Преждевременная недостаточность яичников (ПНЯ) представляет собой клинический синдром, объединяющий гетерогенную группу заболеваний, в которой овариальная недостаточность может быть вызвана различными причинами. На сегодняшний день очевидно, что субстратом для инициации и развития ПНЯ являются разнообразные генетические факторы. Идентификация генов, вовлеченных в этот процесс, качественная и количественная оценка молекулярно-генетических изменений и их клинического значения представляют огромный интерес с точки зрения фундаментальной и клинической гинекологии. Появление и широкое внедрение разнообразных молекулярных технологий позволяют значительно расширить диапазон наших познаний в области данной патологии.
В последние годы накопились сведения о роли андрогенного рецептора (АR) в процессах роста и созревания фолликулов, а также о его вкладе в процесс естественной гибели клеток, что позволяет расширить наши знания о причинах развития ПНЯ.
АR относится к лиганд-зависимому типу суперсемейства ядерных рецепторов, имеет молекулярную массу 110 кДа и включает 918 аминокислот. В молекуле AR выделяют несколько основных структурных доменов (пептидных фрагмента), при этом каждый из них выполняет свои, во многих случаях еще не полностью изученные функции, касающиеся активности всей молекулы АR.
Известно, что АR модулирует важные клеточные процессы и действует как транскрипционный фактор в контроле роста клеток, дифференциации, пролиферации и апоптоза в клетках-мишенях для андрогенов не только у мужчин, но и у женщин. Ген, кодирующий АR человека (ген R), локализуется на хромосоме Х в области Хq11.2-q12 и не имеет аллелей на хромосоме Y, что обусловливает полную
утрату андрогенного эффекта у ХY-индивидуумов с инактивирующей мутацией гена R [10].
В середине белковой цепи АR расположен ДНК-связывающий домен. Даже незначительные изменения в последовательности аминокислотных остатков в нем могут оказывать большое влияние на активность рецептора. В этом участке молекулы АR человека обнаружены мажорные мутации у индивидуумов с синдромом андрогенной недостаточности [4]. N-концевой домен молекулы АR (трансактивационный) – самый большой по сравнению с другими рецепторами стероидов, и в нем условно выделяют более мелкие участки, которые вносят различный вклад в регуляцию активности рецептора. Это, например, участок с т.н. активационной функцией-1 (AF-1) [4, 7], который обусловливает основную транскрипционную активность AR, что и заставило нас сконцентрировать наше внимание на этом домене. В этом регионе находится высокополиморфный тракт, состоящий из разного количества повторов аминокислотных остатков гуанина, который кодируется тринуклеотидным CAG-повтором (цитозин-аденин-гуанин) вариабельной длины в первом экзоне гена R.
Согласно мнению ряда ученых, можно предположить, что у больных с ПНЯ в гене AR обнаружена тенденция к укорочению длины CAG-повтора [16]. Поскольку у женщин при более короткой длине CAG-повтора активность AR повышена, что предполагает большую активность андрогенов на клеточном уровне [5], ПНЯ может быть обусловлена усиленным андрогенным влиянием на растущий фолликулярный пул, вызывающим ускорение процесса атрезии фолликулов.
Биологические эффекты андрогенов могут изменяться в результате нарушений на различных этапах андрогенного сигнального пути. Для изучения роли андрогенов в генезе развития ПНЯ мы оценили состояние гена R в тканях яичника и его связь с продукцией самих гормонов, а также проанализировали длину CAG-повтора гена R у пациенток с ПНЯ и у здоровых женщин, составлявших группу контроля.
