Возросший интерес исследователей во всем мире к биопленкообразующим микроорганизмам и вызываемым ими осложнениям связан со сложностью терапии и растущей антибиотикорезистентностью. Распространение бактерий с множественной лекарственной устойчивостью сделало биопленочные инфекции серьезной угрозой для госпитализированных пациентов.
Биопленки являются особой формой микробных сообществ, адгезированных на различных абиотических и биотических поверхностях. Они представляют собой ассоциацию микробных клеток и производимого ими органического матрикса (EPS), состоящего из внеклеточной ДНК, белков, липидов, амилоидных фибрилл и полисахаридов, таких как полисахаридный межклеточный адгезин (PIA). Помимо этого, во внеклеточный матрикс интегрированы компоненты макроорганизма – фибрин, иммуноглобулины и тромбоциты [1]. Микробные биопленки могут вызывать патологические процессы у пациентов при использовании медицинских устройств. Инфекции, вызванные штаммами микроорганизмов, способных образовывать биопленки, плохо поддаются лечению антимикробными препаратами (АМП). Кроме того, во многих случаях имеют место рецидивы заболевания, несмотря на защитные иммунные механизмы пациента. Высокоструктурная организация биопленки, необратимая фиксация на биотической или абиотической поверхности и наличие клеток-персистеров («спящих», обладающих низкой ферментативной активностью) способствуют защите микроорганизмов от экстремальных условий, таких как окружающая среда, введение антибиотиков и противогрибковых препаратов, а также ответ иммунной системы хозяина на инфекцию [2, 3]. Высокая устойчивость биопленкообразующих штаммов к АМП и тяжелые инфекции, которые они могут вызывать, определяют важность исследований биопленкообразования [4].
В последние годы исследовательские работы были в основном сосредоточены на инфекциях, связанных с биопленками, и стратегиях борьбы с ними. В нескольких исследованиях изучали корреляцию между патогенностью микроорганизмов и образованием биопленки. Многочисленные факторы вирулентности содействуют образованию биопленки, используя доступные ресурсы хозяина или участвуя в уклонении от врожденного и адаптивного иммунного ответа. Следует отметить, что способность к образованию биопленок связана с наличием у бактерий различных поверхностных cтруктур: пилей и полисахаридных капсул. В настоящее время большое внимание уделяется изучению генов и белков, необходимых для образования биопленок. Эти факторы вирулентности и их активность различаются в зависимости от вида, а также от иммунного ответа макроорганизма, где мононуклеарные клетки секретируют цитокины, которые впоследствии активируют другие иммунные ответы несколькими сигнальными путями. Понимание взаимоотношений между иммунным ответом и факторами вирулентности патогенов, образующих биопленку, важно для будущих исследований и лечения [5]. Около 50% внутрибольничных инфекций связаны с медицинскими устройствами, такими как катетеры, кардиостимуляторы, протезы суставов, зубные протезы, протезы клапанов сердца, имплантированные линзы, шунты спинномозговой жидкости, внутриматочные устройства, грудные имплантаты, стенты желчных путей, сосудистые протезы, вспомогательные устройства левого желудочка (LVAD).
Биопленки также могут образовываться на поверхностях клеток, не связанных с инородными телами: при муковисцидозе, эндокардите нативного клапана, хроническом синусите, хронических диабетических и раневых инфекциях [6].
По составу биопленки можно разделить на моновидовые и поливидовые (полимикробные). В природных условиях моновидовые биопленки встречаются довольно редко. В основном они формируются некоторыми патогенными микроорганизмами в тех органах и тканях макроорганизма, которые в норме являются стерильными. Примером таких биопленок и вызываемых ими поражений может служить образование биопленки P. aeruginosa в легких больных муковисцидозом.
