Формирование межклеточных контактов (адгезия клеток) играет важную роль на всех этапах репродуктивного цикла (оплодотворение, имплантация, плацентация, гисто- и органогенез) и осуществляется с участием молекул клеточной адгезии (МКА) [11]. МКА — сложные трансмембранные белки, не только обеспечивающие механическое взаимодействие клеток с соседними клетками или элементами межклеточного матрикса, но и участвующие в процессах межклеточной сигнализации. Все МКА объединяются в настоящее время в пять семейств структурно и функционально родственных молекул [2, 8]. Все классы МКА широко представлены на клетках иммунной и репродуктивной систем [7, 18, 20].
Изменение экспрессии МКА, а также содержания растворимых форм МКА в кровотоке и других биологических жидкостях лежит в основе и усугубляет течение многих заболеваний, в том числе и связанных с патологией репродукции [6, 19, 21]. Одно из самых тяжелых и распространенных осложнений беременности — преэклампсия. Считается, что ее причиной является несовершенная адаптация сосудистой системы и неспособность организма матери адекватно обеспечить потребности развивающегося плода. Это выражается в целом ряде функциональных нарушений, которые в тяжелых случаях могут приводить к органическим поражениям органов и тканей матери и плода, в том числе к эндотелиальной дисфункции [4, 5]. Преэклампсия рассматривается и как синдром системного воспалительного ответа [3, 12].
Молекулы адгезии активно исследуются в качестве возможных маркеров для прогноза и диагностики преэклампсии [10, 14, 16]. Однако в целом данные о появлении в крови растворимых форм МКА весьма ограниченны.
Целью настоящего исследования явилось изучение динамики содержания растворимых форм МКА — sICAM-1, sVCAM-1, sL-селектина и sE-селектина в сыворотке крови женщин в течение физиологической беременности и беременности, осложненной преэклампсией различной степени тяжести.
Материал и методы исследования
Всего проспективно обследовано 126 беременных в различные сроки гестационного периода. Пациентки наблюдались с ранних сроков беременности до родов. Пробы крови для анализа растворимых форм МКА брали несколько раз в течение беременности в интервалах 8–13, 14–20, 21–26, 27–31, 32–36, 37–41 нед. Количество обследованных пациенток в указанных интервалах представлено в табл. 1.
Контрольную группу составили 73 беременные с физиологическим течением беременности и родов. В основную группу включены 53 пациентки с 8-й по 41-ю неделю беременности, протекающей с осложнениями. Из них 8 беременных в І триместре беременности (8–13 нед) с клиническими проявлениями токсикоза І триместра и угрозой прерывания. У 2 женщин произошел выкидыш на сроке 13–14 нед, у 3 — в дальнейшем развилась преэклампсия тяжелой степени. У остальных женщин основной группы во II и III триместрах беременности в различные гестационные сроки также был поставлен диагноз преэклампсии средней и тяжелой степени. Оценку степени тяжести преэклампсии проводили согласно Международной классификации болезней 9-го пересмотра [14]. По возрасту, числу беременностей и родов в анамнезе контрольная группа и группа пациенток с преэклампсией были сопоставимы.
Образцы крови у пациенток брали из локтевой вены. Сыворотку получали стандартным способом: образцы отстаивали при комнатной температуре до образования сгустка, центрифугировали при 3000 об/мин, надосадок помещали в пробирку типа Эппендорф и хранили при температуре -80°С.
Определение растворимых форм МКА (sE-селектин, sL-селектин, sICAM-1 и sVCAM-1) в сыворотке крови осуществляли методом иммуноферментного анализа (ELISA) с использованием стандартных тест-систем фирмы Bender MedSystems GmbH (Австрия). Оптическую плотность измеряли с помощью планшетного ридера BioTek (США) при длине волны 450 нм. Построение калибровочного графика и расчет концентраций sE-селектина, sL-селектина, sICAM-1 и sVCAM-1 производили по уравнениям линейной регрессии в логарифмических координатах.
Статистическую обработку данных проводили по общепринятым методам вариационной статистики. Значимость наблюдаемых отклонений оценивали с помощью t-критерия Стьюдента.
Результаты исследования и обсуждение
Результаты определения концентрации растворимых форм МКА (sE-селектин, sL-селектин, sICAM-1 и sVCAM-1) в сыворотке крови пациенток с физиологическим течением беременности и беременностью, осложненной преэклампсией, представлены на рис. 1.
