Role of pronase hatching in enhancing the effectiveness of assisted reproductive technology programs

Dolgushina N.V., Ibragimova E.O., Romanov A.Yu., Makarova N.P., Dovgan A.A., Syrkasheva A.G., Kalinina E.A.

1 Research Center of Obstetrics, Gynecology, and Perinatology, Ministry of Health of Russia, Moscow 117997, Ac. Oparina str. 4, Russia; 2 I.M. Sechenov First Moscow State Medical University, Ministry of Health of Russia, Moscow 117997, Trubetskaya str. 8, Russia
Background. Hatching from the zona pellucida is one of the most important stages of human preimplantation embryo development and spontaneous hatching inability is one of the causes of implantation failure in assisted reproductive technology (ART) cycles. The use of mechanical integrity disorders or complete destruction of the zona pellucida (assisted hatching) can be an effective way to enhance the effectiveness of infertility treatment programs using ART techniques.
Objective. To assess the results of ART programs depending on the performance and type of assisted hatching.
Material and methods. The prospective cohort investigation enrolled 309 patients treated for infertility with in vitro fertilization (IVF). According to the type and performance of assisted blastocyst hatching, the patients were divided into 3 groups: 1) 106 patients undergoing laser hatching with partial removal of the zona pellucida; 2) 103 patients having pronase hatching with complete removal of the zona pellucida; 3) 100 patients with no assisted blastocyst hatching. The degree of maturity and the quality of oocytes and embryos were assessed; hatching was monitored using light microscopy.
Results. The pregnancy rates were noted to be statistically higher in Group 1 than in Groups 2 and 3; the multiple pregnancy rates were significantly lower in Group 1.
Conclusion. Complete zona pellucida removal is a new approach to assisted hatching, in which, firstly, there is no mechanical separation of the cells forming the embryo, and, secondly, there is a rapid contact with endometrial cells during implantation. This contributes to the reduction of the risk of monozygotic pregnancies during the transfer of one morphologically normal blastocyst, by enhancing the effectiveness of ART programs.

Keywords

in vitro fertilization
assisted reproductive technologies
blastocyst hatching
zona pellucida

Преимплантационные эмбрионы человека ранних стадий развития окружены оболочкой, которая носит название блестящей оболочки (от англ. – zona pellucida – ZP) [1]. В процессе имплантации эмбрион человека внутри полости матки должен освободиться от ZP, чтобы клетки трофэктодермы (ТФЭ) вступили в непосредственный контакт с люминальным эпителием эндометрия. Выход эмбриона из ZP обозначается термином хетчинг (от англ. hatching – «вылупление») [2]. По имеющимся данным, 50–75% всех морфологически нормальных бластоцист человека не способны к самостоятельному выходу из ZP [3]. Отсутствие спонтанного хетчинга является одной из причин неудачи имплантации [4]. При затруднении спонтанного хетчинга, а также по ряду других показаний (поздний репродуктивный возраст пациентки, множественные неудачные попытки ЭКО в анамнезе, аномалии ZP, бластоцисты низкого качества, и др.) выполняется процедура вспомогательного хетчинга бластоцист [5].

Наибольшее распространение в практике программ вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) получили методы частичного удаления ZP: механический, химический [6] и лазерный хетчинг [4, 7]. При данных методах оболочка частично надсекается в случайном месте, и бластоциста выходит из ZP самостоятельно, затрачивая на это время. Кроме того, данные методы вспомогательного хетчинга несут риск разрыва клеток эмбриобласта, что может способствовать формированию многоплодных беременностей [8].

Принципиально новым подходом к вспомогательному хетчингу является технология проназного (ферментативного) хетчинга. Преимуществами данного метода является полное удаление ZP, что экономит время бластоцисты на вылупление и не приводит к механическому разделению клеток, формирующих эмбрион. Это позволяет проводить профилактику монозиготных беременностей в программах ВРТ при переносе одной морфологически нормальной бластоцисты [9].

Согласно имеющимся на сегодняшний день данным, новая эмбриологическая технология полного удаления ZP может способствовать увеличению частоты наступления беременности в программах ВРТ. Бластоциста без ZP сразу после ее переноса в полость матки контактирует с клетками эндометрия в период имплантации, что способствует успешному наступлению беременности.

Материал и методы исследования

В проспективное когортное исследование были включены пациентки без противопоказаний и развития осложнений в ходе проведения программ ВРТ. На основании вида и наличия вспомогательного хетчинга бластоцист пациентки были разделены на 3 группы. Группу 1 составили 106 пациенток с проведением лазерного хетчинга с частичным удалением ZP; группу 2 – 103 пациентки с проведением проназного хетчинга с полным удалением ZP, группу 3 – 100 пациенток без проведения вспомогательного хетчинга бластоцист.

