Possibilities for increasing the effectiveness of assisted reproductive technology programs using cumulus-oocyte complex-induced sperm selection

В последние годы бесплодие становится все более распространенной и актуальной проблемой не только медицинского, но и социально-экономического характера [1]. По некоторым оценкам, бесплодие затрагивает 8–12% супружеских пар во всем мире и имеет тенденцию к увеличению. Около 15% сексуально активных пар не могут достичь беременности в течение 1 года. Длительный период времени считалось, что основной причиной бесплодия являются проблемы, связанные с репродуктивной системой женщины; однако на сегодняшний день известно, что примерно в 50% случаев оно ассоциируется с мужским фактором. К основным причинам, способствующим ухудшению фертильности у мужчин, можно отнести возраст, наличие вредных привычек, генетические и эпигенетические изменения, эндокринные и метаболические расстройства, инфекционно-воспалительные заболевания, сосудистые нарушения, воздействие химиотерапевтических препаратов и др. Однако в 30–40% случаев мужское бесплодие носит идиопатический характер. Недостаточная фертильность у мужчин, как правило, проявляется отклонениями в параметрах эякулята – уменьшением концентрации сперматозоидов, снижением их подвижности и резким ухудшением их морфологических характеристик [1–4].

К трем основным стратегиям лечения бесплодия относятся фармакологическая терапия, хирургическое лечение (в основном эндоскопия) и вспомогательные репродуктивные технологии (ВРТ). Непрерывное совершенствование последних в значительной степени позволяет расширить возможности в лечении различных форм бесплодия [5].

В современных условиях интрацитоплазматическая инъекция сперматозоида в ооцит (ИКСИ) стала наиболее востребованным методом ВРТ для преодоления мужского бесплодия. Метод ИКСИ обычно используется в случаях тяжелой олиго-, астено- и тератозооспермии. Одной из основных задач, стоящих перед эмбриологом, выполняющим процедуру ИКСИ, является отбор сперматозоида, имеющего нормальную морфологию и подвижность. Несмотря на то что рутинные методы обработки эякулята и морфологические критерии селекции сперматозоида для ИКСИ позволяют снизить риск использования аномального сперматозоида, все же ИКСИ обходит естественные барьеры, препятствующие проникновению аномальных сперматозоидов в ооцит, что может влиять на частоту оплодотворения и качество эмбрионов. Таким образом, выбор сперматозоидов наилучшего качества имеет решающее значение для улучшения результативности оплодотворения в случае ИКСИ [6, 7].

Существуют различные методы, которые используются для отбора сперматозоидов при проведении ИКСИ [6, 7]. Среди них можно выделить метод ПИКСИ (физиологическая интрацитоплазматическая инъекция сперматозоида), основанный на связывании сперматозоидов с гиалуроновой кислотой (ГК) и, таким образом, имитирующий селекцию мужских половых клеток, как при естественном оплодотворении [6, 8, 9]. Ряд исследований подтверждает, что ГК, выступающая в роли «физиологического селектора», способствует отбору наилучших сперматозоидов с более качественными характеристиками. Также одним из альтернативных методов селекции сперматозоидов является анализ морфологии сперматозоида при сверхвысоком увеличении (более чем в 6000 раз) – ИМСИ (интрацитоплазматическая инъекция сперматозоида после селекции по морфологическим критериям), позволяющий оценить 6 клеточных структур: акросому, постакросомную пластинку, шейку, хвост, митохондрии и ядро. Несмотря на то что данный метод используется в практике и является усовершенствованным вариантом ИКСИ, в практической медицине возникает все больше противоречивой информации относительно показаний к его проведению и эффективности наступления беременности и/или родов живым плодом. Так, в работе K. Knez et al. [10] было показано, что частота наступления беременности у пациенток из группы ИМСИ выше, чем при проведении стандартного ИКСИ [10]. Согласно E. Mangoli et al. [11], ИМСИ не является методом выбора и должно проводиться только после нескольких неудачных попыток стандартного ИКСИ [11].

