Революционное развитие так называемых «омиксных» технологий в последние годы привело к кардинальным изменениям в экспериментальной биологии, биоинформатике и медицине. Появилась возможность беспрецедентного анализа и обработки колоссальных массивов данных, включая полномасштабный мониторинг пациентов в клинических исследованиях, усовершенствованы технологии разработки вакцин и лекарственных препаратов, методики прогнозирования и ранней диагностики сложных гетерогенных патологических состояний и заболеваний. Значительно расширены и перспективы биомедицины, в частности, в отношении разработки персонализированных подходов к профилактике и лечению заболеваний у каждого конкретного пациента, что, несомненно, повлияет на качество и продолжительность жизни.
«Омиксными» называют технологии, которые основаны на достижениях геномики, транскриптомики, протеомики, метаболомики, липидомики и других наук, которые изучают структуру генома и пути реализации генетической информации, то есть, по сути, являются важнейшим инструментом геномных и постгеномных исследований.
Первой из всех омиксных наук получила развитие геномика, позволяющая сегодня довольно быстро проанализировать весь геном человека, выявить дефекты определенных генов, разработать терапевтические стратегии коррекции конкретного звена метаболизма. Однако многое зависит не столько от наличия мутации какого-либо гена, сколько от уровня его активности. Кроме того, развитие большинства заболеваний связано с активностью не одного, а многих генов, в связи с чем, требуется их совокупная оценка. Но что более важно – необходимо выявить особенности функционирования генома в конкретных условиях, что является предметом изучения постгеномных технологий. Этапы реализации генетической информации изучают такие науки, как транскриптомика и протеомика.
Протеомика посвящена высокопроизводительному количественному и качественному анализу белков, которые экспрессируются в клетке, ткани или организме в целом в данный момент времени, а также их посттрансляционных модификаций [1–3]. Протеомика объективно сложнее геномики, поскольку протеом – совокупность белков – продуктов экспрессии генома – чрезвычайно разнообразен и крайне изменчив. Идентификация аномально экспрессирующихся белков и их количественная оценка имеют огромное значение в диагностике, прогнозировании и лечении различных заболеваний. Однако в настоящее время определение протеомного профиля сложных биологических образцов имеет пока только научную направленность.
Транскриптомика сегодня – одна из самых быстро развивающихся областей знаний, также позволяющая получить информацию о функциональной активности генома. Транскриптомом является совокупность всех транскриптов, синтезируемых одной клеткой или группой клеток, включая мРНК и, так называемые некодирующие РНК. Транскриптом отражает профиль экспрессии генов в данный момент времени и, в отличие от генома, активно меняется в зависимости от внешних условий и потребностей органа, окружающих тканей и организма в целом. При этом транскриптом промежуточен между статичностью генома и динамичностью, чрезвычайным многообразием протеома. Такое положение транскриптома делает его удобным инструментом для изучения механизмов реализации генетической информации, адаптации клетки к условиям среды, а также путей взаимодействия этих механизмов.
В последние годы к транскриптомным технологиям приковано особое внимание ученых всего мира. Они нашли широкое применение в различных областях биомедицины, в частности, в прогнозировании, диагностике и профилировании заболеваний, поскольку геномные регуляторные элементы играют важную роль в их патогенезе [4–6].
В настоящее время происходит стремительное накопление геномных, транскриптомных, протеомных и метаболомных данных, характеризующих действительно индивидуальные особенности организма. Знание этих особенностей позволит быстрее и точнее поставить диагноз, назначить таргетную, наиболее эффективную, терапию, предложить пациенту не обобщенные, а обусловленные конкретным геномом рекомендации по профилактике или реабилитации после болезни.
Подобное развитие «омиксных» технологий позволяет говорить о наступлении эры персонализированной медицины. При этом полногеномное секвенирование – основа персонализированного подхода к каждому пациенту. В рамках данной статьи мы акцентировали внимание на современных возможностях транскриптомики в изучении акушерских осложнений, и особенно, преэклампсии. Полногеномное профилирование, к примеру, транскриптома плаценты, обеспечивает беспристрастный подход к изучению нормальной физиологии беременности и патофизиологии ее осложнений, в том числе плацентарных синдромов (невынашивание беременности, преждевременные роды, преэклампсия, задержка роста плода) [7].
