Изучение этиологии мужского бесплодия имеет важное клиническое значение в связи с возрастанием его частоты при бесплодном браке и значительной долей идиопатической формы бесплодия (более 30%) [2].
Как известно, в регуляции репродуктивной функции мужчин важное значение имеют гормоны гипофиза: фолликулостимулирующий (ФСГ), лютеинизирующий (ЛГ) и пролактин. ФСГ стимулирует развитие герминативных клеток в гонадах, ЛГ действует на выработку гормонов в половых железах, пролактин потенцирует действие обоих гормонов на клетки-мишени [2]. ФСГ связывается с рецепторами клеток Сертоли и стимулирует их работу. Снижение его уровня приводит к подавлению сперматогенеза и уменьшению размеров яичек. ЛГ взаимодействует с рецепторами клеток Лейдига и необходим для синтеза андрогенов. В отсутствие ЛГ нарушается продукция тестостерона и сперматогенез. Тестостерон, помимо системного эффекта на многие типы клеток организма, оказывает действие в самом яичке на клетки Сертоли, влияя на сперматогенез.
Недавно было показано, что в яичках, предстательной железе и семенной плазме молодых мужчин содержатся α- и β- субъединицы хорионического гонадотропина человека (ХГЧ), метаболит β-субъединицы (кор-фрагмент) и гипергликозилированная форма ХГЧ в концентрациях, значительно превосходящих их физиологические уровни в сыворотке крови [4, 5]. Семенная плазма является самым богатым источником свободной α-субъединицы гонадотропинов.
В литературе описаны случаи продукции антител к ХГЧ и развития резистентности к гонадотропной
терапии у мужчин с гипогонадотропным гипогонадизмом после лечения ХГЧ [8]. Антитела к ХГЧ
перекрестно взаимодействовали с другими гликопротеиновыми гормонами: ЛГ, ФСГ и тиреотропным гормоном (ТТГ).
Известно, что α-субъединицы гонадотропинов идентичны, а также имеется высокая степень гомологии β-субъединиц: у ХГЧ и ЛГ– 85%, у ХГЧ и ФСГ – 36% [3]. Антигенные детерминанты β2–β5 ХГЧ представлены также на молекуле ЛГ. Антитела к ним ингибируют ЛГ — индуцированную продукцию тестостерона клетками Лейдига in vitro [6]. Антитела к β3, β5 и β8 ХГЧ узнают общий с ЛГ рецептор. Антитела к α4‒α6 ХГЧ полностью нейтрализуют взаимодействие рецепторов с гормонами.
В 70–90-х годах XX века проводились исследования по созданию на основе ЛГ и ФСГ контрацептивных вакцин для мужчин, применение которых индуцировало продукцию специфических антител, способных нейтрализовать биологическую активность эндогенных гормонов [7]. Позже показана возможность спонтанной продукции антител к ФСГ у мужчин с идиопатическим бесплодием [9].
Цель настоящего исследования состояла в изучении возможности продукции аутоантител к хорионическому гонадотропину человека и тестостерону у мужчин с бесплодием.
Материал и методы исследования
В основную группу включили мужчин (n=71), обратившихся в Центр в связи с нарушениями репродуктивной функции; средний возраст составлял 34,4±6,9 года, средняя продолжительность бесплодия ‒ 5,2±3,9 года. Контрольная группа была представлена 32 здоровыми мужчинами (средний возраст 32,8±4,8 года), которые имели детей, родившихся в течение последнего года, и нормальные показатели спермограммы.
Пациентам проводили клиническое и лабораторно-инструментальное обследование, включающее спермограмму, исследование секрета простаты и семенных пузырьков, медико-генетическое, вирусологическое, микробиологическое и эндокринологическое исследования, а также ультразвуковое исследование органов малого таза и щитовидной железы, биопсию яичек. Иммунологические исследования включали определение антител к ХГЧ (анти-ХГЧ), тестостерону и антиспермальных антител (АСАТ).
Анти-ХГЧ определяли по методике иммуноферментного анализа (ИФА), описанной ранее [1]. Для проведения ИФА при определении антител к тестостерону использовали полистирольные микропланшеты с иммобилизованным на поверхности лунок тестостероном, конъюгированным с бычьим сывороточным альбумином (БСА) (Sigma-Aldrich Co., США). Сыворотки крови и конъюгаты мышиных моноклональных антител (МКАТ) к иммуноглобулинам M (IgM) и G (IgG) человека с пероксидазой хрена (Sigma-Aldrich Co.) разводили соответственно 1:100, 1:2000 и 1:1000 в фосфатно-солевом буферном растворе, содержащем 0,5% твина-20 и 0,5% БСА. Инкубацию проводили на встряхивателе при 20±2ºC в течение 1 ч. Сыворотки исследовали однократно в дублях.