Динамика растворимых форм МКА при физиологической беременности
При физиологическом течении беременности содержание растворимой формы sICAM-1 (рис. 1, а) колебалось незначительно. Так, в І триместре концентрация sICAM-1 в сыворотке крови составила 3327±627 нг/мл. Далее наблюдалась тенденция к некоторому снижению к 21–26-й неделе беременности. К 27–31-й неделе беременности отмечено достоверное повышение концентрации sICAM-1 по сравнению с предыдущим сроком (4582±552 нг/мл). К родам содержание sICAM-1 постепенно снижалось до уровня в І триместре, оставаясь, однако, достоверно выше, чем в первой половиной ІІ триместра (14–20 нед). Изменение концентрации sVCAM-1 в динамике беременности (рис. 1, б) выглядит следующим образом. С первых недель беременности наблюдались незначительные колебания в содержании данной молекулы в крови, вплоть до срока 32–36 нед, когда выявлено уже достоверное повышение (343±34 нг/мл), и перед родами концентрация sVCAM-1 оставалась достоверно более высокой (344±27 нг/мл), чем в 21–26 нед (260±25 нг/мл). При изучении динамики содержания в крови sL-селектина (рис. 1, в) обнаружена тенденция к снижению концентрации данной МКА в крови, начиная с І триместра, — с 3091±224 до 2532±162 нг/мл перед родами, когда различия в содержании этой молекулы становятся значимыми. Достоверные изменения содержания в сыворотке крови sE-селектина (рис. 1, г) отмечались на сроке 37–41-я неделя — перед родами (77±12 нг/мл) по сравнению с началом ІІ триместра — до 20 нед (43±7 нг/мл). В остальные сроки исследования колебания содержания этой МКА не достигли статистически значимых различий.
Динамика растворимых форм МКА при беременности, осложненной преэклампсией
При беременности, осложненной преэклампсией, содержание sICAM-1 (см. рис. 1, а) с І триместра по 36-ю неделю беременности статистически не различалось. Достоверное уменьшение содержания sICAM-1 до 3892±938 нг/мл выявлено перед родами (37–41-я неделя беременности) по сравнению с содержанием в І триместре (6639±776 нг/мл) и на сроке 21–26 нед (7460±1432 нг/мл). Содержание sVCAM-1 в крови (см. рис. 1, б) плавно увеличивалось с І триместра до максимальной концентрации на сроке беременности 27–31 нед, когда она составила 657±70 нг/мл и достигла достоверных различий с концентрацией в І триместре (451±54 нг/мл), с последующим снижением к родам. Динамика содержания sL-селектина при преэклампсии в целом совпадает с тенденциями, выявленными при физиологической беременности (см. рис. 1, в). Однако значимыми оказались различия в содержании этой МКА на сроке 27–31 и 32–36 нед по сравнению с І триместром. Содержание sL-селектина в сроки 8–13, 14–20, 21–26, 27–31, 32–36 нед составило 4180±516; 2058±626; 2829±308; 2323±304 и 2245±239 нг/ мл соответственно. Незначительное увеличение концентрации наблюдалось перед родами (37— 41-я неделя) и составило 2938±514 нг/мл. В содержании sE-селектина при преэклампсии, так же как и при физиологической беременности, отмечались резкие достоверные колебания (см. рис. 1, г). Если в I триместре концентрация его в крови составила 95±24 нг/мл, то во II триместре — 58±9 нг/мл. К сроку 27–31 нед его содержание вновь повысилось до 130±36 нг/мл, потом опять снизилось, сначала до уровня 57±16 нг/мл на сроке 32–36 нед и далее до минимальной концентрации 30±7 нг/мл перед родами.
Изменение содержания растворимых форм МКА при преэклампсии тяжелой степени с тяжелыми перинатальными осложнениями
Проанализирована группа из 14 пациенток с беременностью, осложненной преэклампсией тяжелой степени, которые были экстренно родоразрешены на сроке 26–33 нед в связи с нарастанием тяжести клинических симптомов преэклампсии и перинатальных осложнений у плода. Перинатальные исходы у беременных этой группы: задержка внутриутробного развития (10%), недоношенность (100%), гипотрофия (50%), морфофункциональная незрелость (60%), аспирационный синдром (50%). Оценка плода по шкале Апгар на 1–5-й минуте 8/8 баллов и более не зафиксирована ни разу, 7/8 баллов –в 20% случаев, 6/7 баллов и менее — в 80% случаев. У 4 (28,5%) беременных на сроке 28–30 нед произошла антенатальная гибель плода.