Вышеописанные методы ВРТ широко используются в мировой практике, однако они имеют свои отрицательные стороны. Естественный отбор наилучших сперматозоидов заменяется выбором эмбриолога, основанным на морфологических критериях и подвижности. Такой отбор не отражает целостность генома сперматозоидов и не исключает наличие разного рода патологий, что в большей степени обосновывает важность разработки методов селекции сперматозоидов, которые были бы максимально приближены к естественным условиям зачатия [12]. По данным современных исследований, отбор сперматозоидов с помощью ооцит-кумулюсных комплексов (ОКК) может способствовать увеличению числа имплантаций и наступления беременности у определенных групп пациентов [11].

Значение ооцит-кумулюсных комплексов в процессе естественного оплодотворения

ОКК представляет собой сложную структуру, состоящую из женской половой клетки, кумулюсных клеток и их внеклеточного матрикса. При естественном оплодотворении только сперматозоиды с наилучшими характеристиками могут пройти через ОКК и в последующем проникнуть через зону пеллюцида и оплодотворить яйцеклетку. Присутствующий внеклеточный матрикс ОКК является сложноорганизованной структурой и образован полимеризованной ГК, которая синтезируется клетками кумулюса в ответ на выброс лютеинизирующего гормона.

Кумулюсные клетки играют важную роль в достижении ооцитами цитоплазматического созревания, а также в транспорте продуктов метаболизма между ооцитом и тканью яичника [13]. Исследования указывают на то, что клетки кумулюса координируют созревание ооцитов с развитием фолликулов, стимулируют гликолиз, аминокислотный транспорт и биосинтез стеролов [14–16]. Профилирование экспрессии генов кумулюсных клеток поможет выявить биомаркеры для прогноза развития эмбриона. Взаимодействие ооцита с кумулюсом осуществляется посредством рецепторов GDF9 и BMP15; их ключевая роль в регуляции овуляции установлена сначала у мышей, затем подтверждена у овец и человека [17–19].

На этапах физиологического отбора сперматозоидов в женском репродуктивном тракте одним из ключевых факторов их селекции является способность связываться с ГК, которая представляет собой кислый мукополисахарид, входящий в состав различных тканей и биологических жидкостей человеческого организма, а также являющийся основным компонентом ОКК. Рецепторы к ГК (CD44, CD168) присутствуют на мембране сперматозоида, что обеспечивает его прикрепление к блестящей оболочке ооцита [20]. Считается, что только головка зрелого сперматозоида несет на себе специфические рецепторы, которые позволяют им связываться с ГК.

Эффективность селекции сперматозоидов с помощью ооцит-кумулюсных комплексов в программах лечения бесплодия методами вспомогательных репродуктивных технологий

Несмотря на то что физиологическая роль ОКК изучена недостаточно, различные исследования подтверждают его влияние на процесс оплодотворения и частоту бластуляции в программах ВРТ [21–24]. Например, в нескольких научных работах было показано, что сперматозоиды, способные проникать через ОКК, имеют лучшую морфологию (сформированная акросома, неутолщенная шейка, длинный жгутик, отсутствие цитоплазматических капель на поверхности мембраны клетки), вступают в большее число акросомальных реакций, имеют лучшие потенции к капацитации. Отобранные таким образом мужские половые клетки имеют более высокую зона-связывающую способность и более высокую целостность хроматина [23–25].

Так, в исследовании C. Wang et al. [6], целью которого было изучение эффективности физиологического отбора сперматозоидов с помощью ОКК для ИКСИ, авторами было проанализировано 857 ооцитов на стадии МII, которые были поделены для оплодотворения на 2 группы: с использованием ОКК-ИКСИ (n=429) и стандартного ИКСИ (n=428). Частота оплодотворения яйцеклеток методом ОКК-ИКСИ была выше, чем в группе стандартного ИКСИ (85,31% против 74,77%; р<0,05). По частоте развития эмбрионов 3-х суток без фрагментации между ОКК-ИКСИ и стандартным ИКСИ статистически значимых различий выявлено не было (63,23% против 58,92%; р>0,05) Однако на 5-е сутки в группе ОКК-ИКСИ была отмечена большая частота формирования бластоцист (46,52% против 38,85%; р<0,05), в том числе бластоцист отличного качества, пригодных для переноса в полость матки и криоконсервации (38,72% против 24,20%; р<0,05), по сравнению с группой обычного ИКСИ [23]. Таким образом, авторы показали, что использование ОКК для отбора сперматозоидов для ИКСИ оказалось эффективным и привело к статистически значимому улучшению развития и качества бластоцист.