Стимуляция функции яичников у всех пациенток проводилась, как было описано ранее [10], с применением рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона (рФСГ) или комбинированного препарата рФСГ и лютеинизирующего гормона (ЛГ), и назначением антагонистов гонадотропин рилизинг-гормона (ГнРГ). Триггер овуляции вводился при наличии лидирующих фолликулов диаметром 17 мм и более. В качестве триггера использовался человеческий хорионический гонадотропин, при риске развития синдрома гиперстимуляции яичников – агонист ГнРГ. Трансвагинальная пункция яичников осуществлялась через 36 часов после введения триггера овуляции.

Полученные ооциты отмывали от фолликулярной жидкости и крови и инкубировали в культуральной среде в течение 2–3 часов, после чего производили денудирование ооцитов. Оценку степени зрелости, качества ооцитов и эмбрионов, толщины ZP и мониторинг хетчинга проводили при помощи световой микроскопии (Nikon TE 300, общее увеличение х400). Лазерный хетчинг бластоцист проводили с помощью системы лазерной диссекции (инфракрасный лазер) Zilos-tk (Hamilton Thorne, Англия), формировали отверстие диаметром 10–14 мкм через всю ZP непосредственно перед переносом эмбриона в полость матки. Ферментативный хетчинг проводили при помощи фермента проназа Е (40 МЕ/мл, ЗАО «Протеинсинтез», Россия), растворение оболочки наблюдали под микроскопом, после чего отмывали эмбрион в культуральной среде с последующим переносом в полость матки.

Перенос эмбрионов в полость матки осуществлялся на 5-е сутки культивирования. В полость матки переносили один эмбрион наилучшего качества. Морфологическую оценку эмбрионов проводили через 120–122 часа (на 5-е сутки) культивирования (после оплодотворения). Учитывались морфологические характеристики эмбрионов по классификации Гарднера (степень зрелости бластоцист, качество внутриклеточной массы (ВКМ) и качество ТФЭ).

Поддержка лютеиновой фазы индуцированного цикла у всех пациенток проводилась по стандартному протоколу с назначением натурального микронизированного прогестерона интравагинально в дозе 600 мг в сутки после трансвагинальной пункци яичников. Если в качестве триггера овуляции был использован агонист ГнРГ, или сочетание агониста ГнРГ с хорионическим гонадотропином в дозе 1500 МЕ, для поддержки лютеиновой фазы назначался эстрадиола валерат в дозе 6 мг в сутки. При наличии подъема уровня бета – субъединицы сывороточного хорионического гонадотропина через 14 дней после переноса эмбрионов в полость матки регистрировалась биохимическая беременность, а при визуализации плодного яйца в полости матки через 21 день после переноса эмбриона – клиническая беременность.

Перед включением в протокол ЭКО пациентки были обследованы согласно приказу Минздрава России от 30.08.2012 №107н «О порядке использования вспомогательных репродуктивных технологий, противопоказаниях и ограничениях к их применению» [11].

Для статистического анализа использовался пакет статистических программ Statistica 10 (США). Статистический анализ проводился с применением χ2-теста для сравнения частотных показателей и теста Крускала–Уаллиса для сравнения непрерывных величин, а также многофакторного регрессионного анализа (логистической регрессии) для расчета отношения шансов (ОШ) с 95% доверительным интервалом (95% ДИ) исходов программ ВРТ. Корреляционный анализ проводился с использованием непараметрического корреляционного критерия Спирмена. Различия между статистическими величинами считали статистически значимыми при уровне достоверности p<0,05.

Исследование было одобрено комиссией по этике ФГБУ НЦАГиП им. Кулакова Минздрава России.

Результаты исследования

При анализе клинико-анамнестических данных, как возможных конфаундеров, было отмечено, что в группу 1 были включены пациентки более старшего возраста (р=0,0303) с более низким уровнем антимюллерова гормона (АМГ) (р=0,0007), в группу 2 было включено меньше курящих пациенток (р=0,0029). Пациентки группы 3 чаще страдали гипотиреозом (р=0,0344). Также отмечалось, что у партнеров пациенток групп 1 и 2 чаще отмечалась тератозооспермия (ТЗС), а у партнеров пациенток группы 3 – сочетание ТЗС и астенозооспермии (АЗС) (р=0,0054). При стимуляции суперовуляции у пациенток группы 2 чаще использовались препараты рФСГ (р<0,0001), а у пациенток группы 3 в качестве триггера овуляции чаще применялись препараты агониста ГнРГ (р<0,0001). Интрацитоплазматическую инъекцию сперматозоида в ооцит (ИКСИ) проводили в 100% наблюдений у пациенток в группе 2 и в 68 и 58% в группах 1 и 3, соответственно (р<0,0001). Показатели эмбриогенеза (число полученных бластоцист и бластоцист отличного качества) были лучше в группе 3 (р<0,001) (таблица).