Для получения полногеномных профилей транскриптов плаценты используются два метода: микрочипирование (ChIP-seq) и секвенирование РНК (RNA-seq). Технология ChIP-seq заключается в использовании чипов, содержащих тысячи образцов нуклеиновых кислот, связанных с жидким или твердым субстратом (с предметными стеклами для микроскопии или тонкослойными силиконовыми носителями). ChIP-seq включает в себя гибридизацию олигонуклеотидных зондов со специфическими последовательностями РНК или ДНК, присутствующими в образце, что позволяет одновременно проводить количественный анализ множества транскриптов [5, 8].
RNA-seq является более новым и прогрессивным методом исследования. Он имеет более высокую чувствительность, чем обычные микроматрицы, и дает максимально полную картину транскриптома той или иной ткани. Секвенирование может обнаруживать редкие транскрипты РНК, идентифицировать однонуклеотидные варианты как в кодирующей, так и в некодирующей РНК любой длины и не зависит от вида. Кроме того, развитие микрофлюидных технологий с секвенированием РНК единичных клеток позволяет определять транскрипты конкретных интересующих нас клеток, что ранее было невозможно.
Учитывая огромный потенциал RNA-seq, неудивительно, что его использование в научных исследованиях растет экспоненциально, поскольку оно является наиболее эффективным инструментом исследования транскриптома, позволяющим понять молекулярные механизмы патологического течения беременности, выявить наиболее точные диагностические и прогностические биомаркеры [9]. Особенно возросла популярность РНК-Seq после разработки технологии Illumina/Solexa, которая дала возможность одновременного секвенирования миллиарда транскриптов, что позволило проводить количественную оценку и сравнительный анализ транскриптома разных тканей в норме и при развитии патологических состояний [5].
Методы транскриптомики позволяют одновременно проводить эксперименты с множеством образцов с получением колоссального объема данных; поэтому для систематизации результатов требуется их серьезная обработка вычислительными методами с применением различных биоинформационных программ [10]. Конечным итогом секвенирования являются полногеномные транскрипционные карты, включающие качественные и/или количественные характеристики экспрессии каждого гена [8].
Из всех плацентарных синдромов, развивающихся на фоне аномальной плацентации, предметом наших научных исследований является преэклампсия, в связи с чем данному осложнению беременности хотелось бы уделить особое внимание. Обсуждаемые в статье широкомасштабные исследования, несомненно, актуальны и в отношении преэклампсии, частота которой у беременных составляет 2–8% [11, 12]. В современных условиях ее течение характеризуется атипичностью, полисиндромальностью, часто – внезапным быстрым прогрессированием симптомов, отсутствием четкой этапности развития, что является основой недооценки степени тяжести, поздней диагностики и запоздалого родоразрешения. Поражение органов и тканей матери при этом носит полиорганный/полисистемный характер, с возможным развитием острой почечной недостаточности, отека легких, синдрома диссеминированного внутрисосудистого свертывания, ишемического или геморрагического инсульта, эклампсии, HELLP-синдрома, преждевременной отслойки плаценты, антенатальной смерти плода и других тяжелых осложнений.
Анализ неонатальных исходов при преэклампсии свидетельствует о высокой частоте рождения гипотрофичных и недоношенных детей, повышенном риске развития респираторных, гематологических нарушений (анемия, полицитемия и тромбоцитопения новорожденных), внутричерепных кровоизлияний, некротизирующего энтероколита, инфекционных осложнений, что часто диктует необходимость наблюдения и лечения ребенка в отделениях интенсивной терапии, последующего перевода в детские больницы на второй этап выхаживания [13].