Для определения подклассов IgG конъюгаты МКАТ с биотином к IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4 человека (Sigma-Aldrich Co.) использовали в разведениях 1:4000, 1:15 000, 1:5000 и 1:12 000; конъюгат стрептавидина с пероксидазой хрена (Sigma-Aldrich Co.) ‒ в разведении 1:2000. Инкубацию проводили
на встряхивателе при 20±2˚С в течение 1 ч, с конъюгатом стрептавидина ‒ в течение 30 мин.
Оптическую плотность (ОП) измеряли на фотометре MULTISKAN EX [Thermo Electron (Shanghai) Instruments Co., Китай] при длине волны 450 нм. Результат ИФА считали положительным, если средняя ОП образца превышала на два стандартных отклонения и более среднюю ОП отрицательных контрольных сывороток (n=30).
Процент сперматозоидов, покрытых АСАТ, и их локализацию на поверхности сперматозоидов определяли с помощью MAR (mixed antiglobulin reaction) теста (Ferti Pro N.V., Бельгия).
Проводили сбор и статистическую обработку анамнестических, клинических и лабораторных данных с использованием пакета прикладных программ Microsoft Excel раздела «Анализ данных» подраздела «Описательная статистика», а также программы Statistiсa 6.0. Для сравнения средних величин и оценки степени достоверности различий между выборками рассчитывали критерий Стьюдента и ¢2.
Результаты исследования и обсуждение
Первичное бесплодие в анамнезе имелось у 49 (69%) мужчин основной группы, вторичное – у 22 (31%). Инфекционно-воспалительные заболевания органов половой системы отмечались у 22 (31%) пациентов, в том числе хронический простатит – у 4 (5,6%), иммунный фактор бесплодия – у 4 (5,6%), эндокринные нарушения – у 7 (9,9%), варикоцеле – у 2 (2,8%), врожденная патология – у 2 (4,2%), радиационное облучение в прошлом – у 1(1,4%), идиопатические нарушения качества спермы – у 33 (46,5%). Четыре пациента получали ранее гормональную терапию с использованием препаратов ХГЧ
и/или тестостерона.
По результатам исследования эякулята астенозооспермия наблюдалась у 9 (12,7%) пациентов, олигозооспермия ‒ у 1 (1,4%), тератозооспермия ‒ у 8(11,3%), азооспермия ‒ у 8 (11,3%), астенотератозооспермия ‒ у 25 (35,2%), олигоастенотератозооспермия ‒ у 17 (23,9%). У 7 (9,9%) пациентов была выявлена лейкоцитоспермия. У 3 мужчин были получены нормальные показатели спермограммы. У 4 мужчин отмечался положительный результат исследования на АСАТ.
В сыворотке крови у 2 пациентов был выявлен повышенный уровень ФСГ (5,7 МЕ/л при норме 1,2–5 МЕ/л), у 1 – пониженный уровень ЛГ (1,97 МЕ/л при норме 2,5–10 МЕ/л), у 1 ‒ повышенный уровень тестостерона (348,8 нмоль/л при норме 8–33 нмоль/л).
Антитела к ХГЧ были обнаружены у 29 (40,8%) пациентов с бесплодием: IgM – у 19 (26,8%), IgG ‒ у 19 (26,8%), оба изотипа – у 9 (12,7%) (см. таблицу). Частота выявления анти-ХГЧ в группе с бесплодием была статистически значимо выше, чем в контрольной группе у фертильных мужчин (у 1, или 3,1%; p=0,0002).
При изучении распределения анти-ХГЧ по подклассам IgG были обнаружены антитела всех четырех подклассов: IgG1 ‒ у 12 (63,2%), IgG2 ‒ у 3 (15,8%), IgG3 ‒ у 2 (10,5%), IgG4 ‒у 9 (47,4%) пациентов. IgG1 и IgG4 выявлялись статистически значимо чаще, чем IgG2 и IgG3 (p<0,05). Статистически значимо чаще встречалось сочетание IgG1 и IgG4 – у 6 (30%) (p=0,0443).
У пациентов с бесплодием антитела к тестостерону выявлялись статистически значимо реже (у 18, или 25,4%), чем анти-ХГЧ (p=0,0445). IgM-антитела к тестостерону были обнаружены у 8 (11,3%) и IgG-антитела – у 12 (16,9%), оба изотипа – у 2 (2,8%) пациентов (см. таблицу). Антитела обоих изотипов статистически значимо чаще встречались в группе с бесплодием, чем в контрольной группе (у 1, или 3,1%; p=0,0078).
Таблица. Результаты определения антител IgM- и IgG-изотипов к ХГЧ и тестостерону в сыворотке
крови у мужчин с бесплодием и фертильных мужчин методом ИФА.
При изучении подклассов IgG-антител к тестостерону были выявлены антитела четырех подклассов: IgG1 – у 6 (50%), IgG2 – у 2 (16,7%), IgG3 – у 3 (25%), IgG4 – у 3 (25%) пациентов. Антитела подкласса IgG1 выявлялись несколько чаще, чем другие.