Доля биохимической беременности не различалась в группах сравнения, тогда как доля клинической беременности была выше в группе 2 пациенток (р=0,0292). Также во группе 2 отмечалась значимо более низкая доля многоплодных беременностей (р=0,0348). Число самопроизвольных выкидышей и живорождений также было выше в группе проназного хетчинга, но не было статистически значимо (рисунок).

При оценке факторов, отличающихся в группах сравнения, как возможных конфаундеров, было выявлено, что ни один из них не влиял, ни на наступление беременности, ни на многоплодие. Поэтому ОШ клинической беременности в группе проназного хетчинга по сравнению с отсутствием хетчинга составило 1,9 (95% ДИ=1,01;3,6). ОШ клинической беременности в группе проназного хетчинга по сравнению с проведением лазерного хетчинга также составило 1,9 (95% ДИ=1,02;3,5).

Многоплодие при проведении лазерного хетчинга по сравнению с отсутствием хетчинга наблюдалось в 2,7 раза чаще, а по сравнению с проведением проназного хетчинга – в 5,6 раза чаще (р=0,0348).

Обсуждение

Вспомогательный хетчинг – дополнительная эмбриологическая методика, которая представляет собой искусственное разрушение ZP. Данная методика была разработана с целью повышения частоты имплантации эмбриона. До сих пор в литературе недостаточно данных для выбора лучшего метода вспомогательного хетчинга в клинической практике.

По данных Кохрановского обзора, применение вспомогательного хетчинга значимо увеличивает частоту наступления клинической беременности (ОШ=1,13, 95% ДИ 1,01; 1,27) [12]. Однако отсутствуют убедительные данные о влиянии вспомогательного хетчинга на частоту живорождения (прежде всего вследствие того, что в качестве конечной точки оценивается наступление беременности, а не родов), а также о влиянии различных методик хетчинга на исходы ВРТ. По данным различных исследователей, вспомогательный хетчинг с использованием различных методов дает аналогичную частоту имплантации и наступления беременности [9, 13]. Однако в нашем исследовании частота наступления клинической беременности была выше в группе пациенток с проведением проназного хетчинга (р=0,0292). Эти данные не только согласуются с данными литературы о положительном влиянии проведения процедуры вспомогательного хетчинга на уровень наступления беременности [5], но и свидетельствуют о преимуществе полного ферментативного удаления ZP.

Особое внимание заслуживают полученные данные о влиянии вспомогательного хетчинга на развитие монохориальной многоплодной беременности. Монохориальная многоплодная беременность является опасным осложнением гестационного периода, ассоциированным с повышенным риском перинатальной заболеваемости и смертности [12]. Некоторые исследователи отмечают повышенный риск развития монохориальной многоплодной беременности при применении ВРТ в целом, а также при оплодотворении методом ИКСИ, или при проведении вспомогательного хетчинга с частичной диссекцией ZP [8, 14].

Однако роль вспомогательного хетчинга в развитии монозиготной беременности в программах ВРТ является недоказанной. В нашем исследовании в группе проведения проназного хетчинга отмечалась значимо более низкая доля многоплодных беременностей, в то время как при проведении лазерного хетчинга частота развития многоплодной беременности была максимальной, что согласуются с имеющимися литературными данными [15, 16]. Это подтверждает предположение о роли нарушения целостности ZP в формировании монозиготных двоен в программах ВРТ [8] и позволяет рекомендовать проназный хетчинг, как приоритетный метод вспомогательного хетчинга.

Заключение

Технология полного удаления блестящей оболочки является новым подходом к вспомогательному хетчингу, при котором, во-первых, не происходит механического разделения клеток, формирующих эмбрион, а, во-вторых, формируется быстрый контакт с клетками эндометрия в период имплантации. Это будет способствовать не только повышению эффективности программ ВРТ, но и снижению частоты осложнений беременности, связанных с многоплодием. Необходимы дальнейшие исследования для определения показаний к проведению вспомогательного хетчинга и уточнения его влияния на уровень живорождения.

