Role of mitochondrial DAMPs in the manifestation of hypertensive complications of pregnancy

Skovorodina T.V., Vishnyakova P.A., Tsvirkun D.V., Shmakov R.G., Vysokikh M.Yu.

Research Center of Obstetrics, Gynecology, and Perinatology, Ministry of Health of Russia, Moscow 117997, Ac. Oparina str. 4, Russia
Objective. To comparatively analyze the level of the mitochondrial proteins TFAM, OPA1, and VDAC1 as possible damage-associated molecular patterns (DAMPs) in the microvesicular fraction from the plasma of pregnant women with preeclampsia (PE), chronic/gestational hypertension and that of healthy pregnant women.
Material and methods. The microvesicular fraction was obtained from the plasma of patients by differential centrifugation. The levels of TFAM, OPA1, and VDAC1 were determined by chemiluminescent western blotting.
Results. The severe PE group was found to have a significant increase in the expression level of ОРА1-L and pre-TFAM proteins and a correlation with the level of proteinuria as an important diagnostic marker for PE.
Conclusion. The ОРА1-L and pre-TFAM proteins can lay claim to being PE-associated DAMPs.
It is necessary to perform further investigations of the association between certain DAMPs and the development of PE.

Keywords

preeclampsia
markers
damage-associated molecular patterns
oxidative stress

Частота гестационных гипертензивных расстройств составляет 10% всех беременностей. Ежегодно во всем мире более пятидесяти тысяч женщин погибают в период беременности из-за осложнений, связанных с артериальной гипертензией (АГ). Распространенность таких симптомов, как АГ, отеки, протеинурия среди беременных в Российской Федерации в 2015 году составила 6,91% [1].

Клиницисты выделяют две формы преэклампсии (ПЭ): ранняя и поздняя ПЭ, которые различаются тяжестью течения и исходами для матери и плода [2].

Если при тяжелой поздней ПЭ тактика определена и сводится к незамедлительному родоразрешению, то при раннем течении ПЭ вопрос возможности пролонгирования беременности остается весьма дискуссионным. Для прогнозирования гипертензивных осложнений изучаются предикторы ПЭ, такие как про- и антиангиогенные факторы: эндоглин, плацентарный фактор роста (PlGF), sFlt-1 (растворимая fms-подобная тирозинкиназа 1) [3].

В контексте маркеров и предикторов ПЭ на данный момент остаются неизученными новые иммунологические активаторы, обладающие выраженным провоспалительным действием – митохондриальные молекулы, ассоциированные с повреждением (МАСП), циркулирующие в фетоплацентарном кровотоке, и предположительно влияющие на степень тяжести АГ и ПЭ во время беременности [4].

Митохондрии – это двумембранные органеллы, которые являются энергетическими станциями клетки. Митохондриом клетки является динамичной структурой: слияние и фрагментация митохондрий происходит под воздействием внешних и внутренних сигналов, что помогает поддерживать адекватную их функциональную активность. Из потенциальных митохондриальных МАСП белок ОРА1 является важнейшим участником множества процессов не только в митохондриях, но и в клетке в целом. Главной его функцией является реализация слияния внутренних митохондриальных мембран. Кроме этого, ОРА1 участвует в защите клетки от апоптоза, в регуляции уровня кальция и даже взаимодействии с митохондриальной ДНК (мтДНК) [5–7]. ОРА1 состоит из двух доменов: трансмембранного и внешнего, обращенного в межмембранное пространство митохондрий. При изменении внешних условий или активации внутриклеточного сигналинга может происходить расщепление цельной формы ОРА1 (которую принято обозначать OPA1-L) с образованием водорастворимой короткой формы – OPA1-S. Доказано, что превалирование последней свидетельствует об усилении слияния фрагментации митохондрий, в то время как увеличение содержания OPA1 L-формы говорит об их слиянии. Фрагментация митохондрий часто является следствием ответа на внешние и внутренние сигналы – гипоксию, окислительный стресс – и предшествует элиминации митохондрий [8]. Отношение OPA1-L к OPA1-S является индексом, отражающим превалирование одного из этих процессов.

Другим митохондриальным белком в данной работе является TFAM, важнейший участник репликации и транскрипции мтДНК. В клетке различают две формы белка TFAM: цитоплазматическую (pre-TFAM) и митохондриальную (TFAM). Цитоплазматическая форма является предшествующей зрелой митохондриальной форме, которая выступает функционирующим белком и центральной фигурой молекулярной машинерии митохондрий. После импорта через внешнюю и внутреннюю митохондриальные мембраны происходит образование зрелой формы TFAM. Далее белок оказывается вовлеченным в поддержание структуры мтДНК – привлечение факторов транскрипции и митохондриальной РНК-полимеразы для последующей транскрипции, а также регуляции копийности мтДНК, что особенно важно для поддержания адекватного уровня функциональной активности митохондрий.

