Изучение патогенеза различных форм гиперплазии эндометрия (ГЭ), эндометриальной интраэпителиальной неоплазии (ЭИН) и рака эндометрия у женщин перименопаузального периода является одной из актуальных задач, что обусловлено высокой частотой рецидивирования процесса и возможностью малигнизации, которая происходит в 29% случаев [1]. Верификация патологического процесса в эндометрии по данным исследования соскобов может быть неточной, так как в соскоб попадает, как правило, функциональный слой, тогда как основные изменения могут локализоваться в базальном эндометрии. Так, например, имеются клинические данные по обнаружению эндометриоидной аденокарциномы (ЭАК) в базальной части эндометрия удаленных маток, тогда как в функциональном слое имелась комплексная ГЭ [2]. По данным литературы в 40% и более случаев был выявлен рак эндометрия при дооперационном диагнозе атипической ГЭ по результатам исследования соскобов эндометрия [3]. До настоящего времени среди патоморфологов нет единого мнения относительно критериев оценки выраженности пролиферативных изменений эндометрия и терминологии, обозначающей формы ГЭ. Mutter с соавт. 2000 г. предложил понятие ЭИН как предраковый процесс с высоким риском малигнизации (30%) [4].
Диагностика ЭИН необходима для своевременного проведения радикального хирургического лечения [4].
ГЭ и ЭИН рассматривают как гормонально-зависимые предраковые процессы, характеризующиеся морфологическими перестройками и накоплением молекулярно-генетических изменений в клетках, обладающих риском развития рака эндометрия [4].
В настоящее время установлено, что в ходе канцерогенеза развиваются не только генетические, но и эпигенетические нарушения, важнейшими из которых является метилирование генов. Метилирование генов изменяет информацию, которая содержится в ДНК, не меняя первичной нуклеотидной последовательности [5]. Белок О-6-метилгуанин-ДНК-метилтрансфераза (MGMT) кодируется геном MGMT, расположенным на 10-й хромосоме. Белок MGMT удаляет метильную группу с позиции О-6 на гуанине и переносит ее на свой цистеин, после чего фермент теряет свою функциональную активность («суицидальный белок»). Белок MGMT участвует в основных биологических процессах, связанных с репарацией ДНК: лигирование, метилирование, деалкилирование (деметилирование), а также в детоксикации, апоптозе и дифференцировке клеток.
Аномальное метилирование промоторов генов-супрессоров опухолевого роста и, как следствие, снижение экспрессии белков-супрессоров, сдерживающих возникновение гиперпластических процессов, выявлено при предраке эндометрия [5–7]. Гиперметилирование промотора гена MGMT приводит к снижению экспрессии белка MGMT, подтверждая общую тенденцию инактивации опухолевых генов-супрессоров метилированием, что является важным путем в многоступенчатом процессе канцерогенеза [8]. Снижение экспрессии белка MGMT обнаруживают в раке толстой кишки, легкого, опухолях головного мозга [8, 9], карциномах шейки матки [10, 11]. При ГЭ и раке эндометрия уровень экспрессии белка MGMT не изучен.
Одним из главных приоритетов диагностики и лечения гиперпластических и предраковых процессов эндометрия является эффективный мониторинг показателей межклеточных контактов. Онкомаркер эзрин – белок, принадлежащий к семейству трансмембранных гликопротеинов, ответственных за межклеточные связи между эпителиальными клетками, эпителиальными и стромальными клетками. Эзрин обнаруживается в нормальном эндометрии [12].
Кроме того, имеются указания, что он является маркером развития опухоли, инвазии и метастазиро-вания [13]. Эзрин относится к новым независимым прогностическим маркерам развития эндометриоидной карциномы [13].
Целью исследования стало изучение нарушения экспрессии белков MGMT и эзрина при различных формах ГЭ, ЭИН и высокодифференцированной ЭАК у женщин перименопаузального периода.
