Proteomic composition of cervicovaginal fluid in cervical diseases associated with HPV infection

Zardiashvili M.D., Frankevich V.E., Nazarova N.M., Bugrova A.E., Kononikhin A.S., Brhozovsky А.G., Starodubtseva N.L., Asaturova A.V., Sukhikh G.T.

1Research Center of Obstetrics, Gynecology and Perinatology, Ministry of Health of Russia, Moscow, Russia 2 Moscow Institute of Physics and Technology, Dolgoprudny, Moscow Region, Russia 3Institute of Biomedical Problems – Russian Federation State Scientific Research Center, Russian Academy of Sciences, Moscow, Russia 4N.M. Emanuel Institute for Biochemical Physics, Russian Academy of Sciences, Moscow, Russia
Objective. To determine changes of the cervicovaginal fluid proteomic composition for assessment of the severity of HPV-associated cervical lesions among women of reproductive age.
Subject and methods. The study involved 30 volunteers with various forms of HPV-associated cervical lesions (ASCUS, LSIL and HSIL). All samples of cervicovaginal fluid were prepared for further proteomic analysis by tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS). Semi-quantitative data analysis including identification and annotation of proteins was carried out using the software package MaxQuant and Perseus.
Results. The protein panels specific to the various forms of HPV-associated cervical lesions (ASCUS, LSIL and HSIL) were identified. The first group of proteins (P4HB, HSPA8, C4BPA and others) characterized the early changes associated with HPV infection and cervical epithelium lesion, including viruspenetration into the cell and its transcription, impaired function of the complement system. The second group of proteins (PRDX5, YWHAE, LRG1 and others) were directly involved in the development and progression of cervical neoplasia and characterized late changes, in particular, reduced apoptosis, impaired differentiation and maturation of the epithelium, and the transformation of atypical cells.
Conclusion. The analysis of the proteome of the CVH allows to study the molecular mechanisms of the pathogenesis of HPV-associated cervical diseases and to differentiate epithelial changes at early stages of development.

Keywords

cervical intraepithelial neoplasia
HPV
proteomics
mass spectrometry
cervicovaginal fluid

Вирус папилломы человека (ВПЧ) высокого онкогенного риска является главным этиологическим фактором развития неоплазий и рака шейки матки (РШМ) [1]. Известно, что РШМ занимает одну из лидирующих позиций в структуре онкологических заболеваний и смертности у женщин, что является важной медицинской и социальной проблемой. По данным ВОЗ, ежегодно в мире выявляются 493,2 тысячи новых случаев РШМ [2].

Известно, что в большинстве случаев ВПЧ способно самостоятельно элиминироваться из организма. При персистенции ВПЧ в течение 3 лет у 27% женщин развиваются цервикальные интраэпителиальные неоплазии (ЦИН) тяжелой степени [3]. Это обуславливает важность диагностики ВПЧ-ассоциированных заболеваний шейки матки на ранних этапах их развития [4]. В связи с этим особое значение приобретают различные исследования и анализ молекулярного состава биологических жидкостей (цервиковагинальная жидкость, фоликулярная жидкость, кровь, моча и др.) и тканей современными точными и высокоспецифичными методами, в частности, методом масс-спектрометрии (МC). МС – это метод качественного и количественного определения веществ в пробе. Масс-спектрометрия позволяет изучать молекулярные механизмы патогенеза неоплазий и злокачественных заболеваний репродуктивной системы и выявлять изменения на ранних этапах [5].

Диагностический потенциал протеомного состава цервиковагинальной жидкости (ЦВЖ) обусловлен тем, что помимо продуктов жизнедеятельности микроорганизмов, населяющих нижний отдел женского генитального тракта, ЦВЖ включает в себя отслоившиеся эпителиальные клетки, шеечную слизь, секрет желез эндометрия и маточных труб, воду, муцин, белки, углеводы и неорганические вещества [6]. ЦВЖ имеет огромное значение в поддержании гомеостаза и в иммунной защите женского полового тракта. В виду простоты забора материала для исследования и благодаря изобилию молекулярного состава, ЦВЖ представляет большой интерес для изучения. Ранние исследования доказали роль ЦВЖ в защите организма от вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) в связи с наличием в ее составе ряда белков и пептидов, в частности кальгранулина А/В, лизоцима, человеческого нейтрофильного пептида, елафина и некоторых гистонов [7, 8]. Белковый состав ЦВЖ подвергается изменению при различных заболеваниях генитального тракта женщины, в том числе при поражении эпителия шейки матки, ассоциированные с папилломовирусной инфекцией.