Изучение экспрессии митохондриальных белков (ОРА1, VDAC, TFAM) во фракции микровезикул из плазмы крови женщин с синдромами ПЭ и хронической/гестационной АГ поможет не только в поисках прогностических маркеров данных патологий, но и в осознании фундаментальных механизмов течения этих заболеваний.

Материал и методы исследования

Все беременные женщины были разделены на 4 группы – без гипертензивных нарушений (I группа – контроль, n=25), с хронической/гестационной АГ (II группа, n=16), умеренной ПЭ (III группа, n=9) и тяжелой ПЭ (IV группа, n=8). Оценивались анамнестические данные и корреляции лабораторных показателей.

Нами был проведен сравнительный анализ количественного и качественного (TFAM, OPA1, VDAC1) состава митохондриальных белков, возможных МАСП, из плазмы пациенток с ПЭ и хронической/гестационной АГ, а также здоровых женщин. Исследовались также стандартные показатели, такие как печеночные ферменты, лактатдегидрогеназа, креатинин, количество лейкоцитов, а также специфические маркеры, характерные для т.н. «больших акушерских синдромов» – PlGF, sFlt-1.

Для выделения микровезикул венозную кровь центрифугировали при 3000 g в течение 15 минут, плазму отбирали и центрифугировали 30 минут на скорости 10000 g. Осадок ресуспендировали в фосфатном буфере и повторно центрифугировался при тех же условиях. Далее к осадку добавляли буфер для нанесения образцов на гель.

В качестве возможных МАСП при изучении состава микровезикул из плазмы пациенток были выбраны митохондриальные белки ОРА1 (2 формы: ОРА1-L и ОРА1-S), TFAM, а также его цитоплазматический предшественник – pre-TFAM. Исследование проводилось методом Вестерн-блот анализа с дальнейшей детекцией хемилюминесценции, как описано в нашей ранней работе [9]. Нормирование сигнала изучаемых белков проводили на сигнал мажорного белка митохондриальной мембраны – VDAC1. Данные представлены в виде среднего ± стандартная ошибка среднего. Статистический анализ проводили в программе Prism 7.0 (Graph Pad, США) и Statistica 6.0 (StatSoft, США) с использованием теста Колмогорова–Смирнова, теста Манна–Уитни и корреляционного анализа по Пирсону. Различие между группами считали статистически достоверным при уровне значимости p<0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

Тяжелая форма ПЭ развилась у 6 повторно беременных и у 2 первобеременных. В группах с хронической/гестационной АГ, умеренной ПЭ различий в связи с паритетом родов не наблюдалось (хроническая/гестационная АГ развилась у 6 повторно беременных женщин, умеренная ПЭ – у 4 повторно беременных из 9).

Часто встречающимся осложнением беременности была анемия беременных, которая зарегистрирована во всех группах с примерно одинаковой частотой: у 9 женщин (36%) в I группе, у 7 женщин (43%) во II группе, у 5 (55%) женщин во III группе и у 3 (37,5%) женщины в IV группе.

Нарушение ремоделирования спиральных артерий и плацентации вследствие недостаточной инвазии трофобласта приводит к возникновению генерализованной эндотелиальной дисфункции. Вследствие гипоксии плаценты происходит избыточное высвобождение антиангиогенных белков в материнский кровоток, усиливается процесс апоптотической гибели клеток плаценты, что, в свою очередь, приводит к повышению уровней печеночных ферментов, щелочной фосфатазы, лактатдегидрогеназы в кровотоке женщин с тяжелой ПЭ (6 случаев (75%)), тогда как в остальных группах в большинстве случаев эти показатели не превышали нормативных значений. Также в исследуемых группах, помимо гипертензионных осложнений, встречался и синдром задержки роста плода (СЗРП) – в 25% случаев (n=4) в группе с хронической/гестационной АГ, в 11% случаев (n=1) в группе с умеренной ПЭ, и в 37,5% случаев (n=3) в группе с тяжелой ПЭ. В контрольной группе СЗРП не выявился.

При ПЭ повышенный синтез sFlt-1 приводит к снижению уровня свободно циркулирующего PlGF. В норме плацента продуцирует малые количества PlGF и его антагониста sFlt-1, и тем не менее, в контрольной группе в 8 случаях (32%) было отмечено незначительное увеличение соотношения sFlt-1/PLGF, что, однако, не сопровождалось развитием гипертензивных осложнений во время беременности. В группе с хронической/гестационной АГ выявлено 2 случая (12,5%) увеличения соотношения sFlt-1/PLGF, в группе с умеренной ПЭ – 6 случаев (66,6%), в группе с тяжелой ПЭ – 6 случаев (75%).