Поливидовые (полимикробные) – это большинство биопленок, образующихся в окружающей среде. Такие биопленки представляют собой сложные сообщества, состоящие из нескольких видов микроорганизмов. В пределах такого сообщества можно обнаружить клетки бактерий, дрожжевых и плесневых грибов, простейших, а также частицы вирусов, в основном бактериофагов [7–9]. В последнее время доказана роль биопленок при бактериальном вагинозе (БВ). БВ – это невоспалительный биопленочный полимикробный синдром, при котором микрофлора влагалища, представленная преимущественно лактобациллами, полностью или частично замещается высокими концентрациями другой, главным образом анаэробной, микрофлоры: Gardnerella vaginalis, Fannyhessea vaginae (Atopobium vaginae), Prevotella spp., Porphyromonas spp., Bacteroides spp., Peptostreptococcus spp., Mobiluncus spp. и другие. Одним из основных критериев диагностики БВ являются так называемые «ключевые клетки» – поверхностные эпителиальные клетки влагалища, покрытые многочисленными грамотрицательными и грамвариабельными бактериями. За счет наличия бактерий при микроскопических исследованиях такие клетки приобретают характерный вид. Исследования показали распространенность образования биопленки при БВ, выявив Gardnerella spp. как основной компонент этих биопленок, что привело к гипотезе о том, что гарднереллы инициируют образование биопленки, позволяя последующим видам прикрепляться и размножаться [10]. Cимбиотические отношения между Gardnerella spp. и другими анаэробами в биопленках могут способствовать прогрессированию БВ [11]. Развитие биопленки может способствовать частым рецидивам и росту антибиотикорезистентности анаэробных микроорганизмов [10]. Поиск новых лекарственных препаратов, их комбинаций, действующих на биопленки микроорганизмов, является крайне важным для решения данной проблемы. Хотелось бы отметить, что использование метода флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) позволяет выявить этиологический агент у каждой конкретной женщины, диагностировать биопленочный/небиопленочный вагиноз, определив пространственное отношение бактерий друг к другу и к эпителиальным клеткам, прогнозировать развитие рецидива заболевания и с учетом этого подбирать соответствующую терапию [12].
Целью данного стандартизированного экспериментального исследования было изучение эффективности in vitro компонентов препарата «Депантол» против биопленок, сформированных вагинальными микроорганизмами.
Материалы и методы
В исследование включены 33 клинических изолята микроорганизмов, выделенных из вагинального биотопа и образующих бактериальные пленки: Gardnerella vaginalis (2), Escherichia coli (3), Klebsiella pneumoniae (3), Klebsiella piersonii (1), Citrobacter freundii (3), Acinetobacter baumannii (3), Streptococcus agalactiae (3), Enterococcus faecalis (3), Staphylococcus aureus (3), и дрожжеподобных грибов рода Candida (9).
Для культивирования, хранения и дальнейшего исследования использовали плотные и жидкие питательные среды: кровяной агар с 5% дефибринированной крови (КА), среда Сабуро (агар и бульон), триптиказо-соевый агар (ТСА), триптиказо-соевый бульон (ТСБ), ТСБ с 10% глицерина (ТСБ-Г), сердечно-мозговой бульон (СМБ), агар Мюллера–Хинтона (МХА) простой и с добавлением 5% дефибринированной крови. Идентификация микроорганизмов проводилась серологическими методами (реакция латекс-агглютинации) и методом MALDI-TOF-спектрометрии на масс-спектрометре Bruker Microflex (Германия).
Препарат «Депантол» («Нижфарм», Россия) содержит декспантенол (ДП) – 100 мг, хлоргексидина биглюконата (ХГБ) раствор 20% – 85,2 мг (в пересчете на хлоргексидина биглюконат – 16 мг); вспомогательные вещества: смесь макроголов (макрогол 400 – 2%, макрогол 1500 – 98%).
В исследовании использованы следующие компоненты препарата «Депантол»:
- ХГБ в разведении 1:100 (ХГБ 1%);
- ХГБ 0,02% (аптечная концентрация);
- ДП в разведении 1 мл в 10,0 мл стерильной дистиллированной воды (ДП 1:10);
- ДП в разведении 1 мл в 100 мл стерильной дистиллированной воды (ДП 1:100);
- макрогол в разведении 1 мл в 10 мл стерильной дистиллированной воды (М 1:10).
