Задержка роста плода (ЗРП) – актуальная проблема современного акушерства, занимающая одно из ведущих мест, наряду с инфекционными причинами и врожденными аномалиями развития плода, в структуре перинатальной заболеваемости и смертности, характеризующаяся неспособностью плода достичь своего генетически запрограммированного потенциала роста [1, 2]. Несмотря на развитие и внедрение в клиническую практику методов прогнозирования, профилактики, диагностики и лечения плацентарной недостаточности и ЗРП, частота данной патологии не имеет тенденции к снижению [3]. Согласно современным представлениям, ЗРП оказывает влияние не только на внутриутробное состояние плода, но и на последующее развитие ребенка и во многом определяет уровень его здоровья на протяжении последующей жизни [4].
На территории России в настоящее время данная патология встречается в 5–18% случаев [5]. В 75% случаев до рождения ЗРП остается не выявленной, а данный диагноз ставится ретроспективно у беременных с низким риском его развития. Следует подчеркнуть, что ЗРП любой этиологии всегда сопровождается теми или иными изменениями в плаценте и является несомненным свидетельством наличия плацентарной недостаточности; ЗРП может быть связана с плодовыми, плацентарными и материнскими факторами, однако, в 40% случаев этиология ЗРП неизвестна. По характеру изменений фетометрических параметров выделяют симметричную и асимметричную формы ЗРП, а по сроку формирования – раннюю (26 нед. – 33 нед. 6 дней беременности) и позднюю (34–40 нед.). Известно, что основными регуляторами передачи питательных веществ и кислорода плоду от матери в плаценте являются клетки трофобласта. Последние представляют собой непрерывный специализированный слой эпителиальных клеток, которые покрывают всю поверхность ворсин плаценты и находятся в непосредственном контакте с материнской кровью. Одним из основных белков, участвующих в поддержании эпителиальной клеточной адгезии является трансмембранный белок Е-кадгерин (Е-кад), имеющий молекулярный вес 120 kDa, обеспечивающий целостность эпителиального слоя. Противоположенную функцию выполняет растворимая форма Е-кадгерина (рЕ-кад) с молекулярным весом 80 kDa, образующуюся при деградации молекулы E-кадгерина 120 kДа в результате кальций-зависимого протеолитического процесса [6]. Показано, что в протеолизе E-кад участвуют матриксные металлопротеиназы, трипсин, калликреин 7 и плазмин [7]. Образующаяся усеченная форма Е-кадгерина может функционировать как псевдолиганд, блокирующий нормальное взаимодействие E-кадгеринов, что приводит к снижению межклеточной адгезии [8]. Исследования показывают, что наличие рЕ-кад необходимо для пролиферации эпителиальных клеток. При этом добавление антител против рЕ-кад к культуре клеток эпителия вызывает прекращение деления и запускает дифференцировку [9, 10]. Кроме того, рЕ-кад может взаимодействовать с рецепторами факторов роста, в частности с рецептором эпидермального фактора роста (HER), запуская пролиферативные сигнальные каскады.
Таким образом, интерес представляет изучение роли молекул клеточной адгезии, в частности различных форм Е-кадгерина в развитии синдрома ЗРП.
Цель исследования: изучить взаимосвязь уровней растворимой (80 kDa) и трансмембранной (120 kDa) форм Е-кадгерина в плаценте с ЗРП.
Материал и методы исследования
Исследованы плаценты, полученные от 18 женщин с ЗРП (основная группа), и плаценты от 20 пациенток с физиологически протекающей беременностью (группа контроля). Всеми пациентками было подписано информированное согласие на участие в данном исследовании, которое было одобрено локальным этическим комитетом. Критериями включения в обеих группах являлись: одноплодная беременность, родоразрешение на сроке гестации с 37 недель до 40 недель 6 дней, наличие ЗРП в основной группе. Критерии исключения – тяжелая экстрагенитальная патология, многоплодная беременность, пороки развития плода, генетические и острые инфекционные заболевания матери, преэклампсия.
