Несмотря на значительные успехи в изучении этиологии и патогенеза гиперплазии эндометрия (ГЭ),
многие вопросы лечения и профилактики этой патологии в настоящее время еще далеки от окончательного решения. Высокая частота рецидивирования ГЭ диктует необходимость совершенствования тактики ведения больных и оптимизации принципов применения гормонотерапии. Чувствительность к гормональным воздействиям во многом зависит от рецепторного фенотипа эндометрия [5, 9, 28]. В настоящее время выделяют два типа ER – ER-α и ER-ß, и 2 изоформы PR – PR−A и PR−B. ER и PR выявляются как в эпителиальных, так и в стромальных клетках эндометрия. В течение нормального менструального цикла их содержание претерпевает закономерные колебания: уровень ER значительно повышается в позднюю фазу пролиферации, достигает пика в середине цикла
и постепенно снижается на протяжении секреторной фазы, уровень PR становится максимальным в раннюю фазу секреции.
Концентрация ER и PR варьирует не только в зависимости от фазы менструального цикла, но и от наличия патологического процесса в слизистой оболочке матки, хотя данные литературы о содержании рецепторов к половым стероидным гормонам при ГЭ крайне разноречивы. Многие авторы отмечают наличие взаимосвязи с формой ГЭ, указывая на высокое содержание ER при простой ГЭ (ПГЭ), уменьшение при сложной (СГЭ), особенно при атипической (АГЭ) [1, 9, 17]. Подобная закономерность прослеживается и в отношении PR [2, 13]. Наряду с этим в ряде других исследований не выявлено значительных изменений рецепторного фенотипа эндометрия при ГЭ и зависиости экспрессии рецепторов от ее формы [23, 26].
Существует точка зрения, что различная экспрессия рецепторов половых стероидов в гиперплазированном эндометрии ассоциируется с разной ответной реакцией на терапию прогестагенами, которые подобно натуральному прогестерону нейтрализуют влияние эстрогенов путем уменьшения содержания PR и ER. Высокая экспрессия половых стероидных гормонов рассматривается как прогностический фактор адекватной реакции на воздействие экзогенных гормонов [10]. Снижение экспрессии сопряжено с нарушением сигнальных путей, регулирующих
действие половых стероидов, и часто сочетается с возрастанием экспрессии факторов роста. Это,
вероятно, свидетельствует о формировании автономии клетки и, соответственно, возникновении
резистентности к проводимой терапии прогестагенами. Различные виды прогестагенов и схемы
их назначения в разной степени ингибируют как экспрессию PR и ER в железах и строме эндометрия, так и пролиферативную активность [32]. Хотя на культуре клеток, негативных по PR и ER, показано, что подавление пролиферации эндометрия может осуществляться и за счет механизмов, непосредственно не контролируемых геномом.
В качестве одной из основных причин развития пролиферативных заболеваний эндо- и миометрия рассматривается дисбаланс процессов пролиферации и апоптоза. Вместе с тем данные литературы относительно уровня экспрессии маркеров пролиферации Ki-67 и PCNA в железистом и стромальном компонентах эндометрия при ГЭ достаточно противоречивы. Так, в одних исследованиях выявлено увеличение экспрессии маркеров пролиферации в гиперплазированном эндометрии [4, 6], особенно при АГЭ и РЭ [14], в других получены данные о низкой экспрессии Ki-67 и PCNA по сравнению с пролиферативным эндометрием [16] и отсутствии существенных различий при разных формах ГЭ [8, 12, 18].
Механизмы лечебного воздействия КОК, прогестагенов, аГнРГ на эутопический и эктопический эндометрий опосредуются снижением пролиферативной активности и активацией апоптоза [15]. Подобный эффект наблюдается и при использовании внутриматочной системы с левоноргестрелом (ЛНГ) с целью контрацепции, лечения эндометриоза и для защиты эндометрия при проведении ЗГТ. В последние годы этот вид гормонального воздействия с успехом используется для лечения ГЭ, поскольку он является эффективным за счет специфичности действия, обладает обратимым эффектом, минимизирует системные нежелательные воздействия и отличается экономичностью. Однако молекулярные механизмы действия внутриматочного контрацептива с ЛНГ (ЛНГ-ВМС) продолжают исследоваться, недостаточно изученными остаются вопросы влияния ЛНГ-ВМС на маркеры пролиферации и модуляцию экспрессии рецепторов при различных формах ГЭ. Это послужило основанием для проведения излагаемого научного исследования, цель которого заключалась в определении возможных механизмов реализации лечебного эффекта ЛНГ-ВМС при различных формах ГЭ на основе изучения экспрессии рецепторов к половым стероидам и пролиферативной активности клеток эндометрия.