Supplementary Materials

  1. Table. Clinical and laboratory parameters in the observation groups
  2. Figure. Outcomes of ART programs in the observation groups, p <0.05 *

References

1. Ковальская Е.В., Сыркашева А.Г., Романов А.Ю., Макарова Н.П., Долгушина Н.В. Современные представления о компактизации эмбрионов человека в условиях in vitro. Технологии живых систем. 2017; 14(1): 25-35. [Kovalskaya E.V., Syirkasheva A.G., Romanov A.Yu., Makarova N.P., Dolgushina N.V. Modern ideas about the compaction of human embryos in vitro. Tehnologii zhivyih sistem. 2017; 14(1): 25-35. (in Russian)]

2. Шафеи Р.А., Сыркашева А.Г., Романов А.Ю., Макарова Н.П., Долгушина Н.В., Семенова М.Л. Хетчинг бластоцисты у человека. Онтогенез. 2017; 48(1): 8-20. [Shafei R.A., Syrkasheva A.G., Romanov A.Yu., Makarova N.P., Dolgushina N.V., Semenova M.L. Hatching blastocyst in human. Ontogenez. 2017; 48(1): 8-20. (in Russian)]

3. Гоголевский П.А. Вспомогательный хэтчинг: показания, применение, результаты (обзор литературы). Проблемы репродукции. 1998; 1: 10-3. [Gogolevskiy P.A. Auxiliary hatching: indications, application, results (literature review). Problemyi reproduktsii. 1998; 1: 10-3. (in Russian)]

4. Ибрагимова Э.О., Долгушина Н.В., Сыркашева А.Г., Романов А.Ю., Языкова О.И., Макарова Н.П. Роль вспомогательного хетчинга в программах лечения бесплодия методами вспомогательных репродуктивных технологий: обзор литературы. Гинекология. 2016; 18(2): 44-7. [Ibragimova E.O., Dolgushina N.V., Syirkasheva A.G., Romanov A.Yu., Yazyikova O.I., Makarova N.P. The role of auxiliary hatching in infertility treatment programs using assisted reproductive technologies: a literature review. Ginekologiya. 2016; 18(2): 44-7. (in Russian)]

7. Carney S.K., Das S., Blake D., Farquhar C., Seif M.W., Nelson L. Assisted hatching on assisted conception (in vitro fertilisation (IVF) and intracytoplasmic sperm injection (ICSI). Cochrane Database Syst. Rev. 2012; (12): CD001894. doi: 10.1002/14651858.CD001894.pub5.

8. Cohen J., Elsner C., Kort H., Malter H., Massey J., Mayer M.P., Wiemer K. Impairment of the hatching process following IVF in the human and improvement of implantation by assisting hatching using micromanipulation. Hum. Reprod. 1990; 5(1): 7-13.

9. Tadir Y., Douglas-Hamilton D.H. Laser effects in the manipulation of human eggs and embryos for in vitro fertilization. Methods Cell Biol. 2007; 82: 409-31. doi: 10.1016/S0091-679X(06)82014-5.

10. Schieve L.A., Meikle S.F., Peterson H.B., Jeng G., Burnett N.M., Wilcox L.S. Does assisted hatching pose a risk for monozygotic twinning in pregnancies conceived through in vitro fertilization? Fertil. Steril. 2000; 74(2): 288-94. doi: 10.1016/S0015-0282(00)00602-6.

11. Balaban B., Urman B., Alatas C., Mercan R., Mumcu A., Isiklar A. A comparison of four different techniques of assisted hatching. Hum. Reprod. 2002; 17(5):1239-43.

12. Сыркашева А.Г., Казакова В.В., Долгушина Н.В., Романов А.Ю., Андреева М.Г., Яроцкая Е.Л. Реализация программ вспомогательных репродуктивных технологий у пациенток с агрегатами гладкого эндоплазматического ретикулума в цитоплазме ооцитов. Акушерство и гинекология. 2016; 7: 54-9. doi: 10.18565/aig.2016.7.54-59 [Syrkasheva A.G., Kazakova V.V., Dolgushina N.V., Romanov A.Yu., Andreeva M.G., Yarotskaya E.L. Implementation of assisted reproductive technology programs in patients with smooth endoplasmic reticulum aggregates in the cytoplasm of oocytes. Akusherstvo i ginekologiya/Obstetrics and Gynecology. 2016; (7): 54-59. (in Russian) http://dx.doi.org/10.18565/aig.2016.7.54-59]