Нами была обнаружена положительная статистически значимая корреляция sFlt-1/PLGF и уровня печеночных ферментов (аланинаминотрансфераза, аспартатаминотрансфераза) у всех пациенток исследуемых групп: коэффициент корреляции составил r=0,94 (по Пирсону) при р=0,0001, а также корреляция sFlt-1/PLGF и уровня креатинина при рассмотрении всех пациенток исследуемых групп: коэффициент корреляции составил r=0.65 (по Пирсону) при р=0,009.

В ходе исследования микровезикулярной фракции, полученной из плазмы крови женщин, мы обнаружили, что экспрессия короткой формы ОРА1-S не имела достоверных отличий во всех группах (рис. 1А). При анализе цельной формы ОРА1-L были обнаружены статистически значимые различия в содержании белка OPA1-L у пациенток с тяжелой ПЭ: уровень OPA1-L в данной группе возрастает четырехкратно по сравнению с контрольной и другими группами (рис. 1А). Это свидетельствует о том, что в микровезикулы оказываются включены митохондрии, которые, возможно, являются частью развитой цельной митохондриальной сети. Это может быть сигналом, как о состоянии плаценты, так и о возможных осложнениях со стороны плода.

Интересно, что при анализе отношение ОРА1-L к ОРА1-S (рис. 1В) мы получили значимое снижение данного индекса в группе тяжелой ПЭ, что говорит о превалировании процесса слияния митохондрий над фрагментаций во фракции микровезикул плазмы крови. Это подтверждает нашу гипотезу о включении в микровезикулы активно объединяющихся митохондрий. В группе тяжелой ПЭ наблюдалось повышение экспрессии обеих форм белка TFAM по сравнению с контрольной группой, однако различия не были не достоверны (рис. 1С).

Группой исследователей из Китая в 2015 году была выдвинута гипотеза о том, что митохондриальные МАСП могут вызвать повреждение почек и протеинурию из-за своей способности стимулировать иммунные клетки для выработки цитокинов, которые способны повреждать клеточные структуры ткани почек. Цитокины могут индуцировать повреждения гломерулярных эндотелиальных клеток, что приводит к увеличению проницаемости клубочков и вызывает протеинурию. Известно, что цитокины обладают повреждающей способностью в отношении подоцитов, что также приводит к появлению белка в моче [10].

Нами была подтверждена положительная статистически значимая корреляция содержания белка pre-TFAM, который является цитоплазматическим предшественником митохондриального TFAM, и уровня протеинурии при рассмотрении всех пациенток из исследуемых групп: коэффициент корреляции составил r=0,3 (по Пирсону) при р=0,009 (рис. 2). Таким образом, учитывая важность протеинурии при диагностике ПЭ, можно сделать вывод, что определение содержания pre-TFAM в микровезикулах плазмы крови может стать диагностически значимым при лечении тяжелой ПЭ.

Достоверное повышение ОРА1-L и pre-TFAM в группе пациенток с тяжелой ПЭ дает основание отнести данные молекулы к группе МАСП, ассоциированных с ПЭ, что открывает возможности дальнейшего изучения патогенеза ПЭ.

Supplementary Materials

  1. Fig . 1. Level of relative expression of OPA 1- L and OPA 1- S (A), pre-TFAM and TFAM (C) in microvesicles from the plasma of women in the control group, the group with severe preeclampsia , with moderate preeclampsia and chronic / gestational hypertension according Western - Blot - analysis. When calculating expression, the protein signal was normalized to the signal of the mitochondrial protein VDAC 1. The data are presented as the mean ± standard error of the mean. * p <0.05
  2. Fig . 2. Correlation curve, reflecting the dependence of the level of relative expression of pre - TFAM and proteinuria indices. The Pearson correlation coefficient r = 0 , 3 for p = 0 , 009

References

1. Основные показатели здоровья матери и ребенка, деятельность службы охраны детства и родовспоможения в Российской Федерации. М.: ФГБУ “ЦНИИОИЗ” Минздрава Российской Федерации; 2015. 175с. [The main indicators of maternal and child health, the activities of the child welfare service and obstetrics in the Russian Federation. Moscow: FGBU “TSNIIOIZ” of the Ministry of Health of the Russian Federation; 2015. 175p. (in Russian)]

2. Ходжаева З.С., Коган Е.А., Клименченко Н.И., Акатьева А.С., Сафонова А.Д., Холин А.М., Вавина О.В., Сухих Г.Т. Клинико-патогенетические особенности ранней и поздней преэклампсии. Акушерство и гинекология. 2015; 1: 12-7. [Khodzhaeva Z.S., Kogan E.A., Klimenchenko N.I., Akatyeva A.S., Kholin A.M., Vavina O.V., Sukhikh G.T. Clinical and pathogenetic features of early and late preeclampsia. Akusherstvo i Ginekologiya/Obstetrics and Gynecology. 2015; (1): 12-7. (in Russian)]

3. De Oliveira L., Peraçoli J.C., Peraçoli M.T., Korkes H., Zampieri G., Moron A.F., Sass N. .sFlt-1/PlGF ratio as a prognostic marker of adverse outcomes in women with early-onset preeclampsia. Pregnancy Hypertens. 2013; 3(3): 191-5.