Материал и методы исследования
В работу были включены 117 женщин с ПНЯ. Средний возраст пациенток составил 33,05±5,1 года, средняя продолжительность заболевания – 4,21±1,2 года. У этих женщин самостоятельная менструация отсутствовала 6 месяцев и более. У всех пациенток был определен уровень фолликулостимулирующего гомона (ФСГ), лютеинизирующего гормона (ЛГ), эстрадиола
(Е2), общего сывороточного тестостерона (Тобщ) и тестостеронэстрадиол-связывающего глобулина (ТЭСГ) методом иммуноферментного анализа (ИФА). Индекс свободных андрогенов (ИСА) был рассчитан как отношение уровня Тобщ к уровню ТЭСГ и выражен в процентах. Группа контроля
в отношении уровней ТЭСГ, Тобщ и ИСА составила 15 здоровых женщин репродуктивного возраста
с сохраненным ритмом менструации. В качестве популяционного контроля длины CАG-повтора
гена R проанализировано 83 образца ДНК, здоровых регулярно менструирующих женщин-доноров,
проживающих в европейской части России, средний возраст которых составил 32,35±0,95 года.
Материалом для FISH-анализа служили 20 операционных образцов, полученных путем биопсии яичников больных с ПНЯ (после получения информированного согласия) с диагностической целью, что одобрено этическим комитетом ФГУ Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова Минздравсоцразвития России (ФГУ НЦ АГ и П). В качестве контроля использовали 10 образцов яичниковой ткани женщин, погибших при чрезвычайных обстоятельствах до 40 лет (средний возраст – 28,4±6,3 года). При гистологическом исследовании биоптированной ткани яичников у всех женщин, включенных в группу контроля, обнаружены многочисленные первичные, вторичные и примордиальные фолликулы, а также желтые и белые тела, свидетельствующие о функциональной активности яичников, соответствующей их возрасту.
После забора биоптированной ткани яичников из них готовили мазки-отпечатки на обезжиренных стеклах, а оставшийся материал замораживали при -20ºС и направляли в лабораторию молекулярной патологии для общеморфологического анализа и изучения состояния гена AR. FISH-реакция проведена как на выделенных по специальному методу изолированных ядрах из биоптатов, так
и на мазках-отпечатках. В 50% случаев состояние гена AR анализировали в ткани яичников, в препаратах, полученных из парафиновых блоков, взятых от ранее оперированных больных с ПНЯ в НЦ АГ и П. Выделение клеточных ядер из парафиновых блоков для последующего FISH-анализа осуществлено по методике, предложенной S.F. Paternoster и соавт. [13]. Исследование методом FISH проведено по стандартной методике согласно инструкции производителя и осуществлено с помощью коммерческих центромерных проб фирмы Vysis (США) на хромосому Х (CEP X, Spectrum Green), на ген R
(LSI AR, Spectrum Orange). Амплификацию гена R оценена с помощью флуоресцентного микроскопа
Axioskop 2 фирмы Zeiss, оборудованного соответствующим набором фильтров фирмы Vysis и системой автоматического анализа изображения ISIS, разработанной фирмой Metasystem. Метка гена AR связывается с локусом Xq12 и флуоресцирует интенсивным оранжевым цветом. В нормальной
метафазе метка высвечивается как один сигнал на каждой хромосоме Х. Наличие/отсутствие амплификации гена R оценивалось по соотношению оранжевых (соответствующих помеченному гену
R) и зеленых флуоресцентных сигналов, которыми помечен центромерный участок хромосомы Х.
При соотношении оранжевых к зеленым меткам ≥1,5 результат считали положительным и расценивали как амплификацию гена R. Для оценки тканеспецифических различий по состоянию гена R в группе больных ПНЯ и контрольной группе женщин репродуктивного возраста использован статистический анализ с помощью критерия χ², U-критерия Манн–Уитни.
Выделение геномной ДНК из образцов периферической крови проведено с помощью набора
Wizard® Genomic DNA Purification Kit («Promega», USA) согласно инструкции фирмы-производителя. Метилчувствительный рестриктный анализ (МЧРА) осуществлен с предварительным гидролизом геномной ДНК метилчувствительной эндонуклеазой BstHHI («СибЭнзим», Россия). Длина CAG-повтора в гене R определена с помощью количе ственной флуоресцентной полимеразной цепной реакции (ПЦР). Последовательности праймеров (F 5’-gtgcgcgaagtgatccagaa-3’, R 5’-gct gtgaaggttgctgttcctcat-3’), условия амплификации описаны ранее [4, 13]. Фрагментный анализ ПЦР-продуктов, конъюгированных с флуоресцентным красителем FAM, проведен на генетическом анализаторе ABI3100 Genetic Analyzer («Applied Biosystems», USA). В качестве маркера молекулярной массы использован стандарт ROX500; длины аллелей и площади пиков вычислены с помощью программы GeneMapper v. 3.5. фирмы-производителя. Статистический анализ экспериментальных данных включал расчет информативности анализируемого локуса, а также сравнение показателей SBM (simple biallelic mean) и XWBM (X weighted
biallelic mean) в группе ПНЯ и контрольной группе. Показатель SBM определен как среднее арифметическое длин двух аллелей, выраженных в CAG-тринуклеотидах, и вычислен по формуле
SBM=(L1 + L2) / 2, где L1 и L2 – длины аллелей в CAG-тринуклеотидах.