Целью данной работы была характеристика изменений протеомного состава цервиковагинальной жидкости при ВПЧ-ассоциированных поражениях шейки матки различной степени тяжести у пациенток репродуктивного возраста.

Материал и методы исследования

В одномоментное проспективное исследование было включено 30 женщин, в возрасте от 21 до 45 лет (средний возраст 30,5 года), обратившихся в научно-поликлиническое отделение ФГБУ Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова Минздрава России, по поводу наличия патологии шейки матки.

Критерии включения: ВПЧ-инфекция, ВПЧ-ассоциированные заболевания шейки матки, регулярный менструальный цикл, подписанное информированное согласие на участие в исследовании.

Критерии исключения: наличие хронических заболеваний в стадии обострения, прием гормональной терапии, беременность, период лактации, наличие инфекций, передающихся половым путем, нарушение функции почек, печени, легких в стадии декомпенсации.

Комплексное обследование женщин включало: сбор клинико-анамнестических данных, определение гинекологического статуса, типирование, цитологическое исследование, расширенная кольпоскопия, протеомное исследование цервиковагинальной жидкости.Для оценки кольпоскопической картины применяли единую Международную кольпоскопическую классификацию, одобренную на 14-м Всемирном конгрессе IFCPC в Рио-де-Жанейро (2011 г.). Использовалась цитологическая оценка мазков с шейки матки по системе Бетесда [9].

Участники исследования дали добровольное письменное согласие на его проведение, подробности проводимого исследования были им разъяснены.

Пробоподготовка образцов для протеомного анализа

Забор ЦВЖ для последующего протеомного анализа осуществлялся путем орошения влагалища и шейки матки 5 мг раствором натрия хлорида 0,9%. Жидкость центрифугировалась при 2000 g в течение 10 мин при 4°C, супернатант замораживали и хранили до анализа при -80°С. Белки растворяли в буфере (0,2 M Tris-HCl, pH 8,5, 2,5 mM EDTA, 8 M мочевина), восстанавливали дитиотреитолом (0,1 М) 45 мин при 39°С, алкилировали йодацетамидом (0,05 М) 45 мин при 20°С и осаждали ледяным ацетоном с трифторуксусной кислотой (0,1%). Центрифугировали при 14000g 15 минут, осадок промывали этанолом, растворяли в 100 мМ аммоний-бикарбонатном буфере и добавляли трипсин в соотношении 1/50. Гидролизовали в течение 16 часов при 37°С, реакцию останавливали добавлением муравьиной кислоты до конечной концентрации 0,5%. Концентрацию белка в ЦВЖ определяли по методу Брэдфорда.

Тандемная хромато-масс-спектрометрия (ВЭЖХ-МС/МС)

Полученная пептидная смесь разделялась на высокоэффективном жидкостном хроматографе Agilent 1100 (Agilent Technologies, USA). Использовалась колонка, содержащая обратнофазный сорбент С18 (диаметр частиц 3 мкм, диаметр пор 100 Å). Для разделения использовался 120 минутный градиент (H20/ACN) от 0–15 мин с 3% ACN; 15–110 мин с 90% ACN; 115–120 мин с 3% ACN при скорости потока 300 нл/мин. Macc-спектрометрический анализ проводился на приборе 7 Тл LTQ-FT Ultra mass spectrometer (Thermo Electron, Bremen, Germany) с электроспрейным источником ионов.

Биоинформационный анализ данных

Полученные данные были проанализированы с помощью программного пакета MaxQuant. Для MS/MS поиска в него включалось до 8 главных пиков в 100 Da окне. Идентификация сформированных списков проводилась по прямой и обратной версии базы данных SwissProt, с максимальным допустимым отклонением от массы предшественника 6 ppm, Карбамидометилированием цистеинов в качестве фиксированной модификации а ацитилированием N-конца белков и окислением метионинов – как вариабельных модификаций. Пептиды идентифицировались минимум по 7 аминокислотам с установленным значением исключения при ложном поиске равным 0,01. В работе использовались только те белки, которые идентифицировались минимум по 2 пептидным фрагментам, причем один из них должен быть уникальным. Для полуколичественного анализа использовался метод «без метки» с дополнительной опцией «match between the runs». Статистический анализ полученных проводился с помощью программного пакета Perseus.