4. McCarthy C.M., Kenny L.C. Immunostimulatory role of mitochondrial DAMPs: alarming for pre-eclampsia? Am. J. Reprod. Immunol. 2016; 76(5): 341-7.

5. Fülöp L., Szanda G., Enyedi B., Várnai P., Spät A. The effect of OPA1 on mitochondrial Ca2+ signaling. PLoS One. 2011; 6 (9): e25199.

6. Landes T., Leroy I., Bertholet A., Diot A., Khosrobakhsh F., Daloyau M. et al. OPA1 (dys)functions. Semin. Cell Dev. Biol. 2010; 21(6): 593-8.

7. Elachouri G., Vidoni S., Zanna C., Pattyn A., Boukhaddaoui H., Gaget K. et al. OPA1 links human mitochondrial genome maintenance to mtDNA replication and distribution. Genome Res. 2011; 21(1): 12-20.

8. Benard G., Karbowski M. Mitochondrial fusion and division: Regulation and role in cell viability. Semin. Cell Dev. Biol. 2009; 20(3): 365-74.

9. Вишнякова П.А., Тарасова Н.В., Володина М.А., Марей М.В., Ходжаева З.С., Кан Н.Е., Высоких М.Ю. Эпителиально-мезенхимальный переход в плаценте при преэклампсии. Акушерство и гинекология. 2016; 12: 53-7. http://dx.doi.org/10.18565/aig.2016.12.53-7 [Vishnyakova P.A., Tarasova N.V., Volodina M.A., Marei M.V., Khodzhaeva Z.S., Kan N.E., Vysokikh M.Yu. Placental epithelial-mesenchymal transition in preeclampsia. Akusherstvo i Ginekologiya/Obstetrics and Gynecology. 2016; (12): 53-7. (in Russian) https://dx.doi.org/10.18565/aig.2016.12.53-57]

10. He J., Lu Y., Xia H., Liang Y., Wang X., Bao W. et al. Circulating mitochondrial DAMPs are not effective inducers of proteinuria and kidney injury in rodents. PLoS One. 2015; 10(4): e0124469.

Received 09.06.2017

Accepted 23.06.2017

About the Authors

Skovorodina Tatyana Vyacheslavovna, Ph.D., Research Center of Obstetrics, Gynecology, and Perinatology, Ministry of Health of the Russia.
117997, Russia, Moscow, Ac. Oparina str. 4. E-mail: t_skovorodina@oparina4.ru
Vishnyakova Polina A., researcher at the Laboratory of mitochondrial medicine, Research Center of Obstetrics, Gynecology, and Perinatology,
Ministry of Health of the Russia. 117997, Russia, Moscow, Ac. Oparina str. 4. E-mail: vpa2002@mail.ru
Tsvirkun Darya Viktorovna, PhD, Researcher of mitochondrial medicine research group, Research Center of Obstetrics, Gynecology and Perinatology.
117997, Russia, Moscow, Ac. Oparin str. 4. E-mail: darunyat@gmail.com
Shmakov Roman G., chief physician, Research Center of Obstetrics, Gynecology, and Perinatology, Ministry of Health of Russia.
117997, Russia, Moscow Ac. Oparina str. 4. Tel.: +79255859171. E-mail: r_shmakov@oparina4.ru
Vysokikh Mikhail Yu., PhD, Head of mitochondrial medicine research group, Research Center of Obstetrics, Gynecology, and Perinatology,
Ministry of Health of the Russia. 117997, Russia, Moscow, Ac. Oparina str. 4. E-mail: m_vysokikh@oparina4.ru

For citations: Skovorodina T.V., Vishnyakova P.A., Tsvirkun D.V., Shmakov R.G., Vysokikh M.Yu. Role of mitochondrial DAMPs in the manifestation of hypertensive complications of pregnancy. Akusherstvo i Ginekologiya/Obstetrics and Gynecology. 2017; (12): 84-8. (in Russian)
https://dx.doi.org/10.18565/aig.2017.12.84-88

Similar Articles

By continuing to use our site, you consent to the processing of cookies that ensure the proper functioning of the site.