет однозначно указывать на резус-положительную кровь плода.
Иммунологическая несовместимость плода и матери по резус-фактору является основной причиной гемолитической болезни новорожденного [2]. До 95% всех клинически значимых случаев гемолитической болезни плода обусловлены несовместимостью по резус-фактору. Для предотвращения резус-сенсибилизации матери используют анти-резус иммуноглобулины. В настоящее время в мире принята тактика введения анти-резус иммуноглобулинов всем резус-отрицательным женщинам при резусположительной крови супруга с 28-й по 34-ю нед беременности [33], что позволяет снизить
риск иммунизации на 80%. В то же время при наличии резус-отрицательного плода эта профилактическая мера, связанная с введением белкового препарата (анти-Rhо(D) иммуноглобулина), является бесполезным, небезопасным и дорогостоящим мероприятием [12]. В связи с этим пренатальное определение резус-фактора плода неинвазивным методом позволит избежать ненужного медикаментозного воздействия при наличии резус-отрицательного плода и назначать профилактическое введение анти-Rhо(D) иммуноглобулина только при положительной резусринадлежности плода. Исследования, проведенные во многих лабораториях, показали, что применение полимеразной цепной реакции для выявления резус-D гена плода в материнской плазме крови после 15 нед гестации позволяет устанавливать резус-принадлежность плода со 100% увствительностью и 90–95% специфичностью [3, 13]. В 5–10% случаев возможно получение ложно-положительного результата в связи с наличием в европейской популяции азиатского или африканского генотипа резус-фактора, характеризующегося наличием дефектного гена RhD, проявляющегося как резус-отрицательный фенотип [2]. Внедрение в широкую практику определения резус-фактора плода по крови матери снизит число беременных, которым потребуется антенатальная профилактика анти-резус иммуноглобулином.
Нарушения роста и развития плаценты во время беременности находят отражение в повышении уровней свободной ДНК эмбрионального происхождения, что было доказано при различных осложнениях беременности [14, 43]. Осложнения, ассоциированные с плацентарной дисфункцией, такие как угроза выкидыша, задержка роста плода, преэклампсия сопровождаются развитием ишемии плацентарных сосудов, апоптозом трофобластических клеток и высвобождением эмбриональной ДНК в плазму крови беременной до концентраций значительно (в 3 и более раз) превышающих таковую при нормальном течении беременности [22]. При этом было отмечено, что превышение нормального
уровня сэ-ДНК возникает значительно раньше появления клинических признаков патологии беременности [24, 42].
Повышение уровней свободной ДНК эмбрионального происхождения у беременных с преэклампсией было впервые продемонстрировано в 1999 г. D. Lo и соавт. [25]. В дальнейшем было показано, что еще за 1–2 нед до появления симптомов преэклампсии уровень сэ-ДНК повышается в 2–3 раза, а при появлении клинической симптоматики – в 2–14 раз [21, 37].
Кроме преэклампсии были описаны и другие акушерские осложнения, при которых имеет место повышение уровня свободной ДНК эмбрионального происхождения: преждевременные роды, тяжелая рвота беременных, плотное прикрепление плаценты или ее врастание, задержка роста плода, внутриматочные гематомы, многоводие [41, 21].
Анеуплоидии–числовыеизмененияхромосом, часто являются следствием нарушений в процессе мейоза при образовании гамет. Большинство этих нарушений приводят к физическим аномалиям, нарушению умственного развития и бесплодию. «Золотым стандартом» диагностики любой анеуплоидии является исследование кариотипа клеток плодового происхождения, полученных при помощи хориоцентеза или
амниоцентеза [31].
В связи с риском инвазивных методов для беременности в настоящее время во многих лабораториях ведутся разработки методов для установления хромосомных аберраций путем исследования сэ-ДНК в материнской крови. Основная трудность этих работ заключается в идентификации эмбриональной ДНК, составляющей 3–6% от всей свободной ДНК в плазме крови.
D. Lo и соавт. для дифференциации эмбриональной ДНК использовали различие в характере метилирования определенных участков эмбриональной и материнской ДНК [39]. Такой подход позволил идентифицировать трисомию по 18 и 21 хромосомам с чувствительностью, близкой к 100%, и специфичностью до 95%. В этой же лаборатории был предложен другой метод идентификации эмбриональной ДНК и выявления аутосомальной анеуплоидии у эмбриона, основанный на определении специфических для хромосомы однонуклеотидных полиморфизмов [26]. Чувствительность такой диагностики может быть значительно повышена при использовании формальдегида для стабилизации клеток в материнской крови и увеличения доли эмбриональной ДНК в плазме [9].
В плазме крови беременной кроме эмбриональной ДНК выявляются свободные эмбриональные мРНК и микроРНК, которые также определяются на самых ранних сроках беременности и исчезают из кровотока сразу после родоразрешения, период их полужизни составляет 15–20 мин [20, 41]. Так как экспрессия определенных генов является уникальной во время беременности, определение плацентарной/эмбриональной РНК является многообещающим методом исследования с возможностью более эффективной дифференциации эмбриональной РНК от материнской.
Таким образом, свободные нуклеиновые кислоты, присутствующие в материнском кровотоке во время беременности, могут быть использованы для ранней неинвазивной пренатальной диагностики генетического статуса плода.
Существуют перспективы клинического использования определения свободной ДНК эмбрионального происхождения, основанные на отчетливых различиях материнской и эмбриональной ДНК:
1. Прогнозирование осложнений беременности по повышению абсолютного уровня сэ-ДНК.
2. Диагностика резус-фактора плода по резус-D гену у резус-отрицательных беременных женщин.
3. Установление пола плода путем определения свободных последовательностей ДНК, локализованных на Y-хромосоме.
4. Диагностика генных и хромосомных мутаций плода.
Требуются дальнейшие исследования в данной области для определения возможностей клинического применения описанных методов, как у беременных женщин групп риска, так и в качестве скрининговых методик.