Одним из важнейших мероприятий в снижении неблагоприятных исходов беременности является прогнозирование преэклампсии. Однако, несмотря на многочисленные международные исследования, практическое акушерство по-прежнему не имеет высокочувствительных и специфичных прогностических и диагностических биомаркеров ее развития, что во многом объясняется отсутствием понимания всего спектра патофизиологических механизмов возникновения, развития и прогрессирования преэклампсии.
Современное представление о преэклампсии ограничено рамками существующих концепций, что является закономерным при классическом подходе к научным исследованиям: первоначально разрабатывается концепция, а далее изучаются факторы, ей соответствующие. При этом «омиксные» технологии, в том числе транскриптомика, позволяют пойти другим путем: сначала проводится широкомасштабное сравнительное исследование, выявление дифференциальных различий между здоровыми и беременными с преэклампсией с последующим обоснованием той или иной концепции, планированием дальнейших этапов исследований.
Одна из теорий возникновения и развития преэклампсии предполагает нарушение процесса плацентации на фоне недостаточности инвазии цитотрофобласта в стенку матки, отсутствия ремоделирования спиральных и радиальных артерий, что приводит к неадекватному кровоснабжению плаценты. Нарушения структуры и функций цитотрофобласта и синцитиотрофобласта, начиная с самых ранних сроков беременности, лежат в основе осложненного течения беременности и неблагоприятных исходов как для матери, так и для плода [14].
Анализ плацентарного транскриптома имеет решающее значение для расширения знаний о нормальном развитии и функционировании плаценты, позволяет учесть возможное влияние пола плода на профиль экспрессии генов, является незаменимым инструментом изучения основных патофизиологических механизмов развития плацентарных нарушений. Транскриптом плаценты занимает 7-е место по сложности среди 50 тканей человека [15].
Клетки трофобласта уникальны для плаценты, в связи с чем их транскриптомное профилирование в масштабе всего генома особенно оправдано. Синцитиотрофобласт образуется в результате дифференцировки и слияния клеток поверхностного цитотрофобласта и обеспечивает многообразие функций плаценты [16]. В ходе этого процесса происходят потеря одних и приобретение других клеточных функций, в частности экспрессия специфических для плаценты или преимущественно синтезируемых в ней молекул (пептидных и стероидных гормонов, структурных и иммунных белков, ферментов, факторов транскрипции и др.) [17].
Экспериментальные исследования показали, что в процессе структурной и функциональной дифференцировки цитотрофобласта происходит изменение экспрессии генов, по сути – перепрограммирование его транскриптома [18]. Так, общими результатами анализа транскриптов плаценты I триместра является обнаружение высокой экспрессии генов клеточной пролиферации и регуляции клеточного цикла, что отражает быстрый рост плаценты на ранних сроках гестации. Сопоставление данных транскриптома с гистологическим исследованием в III триместре позволило идентифицировать маркеры нормального созревания ворсин плаценты [19, 20]. Wang B. et al. опубликовали результаты полногеномного исследования культуры клеток цитотрофобласта ворсин плаценты, где авторы идентифицировали несколько подмножеств генов, составляющих ключевые сигнальные пути, участвующие в инициации родов [21]. Перечисленные данные подтверждают факт «перепрограммирования» плаценты с изменением профиля экспрессии генов, направленным на развитие и прогрессирование беременности, подготовку к родам и индукцию родовой деятельности.
Поскольку плацента состоит из множества различных типов клеток, в настоящее время разработаны методики глобального профилирования изолированных единичных клеток – секвенирование РНК клеток с помощью микрофлюидных технологий. Так впервые были установлены профили экспрессии клеточно-специфических генов материнско-плодового интерфейса на протяжении всей беременности [7].
Другой целью анализа транскриптома плаценты является изучение регуляции экспрессии генов и ее вариабельности в различных клетках одной плаценты и между разными пациентками. Исследования показали значимые вариации, обусловленные генотипическими, внутривидовыми, этническими различиями, а также полом плода. Одним из ключевых открытий является тот факт, что клетки трофобласта имеют специфичные полу плода паттерны экспрессии. Выявлено, что плацентарный транскриптом при плоде мужского плода характеризуется провоспалительным профилем, что отчасти может объяснить несколько более неблагоприятные исходы в данной ситуации [22].