В исследовании D.R. Franken et al. [26] также было изучено взаимодействие кумулюсных клеток со сперматозоидами человека. Оценивали акросомальную реакцию, морфологию, связывающую способность и целостность хроматина. Используя ранее описанную модель ОКК, авторы учитывали конкретные функциональные аспекты сперматозоидов, которые пересекают ОКК (основная группа). Контрольные сперматозоиды содержались в аналогичных экспериментальных условиях только в питательной среде. Результаты показали, что кумулюсные клетки влияют на функциональные особенности сперматозоидов. Средний процент морфологически нормальных сперматозоидов в контрольной выборке составил 6,9%, в то время как сперматозоиды, прошедшие ОКК, имели значительно более высокий процент нормальных форм (в среднем 9,5%; р≤0,01). Также было выявлено снижение процента сперматозоидов с деконденсированным хроматином (CMA3-положительных) при сравнении контрольной популяции (49,1%) с основной группой (38,4%), (р≤0,05). Кроме того, у большего количества сперматозоидов основной группы была выявлена акросомальная реакция – 23% против 11% в группе контроля и более высокие зона-связывающая способность и целостность хроматина (61% против 47%) (р≤0,01) по группам соответственно [26].

В 2004 г. S.J. Hong et al. [27] показали, что сперматозоиды, способные проникать через ОКК, имеют более высокие параметры движения, такие как средняя скорость обычного пути, средняя скорость поступательного движения, средняя амплитуда боковых наклонов головки, прямолинейность и др. по сравнению с контрольной группой [27]. Полученные данные также были подтверждены и другими авторами [26, 28].

В некоторых работах было продемонстрировано, что внеклеточный матрикс ОКК оказывает непосредственное влияние на сперматозоиды, увеличивая созревание их мембран, подвижность и целостность ДНК. Предположительно, такие изменения характера подвижности сперматозоидов могут возникать в результате механического сопротивления из-за специфической вязкой среды ОКК [29]. Однако в литературе представлены немногочисленные и противоречивые результаты, касающиеся данного вопроса. В некоторых работах сообщалось, что характеристики ОКК не могут вызывать определенные паттерны подвижности сперматозоидов, поскольку сперматозоиды могут свободно плавать в культуральной среде [26, 30–32]. Таким образом, конкретный механизм действия ОКК остается дискуссионным и нуждается в дальнейшем изучении.

Заключение

На сегодняшний день в современной научной литературе представлены немногочисленные данные, касающиеся эффективности селекции сперматозоидов с помощью ОКК. Несмотря на это, в ряде исследований отмечен положительный эффект использования метода отбора сперматозоидов с помощью ОКК на улучшение эмбриологического этапа программ лечения бесплодия методом ЭКО. Данная технология может улучшить существующую технику ИКСИ, тем самым увеличив эффективность программ лечения бесплодия методами ВРТ, особенно у пациентов с выраженным мужским фактором бесплодия. Кроме того, данная методика приближена к естественному процессу селекции сперматозоидов и в меньшей степени зависит от субъективного решения клинического эмбриолога, основанного только на оценке параметров и подвижности сперматозоидов. Кроме того, селекция мужских половых клеток на основе ОКК не повышает частоту потенциальных рисков для пациентов и не увеличивает частоту прогнозируемых осложнений. Учитывая результаты проведенных исследований, можно сделать вывод о высокой перспективности использования такого метода, в результате которого процедура оплодотворения ИКСИ, вероятно, станет еще более совершенной, что позволит повысить частоту наступления клинической беременности.