13. Приказ Минздрава России от 30.08.2012 N 107н (ред. от 11.06.2015) “О порядке использования вспомогательных репродуктивных технологий, противопоказаниях и ограничениях к их применению.” [Order of the Ministry of Health of Russia from 30.08.2012 N 107n (redaction from 11.06.2015) “On the order of using auxiliary reproductive technologies, contraindications and limitations to their use.” (in Russian)]

14. Carney S., Das S., Blake D., Farquhar C., Seif M., Nelson L. Assisted hatching on assisted conception ( in vitro fertilisation ( IVF ) and intracytoplasmic sperm injection ( ICSI ). Cochrane Database Syst. Rev. 2013; (12): CD001894. doi: 10.1002/14651858.CD001894.pub5.

15. Feng H.L., Hershlag A., Scholl G.M., Cohen M.A. A retroprospective study comparing three different assisted hatching techniques. Fertil. Steril. 2009; 91(4, Suppl.): 1323-5. doi: 10.1016/j.fertnstert.2008.02.133.

16. Vitthala S., Gelbaya T., Brison D.R., Fitzgerald C.T., Nardo L.G. The risk of monozygotic twins after assisted reproductive technology: a systematic review and meta-analysis. Hum. Reprod. Update. 2009; 15(1): 45-55. doi: 10.1093/humupd/dmn045.

17. Luke B., Brown M., Wantman E., Stern J. Factors associated with monozygosity in assisted reproductive technology pregnancies and the risk of recurrence using linked cycles. Fertil. Seril. 2014; 101(3): 683-9.

18. Bissonnette F., Cohen J., Collins J., Cowan L., Dale S., Dill S. et al. Incidence and complications of multiple gestation in Canada: proceedings of an expert meeting. Reprod. Biomed. Online. 2007; 14(6): 773-90. doi: 10.1016/S1472-6483(10)60681-5.

Received 09.06.2017

Accepted 23.06.2017

About the Authors

Dolgushina Nataliya Vitalievna, M.D., Ph.D., M.P.H., Head of R&D Department, Research Center of Obstetrics, Gynecology and Perinatology, Ministry of Health of Russia. 117997, Russia, Moscow, Ac. Oparina str. 4. Tel.: +74954384977. E-mail: n_dolgushina@oparina4.ru
Ibragimova Espet Omarbekovna, PhD student of ART Department, Research Center of Obstetrics, Gynecology and Perinatology, Ministry of Health of Russia.
117997, Russia, Moscow, Ac. Oparina str. 4. Tel.: +74954382501. E-mail: Espet2007@yandex.ru
Romanov Andrey Yurievich, clinical resident, Research Center of Obstetrics, Gynecology and Perinatology, Ministry of Health of Russia.
117997, Russia, Moscow, Ac. Oparina str. 4. Tel.: +79031589400. E-mail: romanov1553@yandex.ru
Makarova Nataliya Petrovna, PhD, Researcher of ART Department, Research Center of Obstetrics, Gynecology and Perinatology, Ministry of Health of Russia.
117997, Russia, Moscow, Ac. Oparina str. 4. E-mail: np_makarova@oparina4.ru
Dovgan Alina Anatolievna, postgraduate I.M. Sechenov 1st Moscow State Medical University. 117997, Russia, Moscow, Trubetskaya str. 8. E-mail: lina.dongan@gmail.com
Syrkasheva Anastasia Grigorievna, M.D., Ph.D., Researcher of the Department of assistive reproductive technology in the treatment of infertility, Research Center
of Obstetrics, Gynecology and Perinatology, Ministry of Health of Russia. 117997, Russia, Moscow, Ac. Oparina str. 4. E-mail: a_syrkasheva@oparina4.ru
Kalinina Elena Anatolievna, M.D., Ph.D., Head of Department of assistive technologies in infertility treatment, Research Center of Obstetrics, Gynecology and Perinatology, Ministry of Health of Russia. 117997, Russia, Moscow, Ac. Oparina str. 4. E-mail: e_kalinina@oparina4.ru

For citations: Dolgushina N.V., Ibragimova E.O., Romanov A.Yu., Makarova N.P., Dovgan A.A., Syrkasheva A.G., Kalinina E.A. Role of pronase hatching in enhancing
the effectiveness of assisted reproductive technology programs.
Akusherstvo i Ginekologiya/Obstetrics and Gynecology. 2018; (3): 70-4. (in Russian)
https://dx.doi.org/10.18565/aig.2018.3.70-74

Similar Articles

By continuing to use our site, you consent to the processing of cookies that ensure the proper functioning of the site.