Работа частично поддержана Государственным контрактом Министерства образования и науки РФ № 16.522.12.2009 от 29.09.2011.
Распространенность преждевременного разрыва плодных оболочек (ПРПО) колеблется от 3 до 19% [1–4], достигая 38–51% при преждевременных родах [5–9]. Несмотря на актуальность данной проблемы в акушерстве патогенез ПРПО, основным фактором которого считается инфекционно- воспалительный, изучен недостаточно. Вместе с тем, учитывая строение плодных оболочек (ПО), возможное участие факторов дезорганизации соединительной ткани, нарушение их архитекто- ники, интерес представляет изучение роли нарушения гомеостаза соединительной ткани в генезе ПРПО. Поэтому дальнейшее проведение молекулярно-генетических исследований актуально для поиска генетических предикторов уточнения патогенеза ПРПО.
Целью исследования было оценить роль полиморфизмов генов структурных белков и системы регуляции гомеостаза экстрацеллюлярного матрикса (ЭЦМ) соединительной ткани в развитии ПРПО.
Материали методы исследования
В пилотное исследование случай-контроль были включены 179 пациенток в возрасте от 18 до 45 лет (179 пар: мать-ребенок), на сроке беременности 37–41-я неделя. Перед включением в исследование у каждой пациентки было получено информированное согласие на участие. ПРПО определяли как излитие околоплодных вод не менее чем за два часа до начала регулярной родовой деятельности. Проводилось исследование влагалища и шейки матки при помощи стерильных зеркал, при этом отмечалось наличие жидких выделений в заднем своде влагалища. Также проводилось тестирование содержимого заднего свода влагалища на наличие α2-микроглобулина.
Пациентки с тяжелой вирусной и/или бактериальной инфекцией во время данной беременности, тяжелой экстрагенитальной патологией матери, дифференцированной дисплазией соединительной ткани (дДСТ), пороками развития плода в исследование не включались. Дополнительным критерием исключения для группы контроля послужило начало операции «кесарево сечение» до наступления регулярной родовой деятельности у пациенток с оперативными родами.
Все пациентки были разделены на две группы. I (основную) составили 82 роженицы, роды которых осложнились ПРПО, II (сравнения) – 97 рожениц, роды которых не осложнялись ПРПО. Были изучены особенности анамнеза, исходная клиническая характеристика, течение беременности, родов и послеродового периода, проанализированы особенности течения раннего неонатального периода.
У 56 пациенток всех групп и их новорожденных изучались однонуклеотидные генные полиморфизмы (SNP), которые представлены в табл. 1. Для определения полиморфизмов генов у пациенток использовалась венозная кровь, у новорожденных – пуповинная кровь. Забор крови из вены у беременных производился до родов по стандартной методике. Забор пуповинной крови производился в стерильных условиях в третьем периоде родов или во время кесарева сечения из сосудов пуповины.
Таблица 1. Список изученных полиморфизмов.
Определение замен одиночных нуклеотидов (табл. 1) проводили модифицированным методом «примыкающих проб» (adjacent probes, kissing probes), используя оригинальные олигонуклеотиды. Полимеразную цепную реакцию и определение температуры плавления олигонуклеотидных проб проводили с помощью детектирующего амплификатора ДТ-96 (ООО «НПО ДНК- Технология», Россия). Статистическая обработка данных проводилась с помощью свободно распространяемого программного продукта WINPEPI версии 9.7 (Abramson, J.H. WINPEPI (PEPI-for- Windows): computer programs for epidemiologists. Epidemiologic Perspectives & Innovations 200 4, 1: 6), Statsoft Statistica 8.0.725, IBM SPSS Statistics 19.0 for Windows. Для определения статистической значимости различий применялись точный двухсторонний критерий Фишера и U-тест Манна–Уитни для несвязанных совокупностей. Отношение шансов (OR) приведено с 95% доверительным интер- валом (CI).
Результаты исследования
Средний возраст пациенток составил в первой группе 28,8±5 лет, во второй – 28,0±4,4 года (p=0,2). Значения росто-весовых соотношений пациенток по группам не различались и соответствовали общепопуляционным нормам. При ретроспективном изучении анамнеза инфекционных и соматических заболеваний пациенток обеих групп во II группе статистически значимо чаще были отмечены ветряная оспа (80,4%) (p<0,05; OR=0,44; CI=0,22-0,87), хронический тонзиллит (37,1%) (OR=0,44; CI=0,23–0,86), варикозное расширение вен (25,6%) (OR=0,4; CI=0,3– 0,9). Среди патологии половых органов также во II группе статистически значимо чаще наблюдались кандидозный вагинит (23,7%) (OR=0,39, CI=0,17-0,91) и эктопия шейки матки (60,8%) (OR=0,50, CI=0,27–0,91).