Эксперимент был основан на количественном определении биопленок в полистироловых плоскодонных планшетах по модифицированному методу Christensen et al. (1985).
Оптическую плотность (ОП) каждой лунки измеряли спектрофотометрически с использованием автоматического планшетного ридера (TecanSunrise) с тестовой длиной волны 570 нм и референтной длиной волны 620 нм. В зависимости от отношения ОП контроля к ОП образца штаммы микроорганизмов были разделены на 4 категории:
1) штаммы, не образующие биопленку, – ОП образца на уровне ОП контроля;
2) штаммы, слабо образующие биопленку (1+), – ОП образца превышала ОП контроля не более чем в 2 раза;
3) штаммы, умеренно образующие биопленку (2+), – ОП образца превышала ОП контроля в 2–4 раза;
4) штаммы, образующие выраженную биопленку (3+), – ОП образца превышала ОП контроля более чем в 4 раза.
Результаты
Чистую суточную культуру каждого штамма микроорганизмов, выращенных на плотной питательной среде, помещали в лунки 24-луночного полистиролового планшета с 450 мкл питательной среды (ТСБ) и 1% глюкозы. Лунки отрицательного контроля (К-) содержали 500 мкл ТСБ с 1% глюкозы и не содержали микроорганизмов. После инкубации в течение 48 ч лунки опорожняли, трехкратно промывали фосфатно-солевым буфером (PSB; pH 7,2) и окрашивали 2% генцианвиолетом. Краситель элюировали 96% этанолом и измеряли ОП раствора в каждой лунке при 570 нм с помощью спектрофотометра. Пороговое значение определяли как три стандартных отклонения выше средней ОП отрицательного контроля. Окончательное значение ОП выражалось как среднее значение ОП штамма, уменьшенное на величину порогового значения (рассчитывается для каждого микроорганизма отдельно). Если получено отрицательное значение, оно представляется как ноль, любое положительное значение указывает на образование биопленки.
Все 33 клинических изолята: G. vaginalis (2), E. coli (3), K. pneumoniae (3), K. piersonii (1), C. freundii (3), A. baumannii (3), S. agalactiae (3), E. faecalis (3), S. aureus (3), и дрожжеподобных грибов рода Candida (9) показали способность образовывать биопленки разной степени плотности (от + до +++).
Интересные результаты получены и при определении чувствительности клинических изолятов к ХГБ 1%. Хлоргексидин (ХГ) оказал разрушающее действие на большинство образованных биопленок, то есть ОП в лунках с добавленным компонентом были в 2 раза и более меньше ОП самих биопленок без компонента. Данные результаты подтверждают, что в настоящее время ХГ остается одним из наиболее активных катионных антисептиков, принцип бактерицидного действия которого, как известно, заключается в последовательно протекающих процессах диссоциации солей хлоргексидина, связывании катионов с отрицательно заряженной мембраной и нарушении осмотического равновесия бактериальной клетки (потеря калия, фосфора) [13]. ДП в исследуемых концентрациях и макрогол не оказали влияния на биопленки.
Полученные результаты представлены в таблице.
На рисунке представлены графические данные по действию ХГБ 1% на биопленки, образованные клиническими изолятами микроорганизмов, участвующих в эксперименте.
Как видно из данных, представленных как в таблице, так и на рисунке, ХГБ 1% раствор оказывает разрушающее действие на биопленки, сформированные большинством вагинальных бактерий. Это в первую очередь G. vaginalis – оба тестируемых изолята. Это все E. coli, клинический изолят K. piersonii, все E. faecalis, S. aureus и все изоляты дрожжеподобных грибов рода Candida, как C. albicans, так и C. non-albicans (C. parapsilosis и C. glabrata). Среди трех изолятов K. pneumoniae, C. freundii, A. baumannii, S. agalactiae разрушение биопленок имело место у двух.