Результаты и обсуждение

Были сформированы 4 группы, в зависимости от результатов цитологического исследования (NILM, ASCUS, LSIL, HSIL): I группа – контрольная – 7 (23%) пациенток с NLIM, ВПЧ-негативные; 23 (77%) – ВПЧ-позитивные, разделены на 3 груп­пы: II группа – 11 (49%) пациенток с ACSUS, III группа – 7 (30%) пациенток с LSIL, IV группа – 5 (21%) пациенток с HSIL. Основная часть обследуемых пациенток были репродуктивного возраста, соматически не отягощены и подходили под все критерии включения в исследование. Возраст менархе в среднем составил ±12,7 года. Средний возраст начала половой жизни ±19,2 года. Общее количество беременностей составило 65, из которых родами завершились 25 (38%), абортами – 40 (62%). У 10 (33%) пациенток было более 4 половых партнеров. Из перенесенных гинекологических заболеваний в анамнезе выявлена высокая частота ИППП (66%). Клинико-анамнестический анализ показал, что приблизительно половина женщин с ВПЧ-инфекцией имели ранний половой дебют (до 18 лет в 48% случаев).

При изучении возрастного распределения выяснилось, что у женщин в возрасте до 30 лет чаще встречались ВПЧ высокоонкогенного типа (52,1%), ВПЧ высокого риска выявлен в 90,9% случаев в группе ASCUS и в 100% – LSIL и HSIL. Наиболее распространенным типами были ВПЧ 16 (34,8%), 31 (17,4%), 52, 58, 56 (13%), 18, 35 (8,7%), остальные типы встречались менее 5%. У 69% пациенток вирусная нагрузка была более 3,2 lоg (в среднем – 5,6 (5,2–6,2 lоg) без существенных различий между группами.

Всем пациенткам была проведена расширенная кольпоскопия. Нормальная кольпоскопическая картина наблюдалась у 7 (23%) пациенток, слабовыраженные и выраженные изменения при кольпоскопии – у 23 (87%) включали наличие ацетобелого эпителия (АБЭ), интенсивность проявления которого коррелировала со степенью тяжести процесса: слабовыраженные изменения выявлялись у 18 (60%), выраженные – у 5 (17%) .

В результате исследования в образцах ЦВЖ было выявлено 515 различных белков. Для определения меж- и внутригрупповых изменений протеомного состава проводился сравнительный анализ усредненных значений интенсивности белков по группам (рис. 1). В дальнейшем был введен критерий, в соответствии с которым потенциальный маркерный белок должен был встречаться как минимум в трех повторах в одной группе. В результате в анализе из 515 белков принимало участие 295. Отдельно проводилась оценка белков, характерных только для определенной группы, и оценка белковой композиции, характерной для всех четырех групп, для выявления достоверно изменяющихся белков.

Для поиска потенциальной панели белков-биомаркеров были проанализированы белки, характерные для каждой из групп и белки, встречающиеся только в одной группе. Был введен дополнительный критерий, в соответствии с которым белок должен был присутствовать как минимум у двух пациенток. Из 295 белков уникальными для группы ASCUS являются 12 белков, в том числе белок LRG1, отвечающий за регуляцию пролиферации эндотелиальных клеток; белок C4BPA, который на фоне персистенции ВПЧ дополнительно угнетает работу системы комплемента; белки-шапероны P4HB и HSPA8, которые характеризуют ранние изменения, ассоциированные с ВПЧ-инфекцией, в том числе проникновении вируса в клетку и его транскрипцию [10]; белки PRDX5 и YWHAE, связанные с нарушением регуляции апоптоза и усилением пролиферации атипических клеток. Также среди уникальной панели белков для группы ASCUS был выявлен белок ACTN4, считающийся в настоящее время одним из потенциальных маркеров неоплазий шейки матки [4]. Было показано, что повышение активности ACTN4 происходит при злокачественных трансформациях, и связано со снижением прочности межклеточных связей [11, 12].