Материал и методы исследования
В основу работы положены результаты комплексного клинико-лабораторного обследования 112 женщин в возрасте от 18 до 50 лет (средний возраст − 40,80±7,02 года) с различными формами
ГЭ. Показаниями к проведению внутриматочных вмешательств являлись маточные кровотечения различного характера, а также подозрения на патологию эндометрия по данным эхографии или гистеросальпингографии. Более половины больных − 70 (62,5%) находились в репродуктивном возрасте, в том числе 26 (23,2%) − в позднем репродуктивном, остальные 42 (37,5%) − в пременопаузе. У 70 (62,5%) больных диагностирована ПГЭ, у 25 (22,3%) − СГЭ и у 17 (15,2%) – АГЭ. У 60,7% больных, несмотря на проведение традиционной гормонотерапии (прогестагенами, КОК, аГнРГ), ГЭ носила рецидивирующий характер, среднее число ранее произведенных диагностических выскабливаний составило 4,1±0,21.
В качестве терапии ГЭ всем пациенткам на 4–7-й день менструального цикла вводили ВМС «Мирена»
(«Лейрас Фармасьютикалс», Финляндия), содержащую 52 мг ЛНГ, средняя скорость выделения которого составляет 14 мкг/сут [31]. После 6-месячного этапа локального воздействия ЛНГ осуществлялся морфологический контроль состояния эндометрия. При рецидивирующей ПГЭ и СГЭ, а также при АГЭ производились гистероскопия, раздельное диагностическое выскабливание слизистой оболочки матки и цервикального канала, при ПГЭ – вакуум-аспирация эндометрия атравматическими кюретками «Pipelle de Cornier» (Франция).
Иммуногистохимическому анализу были подвергнуты 82 образца ткани эндометрия: 72 получены
от больных с различными формами ГЭ (36 до и 36 после лечения) и 10 – от здоровых женщин, обратившихся для подбора контрацепции, которым в среднюю фазу пролиферации была произведена биопсия эндометрия. Перед проведением иммуногистохимического исследования материал фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина в течение 24 ч и заливали в парафин. Депарафинированные срезы ткани эндометрия помещали на высокоадгезивные предметные стекла, использовали моноклональные антитела (Daco Cytomation, Дания) к рецепторам эстрогенов (ER-α) (1:35) и прогестерона (PR) (1:50), к ядерному антигену пролиферирующих клеток PCNA (1:200)
и Ki-67 (1:40). Для восстановления антигенной активности срезы подвергали обработке 0,01 М-цитратным буфером с рН 6,0 в течение 15 мин в мини-автоклаве «2001 Retriever» (Pick Cell). Затем срезы инкубировали с 0,3%-ным пероксидом водорода для блокирования эндогенной активности пероксидазы, обрабатывали нормальной козьей сывороткой для снижения неспецифического связывания и инкубировали со специфическими первичными антителами при 40°С в течение 12 ч. Для инкубации использовали иммуностейнер «Envision +» (Daco Cytomation, Дания). После проведения иммуногистохимической реакции срезы окрашивали гематоксилином и заключали в синтетическую среду «Shandonmount TM» (CША).
Результаты специфического иммуногистохимического исследования идентифицировали с помощью
окрашивания ядер или цитоплазмы клеток и плазматической мембраны. Во всех случаях для исключения неспецифического окрашивания использовали «негативный контроль» (мышиный и кроличий) фирмы «Daco Cytomation» (Дания) в условиях, аналогичных проведению реакции с антителами (ER-α, PR, PCNA, Ki-67). Результаты реакции с антигенами ER-α, PR, PCNA, Ki-67, имеющими ядерную локализацию, оценивали с помощью автоматизированного количественного анализа, измерения площади, занятой положительно окрашенными ядрами.
Для углубленного изучения полученных цифровых результатов применялись методы вариационной
статистики в модификации алгоритмов пакета прикладных математических программ «Statistica. 6,0».
Определяли значимость (достоверность) различий сопоставляемых средних величин по параметрическому критерию Стьюдента (t) и непараметрическим критериям Вилкоксона, Манна–Уитни для несвязанных совокупностей. Результаты представлены в виде M±m, различия считались достоверными при p≤0,05. Корреляционный анализ проводился по обычной схеме, вычислялись коэффициенты парной корреляции (r, р≤0,05). Для оценки достоверности межгрупповых различий был также использован критерий хи-квадрат (χ2; p≤0,05).
