Эпигенетический механизм
Эпигенетический механизм относится как к наследственным, так и к потенциально обратимым механизмам генома, являясь фундаментальным аспектом генной регуляции ДНК. Существуют 2 типа данной регуляции в зависимости от действия на ДНК и хроматин: активирующие хроматин (усиливают генную экспрессию) и дезактивирующие (подавляют экспрессию). Метилирование нуклеотида с цитозином, комплементарным гуанину (ЦпГ-метилирование), и метилирование аденина (ЦпА-метилирование) являются единственными механизмами эпигенетического действия на ДНК. ЦпГ-метилирование генов-промоутеров и регуляторных элементов негативно влияют на генную экспрессию через выработку белковых репрессивных комплексов и специфических модификаций гистонов [1]. Синтезирование ковалентных модификаций к гистонам является более сложной формой эпигенетических процессов. Классифицируют данный процесс: по типу (метилирование, фосфорилирование, ацетилирование, а также убиквитинация), позиции (в том числе лизин 4, 9, 27 и 36) и числу замещений в нуклеотидах (моно-, ди- или триметилирование). Гистоновый код, отражающий последовательность гистоновых модификаций, включая тип, позицию и число, может находиться как в активном, репрессированном, так и в бивалентном состоянии хроматина, что приводит к синтезу в спирали ДНК репрессорных протеиновых комплексов [2]. Эпигенетическая регуляция играет центральную роль в геномном импринтинге и по-разному ассоциирует между собой сочетания родительских генов для их экспрессии. Таким образом, геномный импринтинг осуществляется разнообразными эпигенетическими модификациями в материнских и отцовских хромосомах. Они предопределены уникальными структурами, которые устанавливают «зародышевую линию» развития плода на всех стадиях. Гены, наиболее часто подвергающиеся импринтингу, обнаруживаются обычно в кластерах и содержат, как правило, область контроля ЦпГ (ICR), устанавливающую характер импринтинга на участке цепи. Они являются особо важными регуляторными элементами, управляющим аллельной экспрессией генов [1].
Геномный импринтинг
Открытие геномного импринтинга произошло в результате исследований, целью которых было изучить причину присутствия партеногенеза у отдельных особей. При помощи серии экспериментов с пересадкой ядер в клетки мышей было обнаружено, что зиготы, сгенерированные из хромосом, взятых у обоих родителей (материнские и отцовские хромосомы), или только из отцовского материала, не выживали [3].
Внутриутробное развитие эмбрионов с материнским набором хромосом было ограничено, их плацента была бедна сосудами, а общая масса эмбриональных тканей была снижена. Однако при отцовском наборе хромосом наблюдали трофобластическую неоплазию с низкой долей эмбрионального компонента и патологически увеличенной плацентой, что продемонстрировало отсутствие эквивалентности между материнским и отцовским генетическим материалом, уникальность обоих компонентов и невозможность их взаимозаменяемости. Дальнейшие исследования данного феномена имеют свое начало от исследований мышей с однородительской дисомией. Мыши-носители гетерозиготной транслокации были скрещены друг с другом для тестирования некомплементарности отцовских аллелей. В результате была получена первая геномная карта мышей с обозначением участков хромосом 2, 8 и 17 [1]. Были выявлены места участков импринтинга генов: материнская специфичная экспрессия гена Igf2r и Н19 на 17-й хромосоме и отцовская специфичная экспрессия гена Igf2r на 7-й хромосоме [1, 4]. Обнаруженные гены дали ключ к пониманию механизмов, регулирующих геномный импринтинг.
Интересно, что плацентарные млекопитающие и злаковые растения имеют геномный импринтинг, в то время как у рептилий и птиц он отсутствует. Даже если имеется рудиментарная плацента, как у сумчатых, это является доказательством наличия плаценты у животного [5, 6]. Такая близкая корреляция между наличием импринтинга и наличием плаценты, органа-контролера потока питательных веществ от матери к плоду, привела к появлению гипотез об импринтинге как источнике эволюции генов. Самой общепринятой гипотезой является конфликт родительских генов, согласно которой импринтинг-гены облегчают поступление веществ от матери к плоду и усиливают рост в эмбриональном и постнатальном периоде [1]. «Конфликт» родительских генов между собой приводит к нормализации экспрессии плацентарных генов, что обеспечивает нормальный рост плода. Однако внешние факторы могут нарушить баланс и вести к развитию внутриутробной задержки роста плода (ВЗРП) или микросомии плода, или к макросомии плода («крупный плод»). Даже при наличии таких убедительных гипотез в силе остаются ключевые вопросы: какие механизмы регулируют дифференциальную экспрессию отцовских и материнских аллелей и какой физиологический эффект они оказывают на рост плода.