При изучении аллелей и генотипов AR у женщин целесообразно учитывать инактивацию хромосомы Х (XCI – X chromosome inactivation) – явление случайной инактивации одной из двух хромосом Х (отцовской или материнской), обеспечивающее одинаковое количество функционирующих Х-сцепленных генов у представителей обоих полов [15]. Тем не менее в ряде случаев имеет место избирательная (неслучайная) инактивация хромосомы Х одного из родителей (SXCI – skewed XCI).
Существуют данные о том, что SXCI встречается в норме в экстраэмбриональных тканях, а также
при некоторых патологических состояниях, в частности при синдроме поликистозных яичников
и ПНЯ [9, 15]. По данным З.Г. Габибуллаевой, SXCI при пороговом уровне ≥70% выявлена у каждой
четвертой больной с ПНЯ [1]. Показатель, характеризующий как длину CAG-повтора, так и инактивацию несущего его аллеля, – XWBM. Этот показатель в настоящем исследовании рассчитан
по формуле: XWBM=L1•A1+L2•A2, где L – длина аллеля в CAG-тринуклеотидах, А – доля активных аллелей в образце, 1 и 2 – индексы соответствующих аллелей.
При расчетах использованы программы Excel («Microsoft», USA) и GraphPad InStat v. 3.05. («GraphPad Software», USA).
Результаты исследования и обсуждение
При изучении гормонального профиля у обследуемых женщин с ПНЯ наряду с гипергонадотропным гипогонадизмом (в среднем уровень ФСГ составил 100,43±41,26 МЕ/л, ЛГ – 68,03±41,96 МЕ/л, Е2 – 121,68±12,46 нмоль/л) отмечено гипоандрогенное состояние, что согласуется с данными литературы. В среднем уровень Тобщ в нашем исследовании составил 0,95±0,69 нмоль/л (от 0,2 до 3,7 нмоль/л), что в 2 раза ниже, чем в контрольной группе (1,9±0,5 нмоль/л, р<0,001). Почти у двух третей (61,3%) женщин с ПНЯ уровень Тобщ колебался от 0,2 до 0,9 нмоль/л и составил в среднем 0,54±0,2нмоль/л. Уровень ТЭСГ в среднем по группе больных с ПНЯ составил 81,56±40,74 нмоль/л, а в группе контроля – 72,7±11,8 нмоль/л (p>0,05). Средний показатель ИСА у наших пациенток составил 1,93±0,95%, в то время как в группе контроля – 2,47±0,89% (p<0,05). В подгруппе больных с крайне низким уровнем Тобщ (0,54±0,2 нмоль/л) ИСА составил 0,75±0,1%, что в 3 раза ниже по сравнению с контрольной группой – 2,47±0,89% (p<0,05). Крайне редко (4,27%) среди женщин с ПНЯ отмечены повышенные уровни Тобщ (более 2,5 нмоль/л), которые колебались от 2,7 до 3,7 нмоль/л, составив в среднем 3,14±0,53 нмоль/л, при ИСА – 11,5±2,5%, что достоверно отличалось от группы контроля – 2,47±0,89%
(<0,001).