Результаты исследования и обсуждение
Экспрессия ER и PR
Согласно полученным результатам иммуногистохимического анализа, наиболее высокий уровень экспрессии ER-α отмечался в железах и строме при АГЭ (p<0,05), а максимальный уровень PR – в клетках желез и стромы у больных с ПГЭ по сравнению с другими формами ГЭ (р<0,05; рис. 1, см. на вклейке). Независимо от формы ГЭ более низкая экспрессия ER-α выявлена в стромальных клетках эндометрия по сравнению с железистыми. Как видно из данных, представленных на рис 3 и 4 (см. на вклейке), аналогичная тенденция наблюдалась и в отношении экспрессии PR. Соотношение стероидных рецепторов ER/PR в железах при АГЭ составило 1,18 и значительно превышало аналогичные показатели при ПГЭ и СГЭ (0,77 и 0,72) (р<0,05). Соотношение ER/PR в клетках стромы существенно не различалось и составило 0,62; 0,83 и 0,88 при ПГЭ, СГЭ и АГЭ соответственно (р>0,05; см. рис. 1 на вклейке).
В ходе исследования установлено, что 6-месячное воздействие ЛНГ при всех формах ГЭ влечет выраженное снижение экспрессии ER-α и, особенно PR, как в железах, так и в строме эндометрия по сравнению с исходными показателями. На это указывало уменьшение иммуноокрашивания клеток, связавших соответствующие антитела (рис. 2, см. на вклейке). Удалось показать, что степень снижения экспрессии половых стероидных гормонов находится в обратной зависимости от тяжести ГЭ. Данные, представленные на рис. 1 и 2 ( см. на вклейке), свидетельствуют о том, что наибольший эффект от проведенной терапии, проявляющийся практически полной блокадой ER-α, определялся среди больных ПГЭ. При СГЭ и особенно АГЭ экспрессия объективно сохранялась, хотя и на более низких уровнях. Немаловажно, что при ПГЭ наблюдался сопоставимый эффект на экспрессию ER-α как в железах, так и строме эндометрия, при остальных формах ГЭ динамика была схожей, однако со значительно более выраженным воздействием на уровень ER-α в строме эндометрия. Так, экспрессия ER-α в стромальном компоненте эндометрия при СГЭ снизилась на 71,5%, при АГЭ – на 57,6%, в железистом – лишь на 19,9 и 29,9% (рис. 3, см. на вклейке).
Подобная закономерность прослеживалась и в отношении PR. Под локальным влиянием ЛНГ при ПГЭ
и СГЭ экспрессия PR в железах не выявлялась, а в строме была на крайне низких уровнях (4,1 и 2,5%).
При АГЭ влияние на PR было менее выраженным: уровень экспрессии PR после лечения в железах составил 20%, в строме – 22,7%. Также было установлено, что воздействие ЛНГ-ВМС на экспрессию PR более значительно в железах эндометрия, чем в строме.
После проведенной терапии изменилось соотношение стероидных рецепторов ER/PR, которое
в железах при ПГЭ снизилось примерно в 2 раза (до средних значений 0,36), при СГЭ достоверно
не изменилось (0,72 и 0,65), при АГЭ повысилось с 1,18 до 1,9 (р<0,05) и существенно превысило
соответствующие показатели при простой и сложной ГЭ. Соотношение ER/PR в строме при ПГЭ
и АГЭ достоверно снизилось до значений 0,36 и 0,65 (p<0,05), при СГЭ такой закономерности выявить
не удалось.
Экспрессия PCNA и Ki-67
Исходная оценка экспрессии маркеров пролиферации PCNA и Ki-67 свидетельствует о том, что ее
уровень как в железах, так и в строме был более низким при ГЭ, чем в неизмененном эндометрии стадии пролиферации. Независимо от формы ГЭ наиболее высокая экспрессия PCNA и Ki-67 отмечена в железах эндометрия, чем в строме (p<0,05) (см. таблицу). Данные, представленные в этой таблице, указывают на то, что достоверных различий по маркерам пролиферации в зависимости от формы ГЭ выявить не удалось.
Таблица. Экспрессия PCNA и Ki-67 при различных формах ГЭ.
Шестимесячное воздействие ЛНГ сопровождается снижением пролиферативной активности железистых и особенно стромальных клеток эндометрия, что подтвердилось доказанным уменьшением экспрессии Ki-67 и PCNА (р<0,05). Установлено, что внутриматочное влияние ЛНГ на пролиферацию эндометрия определяется формой ГЭ. Так, под воздействием терапии экспрессия PCNА при ПГЭ и СГЭ понизилась примерно в 2,7 раза, при АГЭ – только в 1,5 и к концу курса терапии почти в 2 раза превысила аналогичные показатели у больных с ГЭ без клеточной атипии (рис. 4, см. на вклейке).