В настоящее время описано довольно много факторов, регулирующих транскрипцию [23]. Обнаружено, что уникальная транскриптомная активность цитотрофобласта частично регулируется цАМФ через протеинкиназу А или фактор обмена Epac, а также через другие киназные пути. Выявлено, что индукция и дальнейшая дифференцировка цитотрофобласта контролиру.тся эпидермальным фактором роста и хорионическим гонадотропином [24–26]. Изучено множество факторов транскрипции, участвующих в этом процессе [27–29].
Транскриптомные исследования при преэклампсии выявили нарушения регуляции экспрессии и функции многих белков, преимущественно синтезируемых плацентой, разнонаправленные изменения факторов транскрипции, а также сигнальных и киназных путей, особенно выраженные при ранней и тяжелой преэклампсии [30]. К настоящему времени выявлено почти 1500 дифференциально экспрессируемых генов при преэклампсии, участвующих в таких процессах, как регуляция артериального давления, апоптоз, рост и развитие плода, секреция гормонов, метаболизм, гомеостаз и передача сигналов. Из этого числа генов большая часть – это гены-регуляторы транскрипции, меньшая – гены, преимущественно экспрессируемые плацентой [7].
Поскольку плацента играет центральную роль в развитии преэклампсии, изучение патофизиологических механизмов и молекулярных особенностей изменений плацентарной ткани является фундаментальным для понимания возникновения и развития преэклампсии [30]. Поиск связанных геномных областей с наблюдаемыми транскриптомными изменениями плаценты является одним из основных направлений поиска маркеров и предикторов развития преэклампсии. В современных работах проводились попытки идентификации различных аллелей экспрессируемых генов плацентарного происхождения, поскольку именно они играют важную роль в функциональной активности плаценты и ответственны за развитие осложнений беременности.
Как показано, все клетки в составе плаценты имеют свой уникальный профиль активных генов, участвующих в различных биологических процессах. Так, транскриптомный анализ плацентарной ткани при преэклампсии (на микрочипах), проведенный Louwen F.et al., позволил авторам получить довольно противоречивые данные в отношении дифференциальной экспрессии генов, участвующих в регуляции тонуса сосудов, воспалении, пролиферации клеток, апоптозе, дифференцировке и клеточном метаболизме [31]. Эти различия могли быть обусловлены не только разной степенью тяжести преэклампсии, но и разным соматическим статусом пациенток, особенностью сбора образцов ткани, способом их транспортировки, платформ микрочипов, качеством статистического анализа и другими факторами.
Одно из первых исследований, в котором проведено RNA-seq для изучения дифференциальной экспрессии генов в плацентарной ткани при преэклампсии, опубликовано группой финских ученых в 2015 г. [32]. Идентификация генов с измененной экспрессией в ткани плаценты позволила значительно расширить наши представления о молекулярных механизмах развития преэклампсия. Так, авторами выявлены множественные иммунологические нарушения (как врожденного, так и приобретенного иммунитета); изменения, сходные с аутоиммунными заболеваниями, такими как ревматоидный артрит и системная красная волчанка; выраженный дисбаланс во многих процессах, связанных с развитием тканей и гомеостазом (гибель клеток, пролиферация, ангиогенез, миграция и передача сигналов и др.).
В одном из самых ранних исследований Founds S.A. et al. проанализировали полученные при биопсии образцы ворсин хориона в первом триместре и обнаружили дисрегуляцию генов, участвующих в иммуномодуляции, воспалении и миграции клеток [33]. Нарушения были выявлены за несколько месяцев до клинических проявлений преэклампсии, тем самым, подчеркивая ключевую роль плаценты и гораздо более раннее начало развития данного осложнения беременности.
Во многих работах, посвященных преэклампсии, описано нарушение регуляции экспрессии генов, участвующих в окислительном стрессе и воспалении [17, 32, 34–36].