Из общей группы больных с ПНЯ (117 женщин) были выделены 20 человек, которым в дальнейшем
проведен FISH-анализ ткани яичников. Средний уровень Тобщ у выделенной группы больных составил 1,03 ± 0,6 нмоль/л, ИСА – 1,4±0,7%, что достоверно не отличалось от общей группы пациенток (p=0,372 и p=0,055 соответственно). Таким образом, результаты FISH-анализа, полученные от 20 женщин, можно экстраполировать на всю группу больных с ПНЯ в целом.
В ходе проведенного исследования с помощью FISH-анализа амплификация гена AR выявлена в 6 из 20 (30%) образцов ткани яичников, полученных от больных с ПНЯ. В количественном отношении процент ядер клеток с амплификацией гена R составил от 1 до 10%. В то же время FISH образцов ткани яичников женщин в возрасте до 40 лет из группы контроля не выявила каких-либо изменений со стороны амплификации гена R (рисунок, см. на вклейке) Это позволило осуществить сравнительный анализ, который выявил достоверные различия по амплификации гена R в яичниках больных ПНЯ и группы контроля (p=0,0245 при α=0,05). Полученные данные свидетельствуют об ассоциации амплификации гена AR с преждевременной недостаточностью яичников.
Средний уровень Тобщ у 6 пациенток с выявленной амплификацией гена AR составил 0,9±0,56
нмоль/л, что статистически не отличалось от группы больных ПНЯ в целом (p>0,05), и было в 2
раза ниже, чем в контрольной группе (1,8±0,3 нмоль/л, p<0,05). Полученные данные позволяют
сделать вывод, что амплификация гена R у больных с ПНЯ не связана с повышением уровня периферического Т и, возможно, активация гена R сопряжена с трансактивационной активностью
АR.
Образцы ДНК крови оказались информативными по полиморфизму CAG-повтора гена AR у 96 из 117 обследованных женщин с ПНЯ (82,1%). Информативность ДНК-маркера определена долей гетерозигот в исследуемой выборке, что объясняет исключение гомозигот при проведении дальнейшего анализа. Доля гомозигот по анализируемому локусу составила 17,9% (21/117) женщин. Длина CAG-повтора колебалась от 15 до 30 CAG-тринуклеотидов. В контрольной группе (83 образца ДНК) информативность составила 84,3% (70/83). Для оценки длины CAG-повтора у гетерозигот исследована частота SBM. Среднее значение SBM в группе ПНЯ составило 22,86±1,86, в группе контроля – 23,16±2,32. Это позволило осуществить сравнительный анализ, который не выявил достоверных различий SBM между группами (p=0,366 при α=0,05).
Среднее значение XWBM в группе ПНЯ составило 22,83±1,90, в группе контроля – 23,18±2,34.
Проведенный сравнительный анализ не выявил достоверных различий XWBM между группами (p=0,314 при α=0,05). Полученные результаты анализа XWBM не отличались от аналогичных результатов по показателю SBM. Однако SBM мог быть определен лишь с шагом 0,5, тогда как XWBM является непрерывной величиной. По мнению ряда авторов, целесообразно анализировать не функцию XWBM, а распределение частот XWBM с шагом 0,5 как SBM [11]. Среднее значение XWBM после округления экспериментальных значений (до первого знака после запятой) было равным 22,81±1,90, в группе контроля – 23,18±2,36. Тем не менее при сравнении групп различия также не были достоверны (p=0,287, α=0,05).
Однако средние значения SBM, XWBM (как истинные, так и после округления экспериментальных данных) были меньше при ПНЯ, чем в контроле: 22,86 против 23,16 (SBM), 22,83 против 23,18 (XWBM) и 22,81 против 23,18 (XWBM при минимальном шаге 0,5). Изучение показателей длины аллелей CAG-повтора выявило тенденцию к укорочению средней длины аллелей CAG-повтора и их уменьшение на 0,3–0,4 повтора в группе больных с ПНЯ по сравнению с группой контроля. Обсуждая полученные
результаты, следует вернуться к экспериментальным работам, показавшим, что чем меньше длина CAG-повторов в гене AR, тем большую активность проявляют андрогены на клеточном уровне за счет повышенной трансактивационной (лигандзависимой) активности рецептора [5]. В одной из недавних работ также выявлены достоверные различия длины CAG-повтора в сторону уменьшения у больных с ПНЯ по сравнению с контрольной группой среди японок [16]. В нашем исследовании наблюдается четкая тенденция к укорочению длины CAG-повтора гена R у больных с ПНЯ, что косвенно свиде-
тельствует о повышении трансактивационной активности AR.