Однако, несмотря на то, что в подобных исследованиях ACTN4 выявлялся при различных типах неоплазий, в нашем исследовании белок присутствовал только в группе ASCUS. Для групп HSIL специфичными оказались 2 белка, среди которых представляет интерес белок CPM, принимающий участие, как в деградации внеклеточных белков, так и в контроле активности белковых гормонов и факторов роста. Для группы контроля специфичным оказался белок MUC16, который обеспечивает синтез муцина, дополнительно защищающего клетки от вирусной инвазии (табл. 1).

С учетом вариабельности протеомного состава было решено сузить спектр анализируемых белков для выявления изменений среди белков, присутствующих во всех трех группах минимум в трех повторах. В результате 128 белков встречались во всех группах. Проанализировав данную выборку с использованием базы данных Gene Ontology, было показано, что 66 белков участвуют в метаболических процессах, причем большая их часть – в протеолизе, 29 белков ассоциированы с биологической регуляцией, 30 – с иммунными процессами и 26 стресс-белков, генез которых в рамках данного исследования не изучался (рис. 2). По классам большую часть белков представляют ингибиторы протеаз, которые, возможно, оказывают влияние на развитие патологического процесса, ингибируя апоптотические ферменты.

Далее был проведен ANOVA-тест с отклонением p-value менее 0,01: из 128 характерных белков было выявлено 37 достоверно изменяющихся в различных группах. Среди них присутствуют белки, которые представляют интерес в качестве потенциальных маркеров опухолевых изменений. Белки KLK6 и FBLN1 выполняют защитную функцию при развитии злокачественного новообразования, в частности, KLK6 ингибирует эпителиально- мезенхимальную трансформацию [13], а FBLN1 подавляет инвазию опухолевых клеток [14]. Также у пациентов в группах с неоплазиями шейки матки снижается уровень белка SERPINB3 [15], участвующего в иммунном ответе против опухолевых клеток и индуцирующего эпителиально- мезенхимальные трансформации, и повышается уровень SERPINB4, являющегося ингибитором протеазы и участвующим в модуляции иммунного ответа организма против опухолевых клеток [16].

Среди белков, значимо изменяющиеся в группах ASCUS, LSIL, HSIL, стоит отметить увеличение уровня белков TGM1 и ANXA3, участвующих в клеточной пролиферации и миграции эндотелиальных клеток соответственно (табл. 2). Наблюдается повышение уровня белка GM2A, коррелирующее с активностью опухолевых клеток [17]. Увеличение уровня белка SERPINB13, одной из функций которого является снижение апотоза кератиноцитов, может быть связано с выработкой атипическими клетками кератина и дальнейшим его накоплением [18].

Проводился анализ достоверно изменяющихся белков для каждой из трех групп ASCUS, LSIL, HSIL, попарно с NILM (табл. 2). Были выявлены 9 белков, которые достоверно изменяются во всех трех группах, среди них белки FBLN1, KLK6. Среди данных потенциальных биомаркеров неопластической трансформации эпителия шейки матки следует особо отметить белок S100A9 [19].

В результате в данной работе были определены белковые панели, специфичные для различных форм ВПЧ-ассоциированных поражений шейки матки (ASCUS, LSIL и HSIL). Первая группа белков (P4HB, HSPA8, C4BPA и др.) характеризуют ранние изменения, ассоциированные с ВПЧ-инфекцией, и связана с поражением эпителия шейки матки, в том числе с проникновением вируса в клетку и его транскрипцией, нарушением функции системы комплемента. Вторая группа белков (PRDX5, YWHAE, LRG1 и др.) принимает непосредственное участие в развитие неоплазий шейки матки и их прогрессировании и характеризует поздние изменения, в частности, снижение процесса апоптоза, нарушение дифференцировки и созревания эпителия, трансформации атипических клеток. Таким образом, анализ протеома ЦВЖ позволяет изучать молекулярные механизмы патогенеза ВПЧ-ассоциированных заболеваний шейки матки и дифференцировать изменения эпителия на ранних этапах развития.

References

1. Zur Hausen H. Papillomaviruses causing cancer: evasion from host-cell control in early events in carcinogenesis. J. Natl. Cancer Inst. 2000; 92(9): 690-8.