Таким образом, можно оценить эффективность ХГБ 1% в действии на бактериальные пленки в отношении G. vaginalis, E. coli, K. piersonii, E. faecalis, S. aureus и дрожжеподобных грибов рода Candida, как C. albicans, так и C. non-albicans (C. parapsilosis и C. glabrata) в 100%. В отношении других микроорганизмов – в 70%.
Обсуждение
Биопленка защищает находящиеся в ней микроорганизмы от таких угроз, как антибиотики, бактериофаги и иммунный ответ макроорганизма. Gristina A.G. и Costerton J.W. (1985) предположили, что свойства микроорганизмов в биопленках могут отличаться от свойств планктонных форм бактерий [14]. Клетки бактерий в биопленке различаются по скорости метаболизма и устойчивости к внешним воздействиям. Поверхностные клетки метаболически более активны и менее устойчивы, внутренние клетки бактерий имеют низкую скорость метаболизма и более устойчивы к воздействию извне. Cуществует небольшая субпопуляция клеток в сообществе биопленки, известная как клетки-персистеры, которые могут принимать состояние покоя с крайней толерантностью к антимикробным препаратам. Эти клетки способны выживать после лечения антимикробными препаратами независимо от концентрации используемого антибиотика [15]. После прекращения лечения антибиотиками оставшиеся клетки-персистеры повторно заселяют определенный биотоп и в конечном итоге приводят к рецидиву биопленочной инфекции [16]. В данном случае использование антисептика предпочтительней, так как он воздействует и на эти клетки-персистеры, находящиеся в состоянии покоя.
В настоящее время существует несколько стратегий борьбы с биопленками. Внешние – физические методы удаления биопленки: методы на основе света, звука (такие как ультразвук или ударные волны, электромагнитные средства и плазменные или высокоэнергетические методы удаления) [6]. Внутренние: химические методы – модификации имплантата (совместная имплантация резервуара антибиотика, использование материалов, пропитанных антибиотиком, нанослойное покрытие имплантата, использование атомов металла, изменение материала имплантата) и биологические методы борьбы с биопленками – использование бактериофагов, бактериоцинов, АМП, ингибитора белка А катаболитного контроля (CcpA), ингибиторов кворум-сенсинга (QSI), аптамеров (олигонуклеотидных или пептидных молекул, специфически связывающихся с определенными молекулами-мишенями), пептидных нуклеиновых кислот. Также к биологическим методам относят обработку бактериальной биопленки ферментами [17]. С развитием мультирезистентности лечение биопленкообразующих инфекций должно быть направлено на подавление различных механизмов пленкообразования. В профилактических целях терапия должна быть направлена на подавление адгезии микроорганизмов к поверхности клеток и формирования матрикса. Кроме того, антимикробные препараты могут быть использованы для подавления размножения микроорганизмов, образующих биопленку, а также для интенсификации проникновения бактерицидных веществ внутрь сформированной биопленки. Терапия инфекций должна сочетать использование антимикробных и антибиопленочных препаратов. Многообещающей стратегией может быть использование ферментов, которые способны растворять матрикс биопленки (например, ДНКаза и альгинат-лиаза), повышая чувствительность микроорганизмов к антибиотикам и бактериофагам [18]. Недостатком использования ферментов является рассеивание бактериальной биопленки [19]. Чтобы этого избежать, необходимо использовать комплексные препараты, объединяющие в своем составе биопленкоразрушающий или биопленкоподавляющий эффект с бактерицидным действием.