Учитывая тот факт, что децидуальная оболочка в норме поддерживает иммунологическую толерантность организма матери к полуаллогенному плоду, большим коллективом отечественных авторов изучен широкий спектр фенотипа децидуальных макрофагов у пациенток с преэклампсией, по сравнению с контрольной группой. Результаты исследования свидетельствуют о развитии «цитокинового шторма» в группе беременных с тяжелой преэклампсией, требующих экстренного родоразрешения в связи с тяжестью состояния женщины или плода. В целом, авторами выявлен провоспалительный паттерн в децидуальной оболочке у пациенток с ранней преэклампсией, преобладание клеток CX3CR+, CD86+ среди децидуальных макрофагов, подавление активности сигнального пути трансформирующего фактора роста-β и сопутствующее снижение макрофагов «противовоспалительного фенотипа» [35].
Интересен тот факт, что продукты аномальной экспрессии генов вневорсинчатых клеток трофобласта, которые были идентифицированы в ходе первых работ по секвенированию РНК единичных клеток при преэклампсии, также обнаруживались и в материнском кровотоке, в связи с чем они могут быть потенциальными неинвазивными маркерами аномальной функции плаценты (так называемая, liquid biopsy) [37].
В совокупности эти исследования свидетельствуют о том, что при преэклампсии имеют место множественные изменения молекулярных механизмов и функций клеток как материнского, так и эмбрионального/плодового происхождения, тем самым подчеркивая сложность патофизиологии этого осложнения беременности. И все же благодаря омиксным технологиям, по-видимому, в ближайшем будущем существует возможность использования дифференциально экспрессируемых генов в качестве хороших биомаркеров.
Дисрегуляция экспрессии генов, вовлеченных в сигнальные пути роста плаценты, митохондриального дыхания и гипоксической реакции, наблюдалась в многочисленных исследованиях и при задержке роста плода [38, 39]. В нескольких исследованиях продемонстрировано много общего между преэклампсией и нормотензивной задержкой роста плода, в частности, изменение экспрессии генов, участвующих в молекулярных механизмах плацентарного ангиогенеза и иммунной регуляции.
Опубликованные исследования свидетельствуют о наличии общих патогенетических механизмов развития преэклампсии и сердечно-сосудистых заболеваний (окклюзионные изменения артерий, атерогенез, атеросклероз, поражение сосудов, артериальная гипертензия, окислительный стресс) [32, 40]. Sitras V. et al. провели сравнительный анализ транскриптома плаценты при преэклампсии с транскриптомом крови женщин с сердечно-сосудистыми заболеваниями и выявили между ними множественные совпадения [41]. Исследование подчеркивает наличие общих взаимосвязей перенесенной во время беременности преэклампсии с последующим состоянием здоровья матери и ее ребенка.
В этом отношении интересны исследования, посвященные изучению, так называемого, плацентарного программирования здоровья ребенка после рождения и в долгосрочной перспективе. Гипотеза «внутриутробного происхождения здоровья и болезней», сформулированная Barker D. еще в прошлом веке, основана на том, что особенности внутриутробного развития определяют предрасположенность человека к заболеваниям в более позднем возрасте; при этом ключевую роль в росте и развитии плода, возможно, играет плацента. Эта гипотеза нашла подтверждение как в более ранних, так и последующих исследованиях; в частности получены данные о риске развития сердечно-сосудистых заболеваний, ожирения, диабета 2 типа, остеопороза, хронической обструктивной болезни легких и депрессии [42, 43].
В 2018 г. группа авторов впервые продемонстрировала наличие ассоциаций между генетическими вариантами, изменениями транскриптома плаценты и риском постнатальных заболеваний (в частности, детского ожирения) [43]. Таким образом, анализ транскриптомного профиля плаценты может дать ценную информацию о риске тех или иных заболеваний, позволит провести ранний скрининг и своевременно спланировать профилактические мероприятия.