2. http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs380/en

3. Burmenskaya O.V., Nazarova N.M., Prilepskaya V.N., Mzarelua G.M., Bestaeva N.V., Trofimov D.Yu., Sukhikh G.T. Prediction of the risk and progression of cervical intraepithelial neoplasias associated with papillomavirus infection. Akusherstvo i ginekologiya/Obstetrics and Gynecology. 2016; (2): 92-98. (in Russian) http://dx.doi.org/10.18565/aig.2016.2.92-98

4. Van Raemdonck G.A., Tjalma W.A., Coen E.P., Depuydt C.E., Van Ostade X.W. Identification of protein biomarkers for cervical cancer using human cervicovaginal fluid. PLoS One. 2014; 9(9): e106488. doi: 10.1371/journal.pone.0106488. eCollection 2014.

5. Yang H., Lau W.B., Lau B., Xuan Y., Zhou S., Zhao L. et al. A mass spectrometric insight into the origins of benign gynecological disorders. Mass Spectrom Rev. 2017; 36(3): 450-70. doi: 10.1002/mas.21484.

6. Klein L.L., Jonscher K.R., Heerwagen M.H., Gibbs R.S., McManaman J.L. Shotgan proteomic analysis of vaginal fluid from woman in late pregnancy. Reprod. Sci. 2008; 15(3): 263-73.

7. Venkataraman N., Cole A.L., Svoboda P., Pohl J., Cole A.M. Cationic polypeptides are required for anti-HIV-1 activity of human vaginal fluid. J. Immunol. 2005; 175(11): 7560-7.

8. Good D.M., Thongboonkerd V., Novak J., Bascands J.L., Schanstra J.P., Coon J.J. et al. Body fluid proteomics for biomarker discovery: lessons from the past hold the key to success in the future. J. Proteome Res. 2007; 6(12): 4549-55.

9. Nayar R., Wilbur D.C. eds. The Bethesda System for Reporting Cervical Cytology. Definitions, criteria, and explanatory notes. 3rd ed. New York: Springer; 2015.

10. Bi S., Hong P.W., Lee B., Baum L.G. Galectin-9 binding to cell surface protein disulfide isomerase regulates the redox environment to enhance T-cell migration and HIV entry. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2011; 108(26):10650-5.

11. Nakatsuji H., Nishimura N., Yamamura R., Kanayama H.O., Sasaki T. Involvement of actinin-4 in the recruitment of JRAB/MICAL-L2 to cell-cell junctions and the formation of functional tight junctions. Mol. Cell. Biol. 2008; 28(10): 3324-35. doi: 10.1128/MCB.00144-08.

12. Barbolina M.V., Adley B.P., Kelly D.L., Fought A.J., Scholtens D.M. et al. Motility-related actinin alpha-4 is associated with advanced and metastatic ovarian carcinoma. Lab. Invest. 2008; 88(6): 602-14. doi: 10.1038/labinvest.2008.25.

13. Pampalakis G., Prosnikli E., Agalioti T., Vlahou A., Zoumpourlis V., Sotiropoulou G. A tumor-protective role for human kallikrein-related peptidase 6 in breast cancer mediated by inhibition of epithelial-to-mesenchymal transition. Cancer Res. 2009; 69(9): 3779-87. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-08-1976.

14. Hayashido Y., Lucas A., Rougeot C., Godyna S., Argraves W.S., Rochefort H. Estradiol and fibulin-1 inhibit motility of human ovarian- and breast-cancer cells induced by fibronectin. Int. J. Cancer. 1998; 75(4): 654-8.

15. Quarta S., Vidalino L., Turato C., Ruvoletto M., Calabrese F., Valente M. et al. SERPINB3 induces epithelial-mesenchymal transition. J. Pathol. 2010; 221(3): 343-56. doi: 10.1002/path.2708.

16. Sun Y., Sheshadri N., Zong W.X. SERPINB3 and B4: From biochemistry to biology. Semin. Cell Dev. Biol. 2017; 62: 170-7. doi: 10.1016/j.semcdb.2016.09.005.

17. Shin J., Kim G., Lee J.W., Lee J.E., Kim Y.S., Yu J.H. et al. Identification of ganglioside GM2 activator playing a role in cancer cell migration through proteomic analysis of breast cancer secretomes. Cancer Sci. 2016; 107(6):828-35.