Интерес представлял анализ акушерского анамнеза. 51% пациенток первой группы и 67% второй были повторнобеременными (OR=0,52, CI=0,3- 0,95), повторнородящими – 22 и 33% соответственно (OR=0,6, CI=0,3–1,11). Частота неразвивающихся беременностей и самопроизвольных выкидышей практически не различалась (9,8 и 13,4% в I против 11,3 и 14,4% во II соответственно) (OR=0,8, CI=0,4–2,2; OR=0,9, CI=0,4–2,2). Кесарево сечение в анамнезе отмечалось у 6,1% пациенток I группы и у 5,2% II. Каждая 3-я пациентка первой группы (28%) и каждая 8-я второй (11,3%) (OR=3,04, CI=1,4–6,7) имели в анамнезе искусственное прерывание беременности.
При анализе течения настоящей беременности было установлено, что I триместр у пациенток I группы чаще осложнялся угрозой выкидыша (56%) (OR 2,2; CI 1,2–4,0), в то время как во II триместре угроза позднего выкидыша чаще отмечалась во II группе (34%) (OR 0,49; CI 0,25– 0,98). В III триместре в группе сравнения чаще было отмечено маловодие (12,4%) (OR 0,26; CI 0,07–0,97). Статистически значимых различий среди других осложнений беременности в группах отмечено не было. Кесарево сечение проводилось у 45% первой и 30% пациенток второй группы, в подавляющем большинстве случаев в экстренном порядке (44 и 26,8%) (OR 2,1; CI 1,1–3,9), что, вероятно, связано с критериями включения в исследование. Статистически значимых различий в длительности периодов родов, объемах кровопотери выявлено не было. Частота разрывов влагалища и промежности I и II степени не различалась в обеих группах. Достоверных различий в частоте осложнений третьего периода родов также не выявлено. В 3,6 и 3,0%, соответственно по группам производилась операция «ручное обследование стенок послеродовой матки». В структуре показаний к кесареву сечению в основной группе преобладали сочетание ПРПО (40,5%) с возрастом роженицы (8,1%), отсутствием готовности родовых путей (24,3%), отягощенным акушерско- гинекологическим анамнезом (8,1%), ЭКО (8,1%), миопией (8,1%). В группе сравнения с большей частотой отмечали клинически узкий таз (17,2%), тазовое предлежание (13,8%) и рубец на матке (37,9%), также в обеих группах были отмечены преждевременная отслойка нормально расположенной плаценты (5,4 и 3,4%) и острая гипоксия плода (8,1 и 6,9%). Течение послеродового периода осложнялось анемией в 14,6 и 14,3% (OR 0,7; CI 0,12–4,8), субинволюцией матки в 2,4 и 3,1% (OR 0,7; CI 0,1–4,8), лохиометрой 2,4 и 6,1% (OR 0,4; CI 0,07–1,9) соответственно по группам.
Была проведена оценка раннего неонатального периода у 179 новорожденных. При сравнении двух групп достоверных различий в массо-ростовых показателях новорожденных и оценке состояния по шкале Апгар выявлено не было. Среди заболеваний раннего неонатального периода в основной группе достоверно чаще встречалась асфиксия легкой степени (22,0 и 9,3%) (OR 2,75; CI 1,16-6,51), в то время как группе сравнения – кожно-геморрагический (2,4 и 12,4%) (OR 0,17; CI 0,03–0,82). ЗРП плода (по гипопластическому типу) (малый размер плода для гестационного возраста – МКБ-10) отмечались в 3,7% в основной группе и в 2,1% группе сравнения, а недостаточность питания (маловесный плод для гестационного возраста – МКБ-10) в 4,9 и 4,1% соответственно по группам. Статистически значимых различий в частоте других заболеваний выявлено не было.