ХГ на сегодняшний день стал самым основным предоперационным кожным антисептиком. Механизм действия ХГ – разрушение клеточных мембран широкого спектра бактерий и дрожжей, приводящее к гибели клеток. В метаанализе 2024 г. по оценке использования ХГ для профилактики инфекций в месте хирургического вмешательства было показано, что он превосходил повидон-йод в профилактике послеоперационных инфекционных осложнений после хирургических вмешательств. В этой научной работе было проанализировано 30 исследований и обработаны данные 29 006 пациентов. Еще одна группа авторов (Harris J.B. et al., 2024) на основании данных 6 исследований (1649 недоношенных детей) сообщили, что использование водного раствора ХГ сокращает количество случаев сепсиса у недоношенных новорожденных. Принимая во внимание эти обнадеживающие данные последних исследований, можно с уверенностью сказать, что ХГ остается главным антисептическим средством для обработки кожных поверхностей у недоношенных новорожденных [20]. Распространенные бактерии, вызывающие тяжелые осложнения, связанные с биопленкой, включают патогены группы «ESKAPE» (Enterococcus spp., Staphylococcus aureus, Klebsiella spp., Acinetobacter baumannii, Pseudomonas аeruginosa, Enterobacter spp.), которые вызывают инфекции кожи и мягких тканей, ран, бактериемию, инфекции мочевыводящих путей, менингит и пневмонию. Способность бактерий образовывать биопленки и их возрастающая устойчивость к существующим антибиотикам требуют разработки новых терапевтических подходов [21]. В нашем исследовании ХГ оказал разрушающее действие на большинство образованных биопленок. Его катионный заряд позволяет связываться с отрицательно заряженными бактериальными поверхностями, тем самым повреждая клеточную стенку. Однако было обнаружено, что эффективность ХГ снижается в зрелых биопленках. Предположительно, причиной является наличие внеклеточного полимерного матрикса, находящегося внутри биопленки бактерий, имеющих низкую скорость метаболизма, а также присутствие клеток-персистеров [22].
Традиционно для терапии вульвовагинального кандидоза используют флюконазол. Однако, как показало исследование, при рецидивирующем вульвовагинальном кандидозе флюконазол снизил рост только планктонных C. albicans. Между тем в зрелой биопленке флюконазол не оказывал никакого воздействия ни на дрожжевые клетки, ни на саму биопленку. Напротив, ХГБ оказывал прямое уничтожающее действие на клетки C. albicans, выросшие как планктонно, так и в биопленке. Исходя из этого, будущей стратегией лечения может быть сочетание ХГБ и флюконазола. Более того, необходимо профилактическое использование ХГБ для предотвращения образования биопленки и сокращения инфекционных осложнений [23].
В нашем исследовании также было доказано фунгицидное действие раствора ХГБ, входящего в состав препарата «Депантол», на биопленки, образованные клиническими изолятами как Candida albicans, так и Candida non-albicans. Для исследования бактерицидной и фунгицидной эффективности комбинации ХГБ и противовоспалительного провитамина декспантенола в соответствии со стандартными методами Немецкого общества гигиены и микробиологии (DGHM) были выбраны тестовые микроорганизмы Enterococcus hirae (ATCC 10541) и Candida albicans (ATCC 10231). Самым важным выводом этого исследования является то, что антимикробная эффективность ХГ увеличивается in vitro при добавлении 5% декспантенола [24].
В итоге все перечисленные исследования показывают, что достаточно воздействовать на один или несколько узловых процессов биопленкообразования, чтобы преодолеть устойчивость к АМП. Сочетание дополнительных соединений с обычными АМП может быть необходимым для оптимизации их эффективности, что, как ожидается, повысит качество лечения бактериальных инфекций, устойчивых к лекарственным препаратам. Дальнейшие исследования могут сосредоточиться на разработке и выявлении новых терапевтических агентов, которые были бы способны разрушить биопленку.
Заключение
Среди компонентов препарата «Депантол» эффективность ХГБ 1% по действию на бактериальные пленки в отношении Gardnerella vaginalis, Escherichia coli, Klebsiella piersonii, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus и дрожжеподобных грибов рода Candida, как Candida albicans, так и Candida non-albicans (C. parapsilosis и C. glabrata), была 100%. В отношении других микроорганизмов она составила 70%.