Вестерн-блоттинг. Равное количество белка (50 мкг), который был экстрагирован из средней ворсинчатой части плацент, подвергали электрофорезу 12% разделяющем и 6% концентрирующем акриламидных гелях. Перенос белков производился на PVDF-мембрану. Мембрану блокировали и затем инкубировали в течение ночи при 4°С со следующими первичными антителами: Е-кадгерин («Santa Cruz», USA) и GAPDH («Thermo Scientific», USA). Далее мембрану инкубировали с вторичными антителами с пероксидазой хрена при комнатной температуре в течение 1 часа. Изображения были получены с использованием системы визуализации ChemiDoc XRS+ (Bio-Rad, USA). Относительный уровень белка был рассчитан с помощью программы ImageJ.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Общая РНК экстрагировалась из плацент набором RNeasy Micro Kit («Qiagen», Germany). Обратную транскрипцию полной РНК проводили с помощью набора M-MLV («Invitrogen», CA, USA). Уровень экспрессии гена E-кадгерина с использованием системы ПЦР реального времени CFX96 («Bio Rad», USA). В качестве референсного гена был использован ген рибосомального белка RPL19. Относительные значения экспрессии были рассчитаны с помощью программы REST 2009. Праймеры представлены в табл. 1. ПЦР проводили по следующей программе: 95°С -5 мин. 45 циклов: 95°С -10 сек, 60°С -20 сек.
Статистическая обработка данных была произведена с помощью программ AtteStat и OriginPro 8.1. Анализ на нормальность распределений значений был проведен с помощью критериев Шапиро–Вилка. Для нормального распределения значения представлены в виде среднего значения и ошибки среднего (М±SEM). Для ненормального – в виде медианы, нижней и верхней квартили. Для оценки статистических различий использовался критерий Стьюдента (параметрическая статистика) и критерий Манна–Уитни, (непараметрическая статистика). Для проверки статистической значимости различий категориальных переменных использовался точный критерий Фишера. Критический уровень достоверности нулевой статистической гипотезы принимали равным 0,05.
Результаты исследования и их обсуждение
Основные характеристики акушерско-гинекологического анамнеза, состояния пациенток и их новорожденных представлены в табл. 2.
Как видно из представленных в табл. 2 данных, пациентки исследуемых групп были сопоставимы по возрасту и индексу массы тела. Анализ структуры экстрагенитальной патологии показал, что у пациенток с ЗРП в 2 раза чаще отмечалась миопия различной степени, составляя 44,4 и 20% (по группам соответственно). Кроме того, в основной группе в 1,5 раза чаще выявлялась эктопия шейки матки, составляя 55,5 и 30,0% (по группам соответственно).
Масса плацент в основной группе была достоверно ниже (р<0,05), в отличие от группы контроля, и составила 294,4±20,7 и 580,3±17,6 г (по группам соответственно). Аналогичная тенденция отмечалась при определении массы тела новорожденных – 2282,8±82,1 и 3343,7±90,1 г (р<0,05).
При сравнении уровня растворимой и нерастворимой форм Е-кадгерина в лизатах плацент группы с ЗРП и контрольной группы методом вестерн-блоттинг были обнаружены значительные различия. Уровень растворимой формы Е-кадгерина был статистически значимо снижен в 4,8 раза, а трансмембранной формы – в 2,5 раза в группе с ЗРП. Значения относительного уровня белков составили для контрольной группы: Е-кад – 2,7±0,5 отн. ед., рЕ-кад – 3,5±0,57 отн. ед.; для группы с ЗРП: Е-кад – 1,1±0,2 отн. ед., рЕ-кад – 0,7±0,2 отн. ед. Соотношение трансмембранной к растворимой форме Е-кадгерина в группе с ЗРП составило 1,6 в контрольной группе – 0,8 (рис. 1, 2). Проведенный ПЦР-анализ в режиме реального времени показал, что уровень экспрессии гена Е-кадгерина CDH1 в плацентах контрольной группы был выше в 1,3 раза по сравнению с группой с ЗРП, но не имел статистической значимости (р=0,08). Относительные значения соответственно составили 0,4 (0,2; 0,9) и 0,3 (0,1; 0,4). Данные представлены в виде медианы, нижней и верхней квартили.
Лизаты плацент получены от женщин с физиологически протекающей беременностью и с синдромом ЗРП.