Учитывая отсутствие до настоящего времени достоверных прогностических маркеров ПРПО, было проведено изучение взаимосвязи ряда генных полиморфизмов, ассоциированных с особенностями архитектоники и гомеостазом соединительной ткани. Проведение корреляционного анализа полиморфизма генов белков ЭЦМ не выявило каких-либо значимых ассоциаций. В то же время анализ взаимосвязи полиморфизмов, ответственных за гомеостаз соединительной ткани с ПРПО установил у матерей взаимосвязь между ПРПО и полиморфизмом гена MMP9 -1562 C>T [rs3918242]. Частота генотипа С/С составила 100% в группе с ПРПО и 55,9% в группе сравнения (p=0,004; OR=22,3; CI=1,36–364,3). Распределение генотипов MMP9: -1562 C>T [rs3918242] представлено на рис. 1. У новорожденных частота генотипа С/С в группах не различалась (66,7 и 63,6% в I и II группах соответственно).
![Частота встречаемости генотипов ММР9: - 1562С>Т, [rs3918242] у пациенток с ПРПО (1) и без ПРПО (2)](https://lib.medvestnik.ru/apps/lib/assets/uploads/aig/2013/4/aig-4-2013-pic-2.jpg)
![Частота встречаемости генотипов ММР2: -735 С>А, [rs2285052] у новорожденных от матерей с ПРПО (1) и без ПРПО (2)](https://lib.medvestnik.ru/apps/lib/assets/uploads/aig/2013/4/aig-4-2013-pic-3.jpg)
При проведении анализа генных полиморфизмов у новорожденных, было обнаружено статистически значимое увеличение частоты генотипа А/А гена MMP2: -735 C>A [rs2285052] в группе с ПРПО (66,7 и 4,5% в группе с ПРПО и без ПРПО соответственно; p=0,029; OR=42; CI=2,63-671,4).
Частота встречаемости генотипов MMP2: -735 C>A [rs2285052] представлена на рис. 2. Частота генотипа А/А у матерей при ПРПО была также несколько выше (35,3 против 23,7%), однако различия не достигали уровня статистической значимости.
Статистически значимых ассоциаций между ПРПО и полиморфизмами остальных исследованных генов у матерей и новорожденных выявлено не было.
Обсуждение
В ряде работ была показана роль MMPs в процессах деградации соединительной ткани сердца, глаз, сосудов [10, 11]. MMP-2, 3, 9 и 14 экспрессируются в склере, участвуя в ее ремоделировании [12]. Известно, что ММР-1, ММР-2, ММР-3, ММР-7, ММР-9 определяются в амниотической жидкости и ПО во время нормальной беременности, причем уровень MMP-9 повышается в период родов [13, 14]. Максимальная активность MMP-9 регистрируется в плодных оболочках, в то время как ММР-2 характерна для децидуальной ткани [14]. Многими авторами изучались полиморфизмы генов, связанных с ПРПО, а также их роль в изменении экспрессии и активности ММР1, ММР8, ММР9, SERPINH1и др. [15, 16]. В исследовании о связи SNP матери и плода в кандидатных генах с ПРПО при недоношенном сроке было установлено, что риск ПРПО удваивается при наличии у матери полиморфизмов генов TIMP2 и COL4A3 типа. Однако при исследовании полиморфизмов гена MMP9 связи между ними и ПРПО найдено не было. В результате проведенного нами исследования были выявлены полиморфизмы генов MMP9 у матери и MMP2 у плода, ассоциированных с увеличением риска возникновения ПРПО. По данным некоторых авторов, при ПРПО аномальная экспрессия и активация ММР-9 может быть связана с родовой деятельностью. Триггерами активации могут быть продукты бактерий, цитокины IL-1β и TNF-α, паракринные или аутокринные сигналы [17, 18]. Полученные нами данные, по-видимому, указывают на генетическую предрасположенность к высокому уровню ответа на триггеры. Выявленные ассоциации позволяют предложить использование вышеуказанных полиморфизмов в качестве предикторов ПРПО.
Заключение
Таким образом, проведенное нами исследование установило ассоциацию высокого риска ПРПО с наличием полиморфизма генов MMP9 у матери и MMP2 у плода, что указывает на генетическую предрасположенность к данному осложнению беременности. Полученные результаты, с одной стороны, позволяют использовать вышеуказанные полиморфизмы в качестве неинвазивных предикторов ПРПО, с другой – обосновывают перспективность исследований по вкладу других факторов, ответственных за гомеостаз соединительной ткани в ПРПО.