Материал и методы исследования
В исследование включены 35 женщин перименопаузального периода, находившиеся на стационарном лечении в ФГБУ Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова Минздрава России, г. Москва, АО Республиканский научный центр неотложной медицинской помощи, г. Астана, ГККП Онкологический диспансер г. Астаны. С целью выявления клинико-анамнестических особенностей ретроспективно пациентки были разделены на группы с различными морфологически верифицированными видами патологических процессов эндометрия: с простой ГЭ (ПГЭ) без атипии – I группа (n=12), с комплексной ГЭ без атипии (КГЭ) – II группа (n=9), с КГЭ с атипией (КАГЭ) – III группа (n=5), с ЭИН – IV группа (n=5), с ЭАК – V группа (n=4), верифицированные гистологически и иммуногистохимически с помощью Ki67 и PTEN.
Проводился сбор анамнестических данных, гинекологический осмотр, клинико-лабораторное обследование, ультразвуковое исследование органов малого таза, магнитно-резонансная томография органов малого таза, расширенная кольпоскопия, гистероскопия и гистерорезектоскопия, раздельное диагностическое выскабливание полости матки и цервикального канала, оперативное лечение (экстирпация матки с придатками), гистологическое исследование полученного материала.
Средний возраст больных при исследовании простой ГЭ составил 48,8±2,8 года. Основными жалобами пациенток были кровянистые выделения из половых путей и общая слабость. Анализ наследственной отягощенности пациенток показал значительную предрасположенность к опухолевым процессам у больных с КАГЭ, ЭИН и с ЭАК. Наиболее часто встречающимся соматическим заболеванием были артериальная гипертензия и ожирение. Наиболее частыми сопутствующими гинекологическими заболеваниями были миома матки, фиброзно-кистозная мастопатия и бесплодие. Рецидивирование гиперпластического процесса в анамнезе наиболее часто отмечалось у больных III, IV и V групп.
Морфологические исследования выполняли на операционном материале: 9 удаленных маток (экстирпация матки с придатками) и 22 соскоба эндометрия. В работе была использована классификация ВОЗ 1994 года, диагноз ЭИН устанавливали на основании морфологических характеристик, разработанных G. Mutter, Endometrial Collaborative Group [4]. Материал фиксировали в 10% забуференном формалине, заливали в парафин. Серийные срезы больше 4 мкн окрашивались гематоксилином и эозином и использовались для иммуногистохимических реакций. Демаскировка антигенов проводилась в ретривере с использованием цитратного буфера pH 6,0, при температуре 97°С в течение 20 минут. Для определения экспрессии эзрина использовали кроличьи моноклональные антитела фирмы Cell. Signaling в разведении 1:100. Разводили раствором для разведения антител Emerald antibody diluent (фирма Cell MARQUE). Для оценки уровня экспрессии белка MGMT использовали кроличьи моноклональные антитела в разведении 1:100(фирма EPITOMICS). Для определения экспрессии Ki67 и PTEN применялись моноклональные антитела к антигену Ki67 (Dako, в разведении 1:100) и PTEN (Dako, в разведение 1:100). Ставили положительные и отрицательные контроли. Результаты реакций оценивали полуколичественным методом с расчетом баллов по количеству окрашенных клеток одного типа: 2 балла – до 20% положительных клеток, 4 балла – более 20%, но менее 40%, 6 баллов – более и равное 40%. Статистическую обработку данных выполняли на персональном компьютере с помощью электронных таблиц Microsoft Excel и пакета прикладных программ Statistica for Windows v. 7.0, StatSoft Inc. (США). Все полученные количественные анамнестические, клинические, лабораторные и инструментальные данные обработаны методом вариационной статистики. Для сравнения числовых данных использовали метод t-критерий Стьюдента. Попарное сравнение осуществляли с помощью критерия Манна–Уитни.
Результаты исследования
Морфологическая характеристика ГЭ, ЭИН и ЭАК
Основные гистологические и иммуногистохимические признаки ПГЭ без атипии (рис. 1а см. на вклейке) характеризуются увеличением числа и формы желез, отсутствием цитологической атипии, низкой экспрессией Ki67 как в паренхиме, так и в строме, а также сохраненной экспрессией PTEN [4].