Функция импринтинговых генов
На сегодняшний момент кодифицировано более 100 импринтинговых генов, включающих белки и РНК-кодирующие гены [1]. Существуют сообщения об открытии более 1000 импринтинговых генов в ткани головного мозга, которые являются небольшой долей из всех существующих в природе подобных генов [1]. Если ученые добьются похожих результатов в изучении набора генов плаценты, мы серьезно расширим свой информационный кругозор в данном вопросе.
На современном этапе о функции импринтинговых генов известно:
- Относительно большое число импринтинговых генов не являются РНК-кодирующими. В нескольких случаях функция не-РНК-кодирующих генов известна, но для многих из них механизм действия неясен [1].
- Огромное число онкогенов и генов-супрессоров опухолей являются импринтинговыми. Они представлены как в материнском наборе хромосом, так и в отцовском.
- Большое число импринтинговых генов имеют уникальный механизм действия (CALCR, BLCAP, GRB10) или нейтрально влияют на развитие и функционирование органа (отцовские гены – MEST, NDN, NNAT, PEG3, материнские – ATP 10A, KCNQ1, TP73, PPP1R9a). Выпадение экспрессии гена Mest у мышей ведет к нарушениям материнского поведения и плацентофагии. Сами детеныши развиваются нормально, если вовремя заменить им родителя со здоровой экспрессией гена. При нарушении экспрессии гена PEG3 мать не может выхаживать детенышей, так как у нее снижена секреция материнского молока из-за недостатка рецепторов окситоцина [1]. Нарушения работы других генов ведут к возникновению синдрома Прадера–Вилли/Ангельмана (PWS/AS) [1].
- Совокупность импринтинговых генов, которые влияют на метаболические параметры, функцию щитовидной железы, инсулин, и метаболизм гликогена – экспрессированные отцовские гены DIO3, HYMAI, MAGEL2, NNAT, и материнские экспрессированные гены B10, H19, KCNQ1, PHLDA2.
- Гены, влияющие на скорость роста плода и плаценты, включая DIO3, DLKI, HYMAI, IGF2, MAGEL2, MEST, PEG10, PEG3, PLAGLI, SFRP2, а также материнские гены GRB10, PHLDA1, CDKNIC, RB1.
В целом, функционирование данных генов поддерживает гипотезу о «родительском конфликте» генов. Она заключается в работе материнских генов, как супрессора поступления питательных веществ от матери к плоду, и отцовских, как экспрессора плацентарного обмена. Мутации в данных генах в перспективе ведут к изменениям энергетического обмена плаценты, что подтверждается фенотипами животных моделей при изучении генов CDKN1C, GRB10, H19, PHLDA2 (материнские) и DIO3, DLK1, HYMAL, IGF2, MAGEL2, MEST, PEG3, PEG10, PLAG11 (отцовские). Инактивация гена Rb1 ведет к усиленной пролиферации трофобластов, а ген SFRP2 ведет к сниженной ресничной миграции трофобластов. Более того, если бы мы составили список критериев регуляции между плодом и матерью на физическом уровне, список бы включал площадь соприкосновения плаценты, плотность маточных и плацентарных кровеносных сосудов, транспортные механизмы и утилизацию глюкозы. В постнатальном периоде в список можно ввести уход за детенышами, секрецию молока и уровень обмена веществ. Каждый импринтинговый ген является движущей единицей эволюции. Хотя функция каждого гена остается для нас понятной, групповое функционирование генов до сих пор непонятно.
Экспрессия импринтинговых генов в различных тканях человеческого организма
Для того чтобы определить характер экспрессии импринтинговых генов в человеческой плаценте и уровень относительной экспрессии гена по сравнению с другими (то есть не импринтинговых), был проведен мета-анализ данных с использованием хранилища данных об экспрессии (GEO). Образцы данных включали: 1) GSE24129, с представлением 8 образцов нормальной плаценты без патологии; 2) GSE18887, включающих 18 человеческих плодов по стадиям Карнеги 9-14; 3) GSE4888, 28 образцов миометрия у небеременных женщин (не представлялось возможным взять образцы у беременных женщин); 4) GSE12654, 15 образцов головного мозга человека; и 5) GSE17371, с образцами мышечной ткани у диеторезистентных и дието-не резистентных пациентов. В целом, выбранные ткани представляли собой совокупность тканей организма (матки, плаценты и плода), играющих роль в компенсаторной реакции головного мозга [1, 3, 7].