FISH с целью выявления амплификации гена R широко применяется в онкологии. Амплификация или усиление гена R описана впервые в 1995 г. как возможный механизм прогрессирования рака предстательной железы после гормональной терапии [17]. Амплификация генетического материала является хорошо известным способом регуляции в сторону повышения генной экспрессии. Доказано, что наличие амплификации гена R в образцах опухолей рака предстательной железы обусловливает хороший ответ на лечение блокаторами андрогенных рецепторов. Ученые полагают, что амплификация гена R приводит к повышенной экспрессии АR, объясняя продолжающийся андроген-зависимый рост злокачественных клеток даже при низких концентрациях сывороточных андрогенов после кастрации [6, 17].
В настоящее время в литературе нам не удалось найти данных по определению состояния гена R в яичниковых тканях у больных с ПНЯ. Проведенный в настоящем исследовании FISH-анализ образцов биоптатов яичников показал изменение состояния гена R (амплификацию) почти у каждой третьей больной с ПНЯ (30,0%), в то время как в биоптатах яичниковой ткани от женщин с сохраненной функцией яичников (контрольная группа) подобных изменений обнаружено не было. Данные, полученные в нашей работе, позволяют рассматривать ПНЯ как результат нарушения передачи андрогенного сигна ла. Возможно, при данной патологии ускоренный процесс истощения фолликулярного пула происходит отчасти благодаря повышенной активности AR. Скорость атрезии фолликулов определяет функциональную «судьбу» яичников и следовательно, возраст наступления менопаузы. По-видимому, повышенная активность AR может усиливать фолликулярную атрезию, вызывая клеточный апоптоз и дегенерацию ооцитов. Однако взаимосвязь между инактивирующими
мутациями гена R и ПНЯ подлежит дальнейшей верификации, поскольку в настоящее время нет
абсолютных доказательств обнаружения мутаций в гене R у женщин, страдающих ПНЯ, несмотря
на то что это заболевание часто ассоциировано с Х-хромосомными аномалиями.
Наряду с повышением активности AR при изучении гормонального профиля у обследованных больных с ПНЯ отмечено гипоандрогенное состояние. В ходе нашего исследования сравнительный анализ уровня андрогенов (Тобщ, ИСА) у больных с амплификацией гена R и без нее не показал достоверных различий (соответственно p>0,05 при α=0,05). Это, возможно, свидетельствует о том, что пониженный уровень андрогенов при ПНЯ обусловлен иным механизмом регуляции. Усиление (амплификация) гена R скорее всего не связано с гипоандрогенным состоянием и в основе нарушения андрогенного сигнального пути лежит андроген-независимая активация гена R [14]. Однако наши данные не исключают возможность компенсаторного механизма увеличения числа копий гена AR в ответ на снижение уровня андрогенов, характерных для больных с ПНЯ, как зачастую происходит у больных после андрогенной депривации (кастрации).
В настоящее время известно, что во взаимодействии комплекса AR-лиганд с ДНК и инициации
биологического ответа необходимо участие ряда факторов транскрипции и белков-корегуляторов,
среди которых могут быть как стимуляторы активности рецепторов стероидных гормонов (коактиваторы), так и ингибиторы (корепрессоры) [2, 8]. В исследованиях in vitro показано, что сигнальная система андрогенного рецептора может активироваться с участием ростовых факторов, например фактора роста фибробла стов и эпидермального фактора роста [3, 12].
Таким образом, выявленная амплификация гена R в тканях яичника почти у каждой третьей больной с ПНЯ позволяет считать, что в основе данной патологии наряду с другими молекулярно-генетическими, аутоиммунными, инфекционными причинами определенную роль играет повышенная экспрессия АR на фоне гипоандрогенного состояния. Полученные нами результаты могут явиться теоритической основой назначения в дальнейшем этой категории больных блокаторов АR в виде ципротерона ацетата.