Для КГЭ (рис. 1б см. на вклейке) характерна более выраженная пролиферация и тесное расположение желез, увеличение железисто-стромального соотношения и экспрессии Ki67 в паренхиме и сохраненная экспрессия PTEN, наличие эпителиальной стратификации и отсутствие клеточной атипии. КАГЭ (рис. 1в см. на вклейке) характеризуется цитологической атипией, повышенной экспрессией Ki67 и незначительным уменьшением экспрессии PTEN в отдельных эпителиальных клетках. ЭИН (рис. 1в, г, д см. на вклейке) выявляется в виде очага 2–3 мм в диаметре с комплексированием желез, малым содержанием стромы, атипией эпителиальных клеток, относительно высоким Ki67 и потерей экспрессии PTEN [4]. ЭАК (рис. 1е см. на вклейке) характеризуется выраженной атипией клеток и ядер эпителиальных элементов в пределах предсуществующих структур без нарушения целостности базальной мембраны. Отличительными особенностями ЭАК служат отсутствие инвазии стромы опухолевыми клетками, сохранность предшествующих структур эндометрия и базальных желез, наличие воспалительной инфильтрации опухолево-измененного эпителиального пласта при отсутствии ее в окружающем эндометрии.
Иммуногистохимическое исследование
При анализе уровня экспрессии белка MGMT иммуногистохимическим методом выявили, что он располагается в виде гранул коричневого цвета в ядрах и в цитоплазме эпителиальных клеток, а также в клетках стромы при КАГЭ и ЭИН (рис. 2, 3а см. на вклейке). В контрольной группе (нормальный эндометрий в фазе пролиферации) продукт реакции выявлен в отдельных эпителиальных клетках в следовых количествах, 0 баллов (рис. 2а см. на вклейке). В случаях простой ГЭ гранулы коричневого цвета выявлялись в отдельных эпителиальных клетках, отмечался низкий уровень фермента, который колебался в пределах 2–4 баллов и в среднем составил 2,67±1,56 (рис. 2б см. на вклейке). При КГЭ без атипии продукт реакции выявлялся в группах эпителиальных клеток и локализовался в ядрах и цитоплазме. Получены умеренные и высокие цифры уровня экспрессии белка MGMT, от 2 до 6 баллов, в среднем 3,56±1,94 (рис. 2в см. на вклейке).
При КАГЭ и ЭИН продукт реакции выявлялся в ядрах и цитоплазме во всех эпителиальных и стромальных клетках (рис. 2г, д см. на вклейке), получены умеренные и высокие цифры уровня экспрессии белка MGMT от 4 до 6 баллов, в среднем 4,80±1,79. В клетках ЭАК продукт реакции выявлен в отдельных клетках в следовых количествах, отмечалась очень слабая экспрессия белка или отсутствие, цифры уровня экспрессии белка MGMT колебались от 1 до 2 баллов и в среднем составили 1,0±1,5 (рис. 2е см. на вклейке).
Следовательно, установлено, что уровень экспрессии белка MGMT возрастает при ПГЭ и КГЭ и достигает своего апогея на стадии КАГЭ и ЭИН, снижаясь при ЭАК. Падение экспрессии белка MGMT в ЭАК аналогично снижению его в карциномах другой локализации [10]. Это открывает новые возможности для разработки новых патогенетических подходов лечения ЭАК путем восстановления активной формы фермента MGMT.
При иммуногистохимическом исследовании эзрин выявлялся в железистом и покровном эпителии неизмененного эндометрия в апикальной части клеток. Однако при развитии патологических процессов наблюдалось появление эзрина и в цитоплазме клеток. Соотношения апикальной и цитоплазматической локализации эзрина варьировали при разных видах патологии эндометрия (рис. 3б, 3в см. на вклейке).