Морфологическое исследование
Оценка эффективности использования ЛНГ-ВМС в лечении ГЭ основывалась на результатах морфологического исследования образцов ткани эндометрия. Установлено, что после 6 месяцев применения ЛНГ-ВМС у 94,5% больных морфологическая картина соответствовала известным представлениям о гормонально измененной слизистой оболочке тела матки. Вместе с тем у 4,6% пациенток участки ГЭ сохранялись, в 0,9% случаев после экспульсии ЛНГ-ВМС эндометрий соответствовал стадии пролиферации. После 2-го этапа лечения ЛНГ-ВМС длительностью 12 мес ни в одном образце ткани признаков ГЭ определено не было. Можно полагать, что в ряде случаев оправданно проведение более длительного курса терапии.
После 6-месячного применения ЛНГ-ВМС получен сопоставимый лечебный эффект у больных репродуктивного и пременопаузального возраста: признаков ГЭ не было выявлено у 94,5 и 95,2% соответственно. Создается впечатление, что эффективность терапии определяется не возрастом больных, а наличием признаков клеточной атипии в железистом компоненте эндометрия. На это указывают следующие результаты: при ПГЭ и СГЭ полный морфологический эффект был достигнут практически у всех больных, при АГЭ − лишь в 76,5% случаев.
Гормонорецепторные взаимодействия во многом обусловливают эффекты действия половых стероидных гормонов, пролиферативную активность железистого эпителия и стромальных клеток эндометрия. Представления о содержании половых стероидных гормонов при ГЭ весьма неоднозначны, что, вероятно, связано с различными методологическими подходами к оценке рецепторного фенотипа эндометрия, с разной представительностью выборок обследованных больных, включающих вариации возраста, численность групп и различие форм ГЭ. Результаты, полученные в ходе проведенного исследования, в котором оценивались образцы ткани эндометрия разных форм ГЭ, указывают на то, что наиболее высокий уровень экспрессии ER-α отмечен в железах и строме при АГЭ, а максимальный уровень PR – при ПГЭ. Эти различия наиболее ярко прослеживались при анализе соотношения ER/PR в железах эндометрия, которое при АГЭ примерно в 1,5 раза превышало аналогичные показатели при ПГЭ и СГЭ. Полученные данные не согласуются с результатами других авторов, указавших на высокое содержание ER при ПГЭ, их уменьшение при СГЭ и особенно при АГЭ [1, 9, 17], но совпадают с данными в отношении экспрессии PR [3, 13]. Иммуногистохимический анализ дал возможность оценить экспрессию ER-α и PR в различных компонентах эндометрия. Независимо от формы ГЭ более низкая экспрессия обоих типов рецепторов выявлена в стромальных клетках эндометрия по сравнению с железистыми.
Исследование показало, что применение ЛНГ-ВМС при ГЭ вызывает выраженное снижение экспрессии
ER-α и особенно PR как в железах, так и в строме эндометрия, а степень снижения экспрессии половых
стероидных гормонов находится в обратной зависимости от тяжести ГЭ. Эта точка зрения полностью
согласуется с результатами работы Н. Utsunomiya и соавт. Авторы сообщают о наибольшем эффекте
лечения при ПГЭ и СГЭ, когда до введения ЛНГ-ВМС наблюдалась значительно более высокая экспрессия PR и более низкая экспрессия ER, чем при АГЭ [30].
Результаты оценки соотношения ER/PR в динамике при различных типах ГЭ дают основание предполагать, что меньшая эффективность ЛНГ-ВМС при АГЭ обусловлена не только исходно более низкой экспрессией PR, но и нарушением механизмов регуляции ER-α и PR, которые возникают в результате изменения эпителиально-стромальных взаимодействий. Это вызывает уверенность в правильности вывода о том, что экспрессию ER и PR можно считать реальным предиктором эффективности ЛНГ-ВМС при ГЭ, поскольку лечебное воздействие ЛНГ при всех формах ГЭ опосредуется уменьшением количества рецепторов стероидных гормонов,как в железах, так и в строме эндометрия. Существенно, что полученные результаты и обобщения во многом соотносятся
с точкой зрения Е. Akesson и соавт. [10]. Было показано, что снижение экспрессии ER-α и PR в нашем
исследовании находится в обратной зависимости от тяжести ГЭ. Эта позиция согласуется с данными
научной литературы, в частности с точкой зрения И.В. Станоевич, а также А.В. Vereide и соавт. [7, 32]
Однако результаты исследования Masuzawa и соавт. [24] не позволяют говорить о значимости прогностической роли исходной экспрессии стероидных рецепторов в эндометрии в отношении эффективности терапии пероральными гестагенами. Впрочем, это вполне может еще раз указывать на преимущества внутриматочного воздействия [10, 24, 31].