Так как эксперименты были проведены независимо друг от друга, то сравнение результатов было относительно затруднено. Вариабельность каждого эксперимента была ограниченна, так как сравнивали действие каждого гена с другими по рейтинговому списку; всего было изучено поведение 27 генов. Из плаценты было выделено 37 импринтинговых генов. 17/37 (46%) импринтинговых генов проявляли активность экспрессии в самых высших значениях 10 перцентиля, 5 генов были активными в пределах первого перцентиля. Они экспрессировались в значениях, сравнимых с высоко экспрессивными генами, такими как ACTIN, GAPDH, EEF1A1, и COLIA2. Не только гены плаценты имеют высокие показатели, но и такая небольшая группа генов, как GNAS, SNRPN, BLCAP, и CDKN1C (представленные в остальных тканях).
Вспомогательные репродуктивные технологии и нарушения развития плода
Вспомогательные репродуктивные технологии (ВРТ) подразумевают способы манипуляции гаметами in vitro в тех случаях, когда наступление беременности невозможно при естественном оплодотворении. ВРТ проводят в критические периоды эпигенетического репрограммирования, когда ДНК-метилирование и модифицирование гистонов свернуто или проведено повторно. Эпигентические модификации должны быть исключены в любом поколении организмов, так как задача мейотической рекомбинации заключается в смешивании родительских генов и передаче смешанных сочетаний генов. При этом геном имеет свойство накапливать метилирование в нуклеотидах ДНК и хроматиновые мутации в связи с действием различных факторов окружающей среды: питания, курения, солнечного излучения, возраста, алкоголя и др. [8]. Если ошибки, накопленные в ДНК, не будут на протяжении последующих поколений исправлять молекулярными взаимодействиями, то впоследствии накопится значительный «генетический груз». Поэтому процесс исправления эпигенетических ошибок необходим для исправления генетических ошибок в ДНК и сохранения здоровья в долгосрочной перспективе.
Удаление эпигенетических модификаций, включая импринтинг генов и восстановление прежних, было детально описано во многих зарубежных исследованиях [8]. В норме, продукты импринтинга регулярно удаляются из ДНК-последовательности в ходе развития плода, однако это наблюдается только в гоноцитах. Человеческий геном постепенно «самоочищается» от генетических ошибок, удаляя старые последовательности из гистонов и самой молекулы; вместо старых сбоев неизбежно появляются новые. Как правило, они определяют формирующийся пол плода, соответственно при овогенезе в гаметах формируются типичные для женского пола последовательности генов, а при сперматогенезе в половых клетках встречаются типичные для мужского пола последовательности. В результате гаметы получают маркеры половой принадлежности, они составляют генную конституцию ДНК зиготы. Через несколько часов после оплодотворения происходит деметилирование мужской последовательности ДНК по неизвестному механизму, в то время как женский маркер ничто не затрагивает. Деметилирование женских маркеров начинается во время дробления зиготы и заканчивается на стадии морулы, после которой оба половых маркера обратно метилизируются. Несмотря на обратный процесс, деметилизация происходит в каждом поколении на протяжении многих лет и является эволюционно значимым процессом периода эмбриогенеза. Собственно, ученых интересует причина разницы в степени реметилирования между плодом и плацентой. При этом плацента в меньшей степени метилируется, в отличие от плода. Такое соотношение сохраняется у млекопитающих: у человека, мышей, рогатого скота и др. [1, 9–12]. Поэтому с точки зрения эпигенетического значения плацента – уникальный орган.
За последние несколько лет были получены сообщения о связи репродуктивных технологий и синдромов Беквита–Видеманна и Ангельмана. Несмотря на то, что эти данные противоречивы, есть основания полагать о небольшом повышении риска возникновения таких осложнений при применении ВРТ [1]. Беспокойство при анализе данных часто вызывают серьезные различия между характером овуляции участников исследования, так как разные индивидуумы имеют разную способность к зачатию. Чтобы доказать влияние ВРТ на риск нарушения импринтинга, следует применять моделирование на животных. Недавние исследования на мышах продемонстрировали влияние ВРТ на рост плода и развитие. Одним из интересных наблюдений стал эффект сверховуляции при импринтинге генов обоих родителей [13]. Market-Velker и соавт. также сообщали об отсутствии экспрессии генов Snrpn, Peg3, Kcnq1ot1 и метилировании Н19, как факторов, приводящих к сверховуляции [13].
Аналогично, выращивание плода in vitro может приводить к долгосрочным импринтинговым изменениям. Было обнаружено, что ВРТ повышает уровень активности соматических ядер, приводящий к активному метилированию и импринтингу генов [1]. Похожие наблюдения были сделаны при исследованиях на моделях крупного рогатого скота и овцах при изучении плацентарной морфологии и росте плода c пороками развития [11, 14]. Кроме того, при применении ВРТ было отмечено повышение доли пациентов с синдромом Беквита–Видеманна и Ангельмана, так как в их фенотипе имелось нарушение функционирования соматических ядер, связанное с импринтингом и сопровождавшееся метилированием [11]. Данные были найдены в результате изучения образцов плодов и самой плаценты [15].