В нормальном эндометрии эзрин выявлялся в апикальной части эпителиальных клеток эндометрия, определялась высокая экспрессия, составляя от 4 до 6 баллов, среднее значение 4,33±1,87 (рис. 4а см. на вклейке). В ПГЭ преобладала апикальная экспрессия эзрина от 4 до 6 баллов, среднее значение составило 4,33±1,87, однако появлялись единичные клетки с продуктами реакции в цитоплазме, в среднем от 0 до 2 баллов 1,20±1,10 (рис. 4б см. на вклейке). При КГЭ без атипии преобладала цитоплазматическая экспрессия эзрина, от 3 до 5 баллов, среднее значение 3,5±1,94 (рис. 4в см. на вклейке), единичные клетки с продуктами реакции сохранились апикально, значение составило от 2 до 2 баллов, в среднем 1,78±1,20. В случаях КАГЭ и ЭИН преобладала высокая экспрессия эзрина цитоплазматически, от 4 до 6 баллов, среднее значение 4,33±1,8; апикально продукт реакции выявлялся в единичных клетках, от 0 до 2 баллов, в среднем 1,20±1,10 (рис. 4г, 4д см. на вклейке). Эзрин в раковых клетках ЭАК экспрессировал преимущественно цитоплазматически, значение составило от 5 до 6 баллов, среднее – 5,5±0,4 (рис. 4е см. на вклейке), а в апикальной части клеток ЭАК эзрин не экспрессировал, лишь в одном очаге обнаружена слабая экспрессия маркера, составившая от 0 до 1, среднее значение 0,50±1,0.
Таким образом, особенности экспрессии эзрина связаны с тем, что по мере прогрессии заболевания от ПГЭ до ЭАК происходит потеря его апикальной специфической локализации; напротив, свободное накопление эзрина наблюдается в цитоплазме клеток. Изменение локализации эзрина, вероятно, связано с нарушением межклеточных контактов, максимальное проявление которого происходит в ЭАК.
Резюмируя полученные данные исследования, следует отметить, что по мере прогрессии ГЭ до КАГЭ и ЭИН теряются межклеточные контакты и растет уровень экспрессии белка MGMT. Максимальное его значение обнаруживается до развития инвазивного рака эндометрия, что, вероятно, согласуется с данными о значении в канцерогенезе метилирования преимущественно генов супрессоров рака [5]. Снижение уровня экспрессии белка MGMT в ЭАК может отражать процессы автономного роста злокачественной опухоли. Нами было установлено, что при ПГЭ в ЭИН и КАГЭ эзрин может локализоваться как в апикальных, так и в цитоплазматических клетках. Апикальная локализация связана с участием эзрина в формировании межэпителиальных контактов [12].
Именно апикальная локализация эзрина теряется в процессе канцерогенеза. Цитоплазматическая локализация не несет функциональной нагрузки. Напротив, она может свидетельствовать о нарушении транспорта эзрина в зону межэпителиальных контактов или за счет дефектов транспортных систем, или самого эзрина. Наши данные в целом совпадают с данными литературы [13, 14], однако ни в одной из работ не анализировались особенности локализации эзрина.
Выводы
- Уровень экспрессии белка MGMT возрастает при ПГЭ и КГЭ, достигает своего апогея на стадии КАГЭ и ЭИН и снижается при ЭАК.
- Особенности экспрессии эзрина связаны с тем, что по мере прогрессии заболевания от простой ГЭ до ЭАК происходит потеря его апикальной специфической локализации и, напротив, свободное накопление эзрина наблюдается в цитоплазме клеток. Изменение локализации эзрина, вероятно, связано с нарушением межклеточных контактов, максимальное проявление которого происходит в ЭАК.
- Молекулярные и морфологические особенности КАГЭ и ЭИН во многом стереотипны, включая повышенный уровень экспрессии белка MGMT с потерей апикальной локализацией эзрина, но отличаются по экспрессии PTEN.
- Полученные результаты клинико-анамнестических, диагностических и иммуногистохимических исследований в приведенных группах больных могут обосновать дифференцированный подход к выбору тактики лечения больных с различными формами ГЭ.