Надо отметить, что некоторые авторы, в частности Н.С. Nyholm и соавт., пытались проследить зависимость между уровнем экспрессии PR в гиперплазированном эндометрии до лечения и эффективностью воздействия прогестагенов [25]. Ими было высказано предположение, что большее содержание PR в эндометрии ассоциируется с большим количеством прогестерона или прогестагена, который связывается с ними, обеспечивая значительный лечебный эффект. Эта точка зрения согласуется с результатами проведенного нами иммуногистохимического исследования, которое показало, что наибольший эффект от лечения был получен при ПГЭ и СГЭ, при которых до введения ЛНГ-ВМС наблюдалась более высокая экспрессия PR и более низкая экспрессия ER по сравнению с АГЭ. Об этом убедительно свидетельствует и разница в соотношении ER/PR в железах, о чем говорилось выше.
Согласно результатам, полученным в ходе исследования, более низкие уровни маркеров пролиферации
PCNA и Ki-67 были определены в образцах гиперплазированного эндометрия по сравнению с эндометрием стадии пролиферации. Подобные результаты описывают ряд других авторов [19, 25, 27]. Хотя, как это уже было отмечено, имеются работы, в которых не было установлено значительных различий между маркерами пролиферации при ГЭ и эндометрия стадии пролиферации [9, 21, 22, 24]. Впрочем, известны сообщения о высокой экспрессии маркеров пролиферации при ГЭ [4]. По мнению Y. Yokoyama и соавт., высокая экспрессия PCNA и Ki-67 при ГЭ является неблагоприятным прогностическим фактором и может свидетельствовать о начале неопластической трансформации [33]. Схожие результаты приведены в ряде ранее опубликованных работ [11, 29], равно как и противоположные данные [20]. В результате выполненной нами работы достоверной зависимости уровня экспрессии от формы ГЭ установить не удалось, хотя по мере нарастания тяжести структурных изменений наблюдалась тенденция к некоторому повышению клеточной пролиферации. Под локальным воздействием ЛНГ отмечено выраженное снижение пролиферативной активности, взаимосвязанное
с формой ГЭ. Хотелось бы еще раз отразить тот факт, что при ПГЭ и СГЭ экспрессия PCNА понизилась
более, чем в 2,5 раза, при АГЭ – только в 1,5 и к концу курса терапии почти в 2,0 раза превысила аналогичные показатели у больных с ГЭ без клеточной атипии. Менее выраженное подавление пролиферативной активности эндометрия под влиянием ЛНГ-ВМС при АГЭ, видимо, может быть одной из причин меньшей эффективности терапии. По всей видимости, у этого контингента больных период воздействия ЛНГ-ВМС должен быть более длительным или терапия должна быть комбинированной.
Таким образом, на основе изучения экспрессии половых стероидных гормонов и маркеров пролиферации (PCNA и Ki-67) нами были получены новые данные о механизмах лечебного воздействия ЛНГ-ВМС и научные доказательства различной эффективности терапии при ПГЭ и СГЭ по отношению к АГЭ, что можно расценивать как новый взгляд на изучаемую проблему.
Лечебное воздействие ЛНГ при всех формах ГЭ опосредуется уменьшением экспрессии ER-α и PR
как в железах, так и в строме эндометрия. При этом степень ее снижения находится в обратной зависимости от тяжести ГЭ: при ПГЭ наблюдается практически полная блокада ER-α и PR, при СГЭ эта закономерность прослеживается только в отношении PR, при АГЭ экспрессия обоих видов стероидных рецепторов снижается в значительно меньшей степени.
Внутриматочное воздействие ЛНГ сопровождается уменьшением пролиферативной активности железистых и особенно стромальных клеток эндометрия, об этом свидетельствует уровень экспрессии маркеров пролиферации Ki-67 и PCNA, который при простой и сложной ГЭ понижается приблизительно
в 2,5 раза, при атипической – только в 1,5 и к концу курса терапии почти в 2 раза достоверно превышает аналогичные показатели в группе больных ПГЭ и СГЭ (р<0,05).
В целом результаты, полученные в ходе настоящего исследования, позволяют считать научно обоснованным внутриматочное применение ЛНГ в качестве высокоэффективного средства лечения ПГЭ и СГЭ и альтернативного – при лечении АГЭ у женщин репродуктивного возраста, заинтересованных в беременности.