Как известно, в настоящее время принято выделять раннюю и позднюю преэклампсию со сроком манифестации клинических симптомов до 34 недель и после. Патогенетическими предпосылками развития ранней преэклампсии считаются плацентарные нарушения, позднюю же связывают с материнскими факторами. Однако, согласно недавним исследованиям, эти представления подвергаются сомнению: вероятно, что это вопрос степени и времени плацентарного повреждения и индивидуальной чувствительности матери на фоне генетической предрасположенности к сердечно-сосудистым заболеваниям. Транскриптомный анализ плаценты показал множественные общие пути развития как ранней, так и поздней преэклампсии [15]. В то же время в недавнем исследовании Ren Z. et al. идентифицировали два функционально различных набора генов с нарушением регуляции при тяжелой ранней и тяжелой поздней преэклампсии, что свидетельствует о разных молекулярных механизмах их развития [44]. Требуется масштабный анализ с применением других «омических» методов, чтобы понять общие и различные пути, ведущие к одному клиническому результату.
Исследований, посвященных анализу транскриптома цельной крови у беременных с преэклампсией, гораздо меньше. По-видимому, это объясняется сложностью определения тканевой специфичности плацентарных продуктов экспрессии генов, циркулирующих в периферическом кровотоке. Одно из недавних таких исследований Yadama A.P. et al. свидетельствует о том, что изменение транскриптома крови происходит уже на доклинической стадии преэклампсии [45].
Для изучения материнских факторов возникновения и развития преэклампсии группой зарубежных авторов проведен полногеномный анализ транскриптома крови беременных, который показал ассоциированные с преэклампсией множественные изменения паттернов экспрессии материнских генов в мононуклеарных клетках периферической крови [46]. Идентифицировано в общей сложности 368 генов с дифференциальной экспрессией в этих клетках у женщин с преэклампсией по сравнению со здоровыми беременными; при этом транскриптом крови пациенток с тяжелой и умеренной преэклампсией также значимо отличается. Авторами описаны изменения экспрессии множества генов, играющих центральную роль в ряде биологических функций организма (процессы пролиферации клеток и апоптоза, иммунологические реакции, воспаление, ангиогенез, регуляция артериального давления и др.).
Высокопроизводительное секвенирование и последующий анализ дифференциальной экспрессии генов при преэклампсии все же не позволяет полностью оценить функциональную активность всего генома. В связи с чем в последние годы широко используется анализ так называемых «генных сетей», который дает возможность рассматривать гены в совокупности взаимодействий кодируемых ими белковых продуктов, выявлять наиболее активные гены, которые можно рассматривать в качестве потенциальных предикторов преэклампсии.
Отечественными авторами был проведен полногеномный анализ экспрессии генов в образцах плацентарной ткани, полученных от пациенток с преэклампсией и с физиологическим течением беременности. Авторы идентифицировали 86 генов, ассоциированных с развитием преэклампсии, а также выявили четыре гена (IFIH1, IFI44L, IFI44, CXCL10), которые могут стать потенциальными биомаркерами преэклампсии, но их практическая значимость также должна быть экспериментально подтверждена в последующих исследованиях [47].
Заключение
Профилирование плацентарного транскриптома, а также его интегративный анализ с другими «омиксными» технологиями (геном, протеом, метаболом, метилом) представляет собой огромный потенциал для расширения знаний о физиологическом развитии и функционировании плаценты, выявления основных причинно-следственных механизмов развития плацентарных синдромов, а также для прогнозирования и улучшения материнских и перинатальных исходов при осложненном течении беременности.
Подобный комплексный научный подход в перспективе должен внести весомый вклад в разработку более эффективных профилактических и лечебных мероприятий, направленных на коррекцию тех или иных патофизиологических звеньев, специфичных или сопутствующих конкретной патологии или осложнению беременности.
Перспективным направлением «омиксных» технологий, и в частности транскриптомики, является разработка каталога плацентарных биомаркеров, позволяющих прогнозировать будущее здоровье потомства, выявлять новорожденных с высоким риском заболеваний в их последующей жизни, своевременно планировать профилактические и терапевтические стратегии в соответствии с прогнозируемой патологией.