В контрольной группе уровень растворимой и нерастворимой формы Е-кадгерина достоверно увеличен относительно группы ЗРП (p<0,001).
Соотношение зрелой формы к растворимой форме Е-кадгерина в группе с ЗРП составило 1,56 в контрольной группе – 0,81 (в обоих случаях p<0,05). Данные на рисунках представлены в виде средних значений ± ошибка среднего.
Основной причиной ЗРП является плацентарная недостаточность, обусловленная развитием синдрома системного воспалительного ответа в плаценте [11]. Кроме того, формирование плацентарной недостаточности может быть следствием нарушения молекулярных механизмов, регулирующих инвазию трофобласта и образование спиральных артерий. В связи с вышеизложенным интерес представляет изучение одного из ключевых регуляторов клеточной пролиферации и инвазии – Е-кадгерина. В последнее время к растворимой форме Е-кадгерина появилось повышенное внимание исследователей, изучающих опухолевые процессы, в связи с описанным эффектом остановки пролиферации раковых клеток, их дифференцировкой или апоптозом при связывании рЕ-кад антителами [9, 12]. Однако исследования данного белка связанные с беременностью, как правило, сводились к изучению концентрации в крови. Так, было установлено, что наибольший уровень рЕ-кад наблюдается в 10–14 недель беременности (в период плацентации), что подтверждает его роль в формировании плаценты [13].
Для рЕ-кад описано несколько функций, представленных на рис. 3. Одна из них – это связывание внеклеточного домена трансмембраной формы Е-кадгерина, в результате чего клетка теряет связь с окружающими ее клетками и приобретает подвижность. Кроме того рЕ-кад может выступать как лиганд для рецепторов различных факторов роста, регулирующих пролиферацию в клетке, а также вызывающих экспрессию факторов, разрушающих межклеточные связи и внеклеточный матрикс, например матриксные металлопротеиназы [14].
В данной работе мы впервые рассматриваем соотношение рЕ-кад и Е-кад в плаценте. По-видимому, меньшее количество растворимой, чем трансмембранной формы Е-кадгерина приводит к неполному блокированию межклеточных связей трансмембранной формы Е-кадгерина, что значительно снижает или делает невозможной способность клетки к подвижности и делению. Вследствие вышеуказанных процессов часть клеток в плаценте не имеющих достаточных связей с рЕ-кад будет дифференцироваться с исходом в ряде случаев в апоптоз. Мы обнаружили, что уровень Е-кадгерина, отвечающего за межклеточную адгезию, в контрольной группе был значительно выше, чем в группе с ЗРП. Однако уровень растворимой формы в контрольной группе превышал уровень трансмембранной формы Е-кадгерина. Отношение Е-кад/рЕ-кад составило 0,8. В плацентах группы с ЗРП наблюдалась противоположенная динамика – уровень рЕ-кад был ниже относительно уровня Е-кад. Соотношение Е-кад/рЕ-кад составило 1,6.
Полученные данные свидетельствуют, что недостаточное количество растворимой формы Е-кадгерина в плацентах при ЗРП указывает на низкую пролиферацию и возможный апоптоз клеток плаценты. Это предположение также косвенно подтверждается значительно сниженной массой плацент в данной группе.
Для уточнения причин изменений уровней различных форм растворимой формы Е-кадгерина, была исследована экспрессия гена Е-кадгерина CDH1. Отсутствие достоверных различий указывает на возможность посттрансляционных модификаций Е-кадгерина, которые могут играть ключевую роль в сниженном образовании растворимой его формы и, как следствие, развитии ЗРП. С другой стороны, есть исследования показывающие, что в плазме матери во время беременности присутствует значительный уровень рЕ-кад, который мог бы компенсировать недостаток его в плаценте. Однако в случае формирования ЗРП вышеуказанные механизмы не развиваются или ограничены, что делает актуальным дальнейшие исследования уровня растворимой формы Е-кадгерина в крови матери при данной патологии.
Заключение
Таким образом, вышеизложенные данные указывают на значимость определения растворимой (80 kDa) и трансмембранной (120 kDa) форм Е-кадгерина, на взаимосвязь их уровней в плаценте при формировании ЗРП, что способствует пониманию механизмов развития данной патологии и появлению новых возможностей ее диагностики.