Анти-ХГЧ выявлены у 12 (16,9%) обследованных, их сочетание с антителами к тестостерону – у 17 (23,9%), т.е. встречались статистически значимо чаще, чем только антитела к тестостерону [у 1 (1,4%)] (p=0,0011, p=0,0001). Наблюдалась высокая частота ассоциации антител к тестостерону с анти-ХГЧ [у 17(94,4%)]. У 2 пациентов с АСАТ выявлялись также антитела к обоим гормонам.
У пациентов с идиопатическими нарушениями качества спермы с высокой частотой выявлялись анти-ХГЧ – у 18 (54,5%) и антитела к тестостерону – у 13 (39,4%), статистически значимо чаще, чем
в контрольной группе (p<0,0007). С высокой частотой антитела к гормонам встречались у пациентов
с олигозооспермией – у 12 (66,7%), азооспермией – у 4 (50%) и астенозооспермией – у 21 (41,2%).
Из 3 пациентов с нормозооспермией у 1 были выявлены анти-ХГЧ IgM.
У пациентов с антителами к гормонам наблюдались идиопатические нарушения качества спермы – у 18 (60%), эндокринные нарушения, а именно приобретенный гипогонадотропный гипогонадизм, и применение гормональной терапии с использованием препаратов гонадотропинов и тестостерона в прошлом – у 3 (10%), инфекционно-воспалительные заболевания половых органов – у 6 (20%), иммунное бесплодие – у 2 (6,7%), сахарный диабет – у 1 (3,3%). У 2 пациентов также была бронхиальная астма, у 1 ‒ аллергия.
У 22 (73,3%) пациентов с антителами к гормонам была снижена подвижность сперматозоидов, у 12 (40%) ‒ снижено их количество, у 4 (13,3%) пациентов сперматозоиды в эякуляте отсутствовали, у 21 (70%) были нарушения морфологии сперматозоидов. Сочетания нескольких вариантов патозооспермии (олигоастенотератозооспермия, астенотератозооспермия) встречались чаще – у 17 (56,6%), чем ее отдельные варианты – у 8 (26,6%) (p=0,022) и азооспермия – у 4 (13,3%).
Таким образом, у мужчин с бесплодием продуцировались антитела к ХГЧ и тестостерону IgM- и IgG-изотипов, всех четырех подклассов IgG с преобладанием функционально активных IgG1. Антитела к гормонам были выявлены как при гипогонадотропном гипогонадизме после гормональной терапии, так и при других формах бесплодия у мужчин, не применявших гормональные препараты. Можно предположить, что у мужчин возможна как индуцированная, так и спонтанная продукция антител к гормонам.
Антитела к ХГЧ выявлялись чаще, чем к тестостерону. По-видимому, по сравнению со стероидными гормонами гонадотропины обладают более выраженными иммуногенными свойствами из-за существенных различий в их молекулярной и антигенной структуре. Так как антитела к тестостерону с высокой частотой ассоциировались с анти-ХГЧ, можно предположить наличие общих пусковых факторов и механизмов, приводящих к продукции аутоантител к гормонам, например, генетической предрасположенности, активации иммунной системы при вирусных и бактериальных инфекциях, потери периферической толерантности, структурных изменений аутоантигенов с образованием новых антигенных детерминант.
Антитела к гормонам встречались при бесплодии достоверно чаще, чем у фертильных мужчин. С высокой частотой они выявлялись при идиопатическом бесплодии, у пациентов с олигозооспермией, астенозооспермией и азооспермией. Полученные данные согласуются с данными других авторов, которые показали, что частота встречаемости антител к ФСГ при идиопатическом мужском бесплодии у пациентов с азооспермией, олигозооспермией и астенозооспермией была значительно выше, чем у пациентов с нормальной концентрацией и подвижностью сперматозоидов [9].
Ранее в экспериментах на животных было продемонстрировано, что бионейтрализация эндогенных ЛГ и ФСГ при специфической иммунизации приводила к значительному снижению уровня тестостерона (на 90%), нарушению сперматогенеза и развитию бесплодия [7]. У иммунизированных ФСГ приматов наблюдалось нарушение многих параметров качества спермы, включая снижение жизнеспособности сперматозоидов, их подвижности и способности к пенетрации слизи.
На основании экспериментальных данных и полученных нами результатов можно предположить, что анти-ХГЧ за счет перекрестного реагирования могут снижать биологическую активность сывороточных ЛГ и ФСГ, блокировать взаимодействие гормонов с рецепторами на клеткахмишенях и как следствие приводить к снижению уровня тестостерона и нарушению сперматогенеза. Антитела к тестостерону, по-видимому, могут также способствовать снижению биологической активности гормона и ослаблению его влияния на сперматогенез.
Таким образом, антитела к гонадотропинам и тестостерону могут рассматриваться как возможный этиологический фактор мужского бесплодия. Для подтверждения данной гипотезы необходимо проведение дальнейших научных исследований.