Роль импринтинга генов во внутриутробной задержке роста плода
Многие исследовательские группы сообщали о связи изменений импринтинговых генов и уровня метилирования с возникновением внутриматочного ограничения роста плода. Недавние результаты исследований сообщают об отклонениях, связанных с метилированием на многочисленных локусах импринтинговых генов, со сниженным плацентарным метилированием при экспрессии гена IGF2/ локуса H19 при неэклампсированной плаценте, с дифференциальной экспрессией во множественном импринтинге [1, 3, 7]. Однако экспрессия до нарушения не была связана с нарушением импринтинга или потерей данного гена [1, 3, 7]. Ограничением в данном исследовании стало то, что среди тысяч генов, отвечающих за развитие плаценты, было исследовано лишь их небольшое число (IGF2/H19). Более обширные исследования показали, что эффекты импринтинга, за исключением метилирования азотистых оснований, не отображаются на его общей структуре генов. Было изучено общее метилирование в CD 34 клетках у пациентов с внутриматочной задержкой роста плода и обнаружены уровни различного метилирования в 56 разных локусах, причем те не относились ни к одному импринтинговому гену. Аналогично, анализ экспрессии генов при помощи ДНК-микрочипов показал, что несколько сотен генов повреждены и лишь несколько из них являются импринтинговыми [2, 14–18]. Отличным примером комплексного эффекта импринтинга являются результаты, полученные зарубежными исследователями, которые показали, что лишь малая группа импринтинговых генов (PHLDA2, MEST, MEG3, GATM, GNASW, PLAGLI) и дополнительные 400 генов были повреждены в плаценте при ВЗРП [13]. Гены импринтинга в связи с обычными генами влияют на возникновение ВЗРП.
Тогда каким образом очевидная связь импринтинговых генов и степени развития плаценты, а тем более однородительская дисомия плода не имеют столь же очевидной связи с ВЗРП? Простое объяснение лежит в гетерогенной природе ВЗРП. Пока в мире диагноз ВЗРП подтверждается снижением массы тела по сравнению с нормой всего лишь на 8–10 перцентилей, в эту группу могут попасть и дети с нормальной массой тела при рождении. Более строгий критерий основан на двух кривых массы тела плода на основании допплеровской велосиметрии [1]. Однако даже при соблюдении строгих критериев отбора изучение фенотипа человека с ВЗРП крайне затруднено из-за большого числа факторов, нарушающих внутриутробный рост плода (материнский, плодовый, плацентарный и экологический). На сегодняшний день все исследования экспрессии генов проводились с ограниченным числом генов. Невозможно искать причину нарушения развития плода только в одном или нескольких генах. Гены, структура которых нарушена, отвечают за синтез адренокортикотропного рилизинг-гормона (АКТГ), инсулиноподобного фактора роста 1 (ИПФР1) и лептина (LEP), которые обнаружены в плаценте при ВЗРП [13,16]. Какова же роль импринтинг-генов при развитии ВЗРП?
При ВЗРП импринтинг-гены могут быть разделены на 2 категории: гены, участвующие в провоцировании заболевании и ограничивающие рост плода (негативный эффектор), и те гены, которые через компенсаторный механизм приводят к усиленному росту плода. Наблюдения показали, что плод может компенсировать недостаток поступающих к нему питательных веществ. Возможно, самым точным примером такой компенсации является асимметрия развития плода с ВЗРП, при которой головной мозг получает достаточно питательных веществ, в то время как другие ткани (мышцы) и органы (почки) снабжаются в не достаточном объеме. Этот эффект был обнаружен при исследованиях на различных моделях животных (Struwe и соавт., 2010), и подтвержден на человеке. В исследовании оценивалось соотношение массы мозга, мышц и других органов у 9000 участников [18], и было подтверждено наличие механизма, защищающего развитие мозга при сниженной общей массе тела [10], когда происходит перераспределение потока крови в головной мозг для предотвращения гипоксии или недостаточности питания [16]. Данная физиологическая реакция сложна по механизму и срабатывает благодаря различным стимулам, включая низкий уровень кислорода, уровень глюкозы, лактата, аминокислот и липидов. Именно здесь кроется ответ на ключевой вопрос о роли компенсаторных реакций в развитии плода.
Заключение
Импринтинговые гены, играя очень важную роль в развитии и функционировании плаценты, могут подвергаться различным структурным изменениям, нарушая развитие плода. Изучение инактивации генов в хромосомах мышей и человека продемонстрировали, что импринтинг-гены имеют комплексное действие на энергетический баланс между организмом плода и матерью.