18. Welss T., Sun J., Irving J.A., Blum R., Smith A.I., Whisstock J.C. et al. Hurpin is a selective inhibitor of lysosomal cathepsin L and protects keratinocytes from ultraviolet-induced apoptosis. Biochemistry. 2003; 42(24): 7381-9.

19. Fang W.Y., Chen Y.W., Hsiao J.R., Liu C.S., Kuo Y.Z., Wang Y.C. et al. Elevated S100A9 expression in tumor stroma functions as an early recurrence marker for early-stage oral cancer patients through increased tumor cell invasion, angiogenesis, macrophage recruitment and interleukin-6 production. Oncotarget. 2015; 6(29): 28401-24. doi: 10.18632/oncotarget.4951.

Received 07.02.2017

Accepted 17.02.2017

About the Authors

Zardiashvili Maka Djemalovna, PhD student, Research Center of Obstetrics, Gynecology and Perinatology, Ministry Of Health of Russia.
117997, Russia, Moscow, Ac. Oparina str. 4. Tel.: +79163375351. E-mail: z-m-d@mail.ru
Frankevich Vladimir Evgenievich, PhD, Head of Department of Systems Biology in Reproduction, Research Center of Obstetrics, Gynecology and Perinatology,
Ministry Of Health of Russia. 117997, Russia, Moscow, Ac. Oparina str. 4. Tel.: +74954380788, ext. 2198. E-mail: v_frankevich@oparina4.ru
Nazarova Niso Mirzoevna, MD, PhD, Senior Researcher, Research Center of Obstetrics, Gynecology and Perinatology, Ministry Of Health of Russia.
117997, Russia, Moscow, Ac. Oparina str. 4. Tel.: +74954381403. E-mail: grab2@yandex.ru
Bugrova Anna Evgenievna, PhD, Senior Researcher of Proteomics of Human Reproduction, Research Center of Obstetrics, Gynecology and Perinatology,
Ministry Of Health of Russia. 117997, Russia, Moscow, Ac. Oparina str. 4. Tel.: +79265626590. E-mail: a_bugrova@oparina4.ru
Kononikhin Aleksey Sergeevich, PhD, Researcher of Proteomics of Human Reproduction, Research Center of Obstetrics, Gynecology and Perinatology,
Ministry Of Health of Russia. 117997, Russia, Moscow, Ac. Oparina str. 4. Tel.: +79167854781. E-mail: konoleha@yandex.ru
Brhozovsky Alexander Gennadievich, PhD student of Laboratory of proteomics, Institute of Biomedical Problems – Russian Federation State Scientific Research Center, Russian Academy of Sciences. 123007, Russia, Moscow, Khoroshevskoye shosse 76. Tel.: +79167705168. E-mail: agb.imbp@gmail.com
Starodubtseva Nataliia Leonidovna, PhD, Head of Laboratory of Proteomics of Human Reproduction, Research Center of Obstetrics, Gynecology and Perinatology,
Ministry Of Health of Russia. 117997, Russia, Moscow, Ac. Oparina str. 4. Tel.: +79164639867. E-mail: n_starodubtseva@oparina4.ru
Asaturova Aleksandra Vyacheslavovna, PhD, Senior Researcher of pathologoanatomic department, Research Center of Obstetrics, Gynecology and Perinatology,
Ministry Of Health of Russia. 117997, Russia, Moscow, Ac. Oparina str. 4. Tel. +74954382311. E-mail: a_asaturova@oparina4.ru
Sukhikh Gennadiy Tikhonovich, Academician of RAMS, MD, PhD, Professor, Director, Research Center of Obstetrics, Gynecology and Perinatology,
Ministry Of Health of Russia. 117997, Russia, Moscow, Ac. Oparina str. 4. Tel.: +74954381800. E-mail: g_sukhikh@oparina4.ru

For citations: Zardiashvili M.D., Frankevich V.E., Nazarova N.M., Bugrova A.E., Kononikhin A.S., Brhozovsky А.G., Starodubtseva N.L., Asaturova A.V., Sukhikh G.T. Proteomic composition of cervicovaginal fluid in cervical diseases associated with HPV infection. Akusherstvo i Ginekologiya/Obstetrics and Gynecology. 2017; (4): 88-94. (in Russian)
http://dx.doi.org/10.18565/aig.2017.4.88-94

Similar Articles

By continuing to use our site, you consent to the processing of cookies that ensure the proper functioning of the site.