Сравнение результатов обследования пациенток с беременностью, осложненной преэклампсией тяжелой степени и с тяжелыми перинатальными осложнениями (основная группа), и пациенток с пролонгированной беременностью (группа сравнения), представлено на рис. 2. Содержание показателя иллюстрируется гистограммами распределения по интервалам, на которые разбит весь диапазон полученных значений концентраций, и характеризуется долей пациенток с содержанием конкретной МКА в каждом выбранном интервале. Так, в группе сравнения на сроке 21–26 нед доля пациенток с содержанием sICAM-1 от 0 до 4000 нг/мл(см. рис. 2, а1) составляет 33,3%, тогда как в основной группе таких пациенток не было (см. рис. 2, а3).
Обобщая представленные на рис. 2 результаты, можно отметить следующее. В срок 27–31 нед беременности содержание sICAM-1 в крови беременных основной группы достоверно выше, чем в группе сравнения (см. рис.2, а3). Распределение значений содержания sICAM-1 в основной группе свидетельствует о большей доле пациенток с высоким содержанием sICAM-1, чем в группе сравнения. Большинство концентраций sVCAM-1 (см. рис. 2, б3) в основной группе также группируется в области более высоких значений, чем в группе сравнения, значимое превышение ее содержания регистрируется на сроке 21–26 нед беременности. Также в основной группе увеличивается доля пациенток с высоким содержанием в крови sE-селектина (см. рис. 2, г3) с достоверным превышением его содержания на сроке беременности 21–26 нед. Как оказалось, в основной группе больше доля пациенток с низкими значениями sL-селектина (см. рис. 2, в3), хотя различия средних значений его содержания в крови беременных этих двух групп статистически незначимы.
Прогностическая значимость полученных результатов
Исследование динамики содержания МКА в периферической крови пациенток с физиологической беременностью и беременностью, осложненной преэклампсией средней и тяжелой степени, сопоставимых по срокам беременности, позволило установить следующее. Содержание sICAM-1 и sVCAM-1 у пациенток с беременностью, осложненной преэклампсией, достоверно выше, чем у пациенток с физиологическим течением беременности на всех изученных сроках гестации, за исключением срока перед родами (37–41-я неделя), причем в І триместре и в 21–26 нед — более чем в 2 раза (см. рис. 1); различия в содержании sL-селектина достоверны в І триместре, в содержании sE-селектина — перед родами (37–41-я неделя).
Таким образом, при преэклампсии наблюдается выраженный дисбаланс в содержании МКА. Отклонения в содержании sICAM-1 и sVCAM-1 в крови пациенток с высоким риском развития преэклампсии могут быть маркерными для прогнозирования развития преэклампсии на всем протяжении беременности, а в содержании sL-селектина — и на ранних сроках. В табл. 2 приведены статистические характеристики прогноза развития преэклампсии у беременных с высоким риском данного осложнения в зависимости от срока гестации, рассчитанные с учетом значимых отклонений в содержании исследованных МКА.
Как видно из табл. 2, чувствительность и специфичность данных тестов являются достаточными для прогнозирования развития преэклампсии уже на ранних сроках беременности: при превышении содержания в крови определенных пороговых концентраций МКА с вероятностью более 80% можно предполагать развитие преэклампсии у пациенток из группы высокого риска. В случае появления клинических симптомов преэклампсии после 20-й недели беременности с помощью данных тестов можно уточнить диагноз. В случае усугубления тяжести течения преэклампсии исследование крови на содержание указанных МКА позволит, вероятно, наряду с другими специфическими исследованиями, применяемыми в подобных случаях, прогнозировать риск развития перинатальных осложнений (табл. 3).
В результате многочисленных исследований, посвященных проблеме преэклампсии, сформулирована гипотеза, согласно которой в основе патогенеза данного осложнения беременности лежит универсальный механизм проявления системного воспалительного ответа на повреждение ткани или иммунный конфликт. Активация эндотелиальных клеток представляет собой часть генерализованной внутрисосудистой воспалительной реакции, вовлекающей лейкоциты, свертывающую систему крови и систему комплемента [1, 3].
Признаки системной воспалительной реакции наблюдаются и при физиологической беременности [22]. Декомпенсация систем, регулирующих нормальное развитие беременности, приводит к развитию и усугублению преэклампсии, вследствие чего преэклампсия рассматривается как чрезмерный воспалительный ответ на беременность [3, 12]. Полученные в настоящей работе результаты исследования изменений концентрации растворимых МКА в крови женщин при физиологической беременности не противоречат данным литературы [16, 17]. При физиологической беременности не выявляется драматических изменений в содержании МКА. Достоверные изменения в III триместре обусловлены закономерной активизацией процессов свертывания крови, активацией комплемента, ренинангиотензиновой системы, системной воспалительной реакции и изменением гормонального фона материнского организма, который готовится к родам. Декомпенсация систем, регулирующих вышеназванные процессы, может приводить к развитию преэклампсии и других патологических состояний матери и плода в III триместре. Однако уже на ранних сроках беременности может наблюдаться развитие реакций, отклоняющихся от нормальных [9]. Подтверждением этому может служить обнаруженная в настоящем исследовании иная динамика растворимых форм МКА при преэклампсии. Так, нами отмечено достоверно повышенное содержание в крови sICAM-1 и sVCAM-1 на ранних сроках гестации у пациенток с высоким риском развития преэклампсии (с токсикозом І триместра и угрозой прерывания). Уровень sICAM-1 в крови в І и ІІ триместрах беременности максимален, затем постепенно снижается до минимальных концентраций перед родами. Содержание sVCAM-1 увеличивается до максимальных значений к началу ІІІ триместра, затем снижается к родам, как и содержание sE-селектина.
Отличия в динамике содержания МКА при пре-эклампсии по сравнению с нормально протекающей беременностью, очевидно, связаны с высокой степенью эндотелиальной активации. С одной стороны, наблюдающиеся в ранние сроки беременности высокие концентрации МКА в крови связаны с активацией иммунокомпетентных клеток в ответ на развитие полуаллогенного плода [15]. Однако при нормальной имплантации и инвазии трофобласта выраженные признаки воспалительной реакции подавляются с сохранением определенного “воспалительного” фона, не нарушающего иммунный гомеостаз в целом. Поскольку в І триместре происходит интенсивная «сборка» и пространственная организация всех тканей, органов и систем плода, появление в кровотоке избыточного количества растворимых факторов может отражать как изменение фенотипа клеточной поверхности и интенсивное слущивание молекул, так и дезадаптацию систем, регулирующих эти процессы. Поэтому отклонения в содержании МКА, являющихся морфорегуляторными молекулами, могут сигнализировать о вероятности неблагополучного развития беременности. Следовательно, определение их уровня в І триместре может являться прогностическим в отношении развития патологии беременности, что подтверждается и нашими результатами.
С другой стороны, децидуализация эндометрия подразумевает морфологические и фенотипические изменения клеток, вследствие чего запускается каскад событий, включающих продукцию хемокинов, привлечение лимфоцитов к месту имплантации и индукцию второй волны цитокинов с последующей экспрессией МКА и их рецепторов на клетках. Последующая инвазия трофобласта в децидуальную ткань, миометрий и его сосуды приводит к формированию плаценты и ворсин, прикрепляющих ее к внутренней стенке матки. Клетки вневорсинчатого трофобласта на ранних стадиях гестации закупоривают материнские сосуды, защищая таким образом зародыш от высокого артериального давления матери [4]. Образование групп клеток, выполняющих эту функцию, вероятно, также опосредуется МКА.
Как видно из полученных нами результатов, при физиологической беременности уровень растворимых факторов в кровотоке до ІІІ триместра практически минимален. Начиная с 27-й недели беременности концентрации всех исследованных МКА растут. Вероятно, минимальный уровень растворимых форм МКА до этого периода обусловлен функционированием охранных механизмов, препятствующих избыточной экспрессии и высвобождению в кровоток свободных (ингибиторных) форм молекул, которые, конкурируя за связь с рецептором, могут нарушить образование необходимых клеточных структур. Повышенное содержание МКА при преэклампсии, наблюдаемое, по нашим данным, во II и к началу III триместра, может отражать и формирование патологических звеньев, заключающихся в неполной инвазии цитотрофобласта в спиральные артерии, в активации эндотелия и развитии чрезмерного воспалительного ответа, выходящего из рамок локального в генерализованный процесс, и, возможно, формирование антенатальной патологии. По нашим данным, превышение в крови содержания растворимых форм МКА выше определенной пороговой концентрации может свидетельствовать о возрастании вероятности формирования задержки внутриутробного роста плода и целого ряда других перинатальных осложнений (см. табл. 3). Конечно, определение содержания МКА не является достаточным для прогноза тестом, но наряду с другими используемыми в клинике методами может быть полезным для диагностики данной патологии.
Таким образом, избыток МКА может сигнализировать о гестационных проблемах. Однако являются ли растворимые формы МКА иммунорегуляторными, сдвигающими гомеостаз в сторону патологии, имеет ли место эффект ингибирования межклеточного взаимодействия и насколько он является критическим для развития патологических реакций, какое место в переходе локальных реакций в генерализованные занимают динамические изменения в содержании растворимых МКА в крови — далеко не полный перечень вопросов, пока не решенных в иммунологии репродукции и в патогенезе преэклампсии в частности.
