Число инфицированных вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ) в России на 1 июля 2017 года составило 1 167 581 человек. Показатель пораженности населения Российской Федерации ВИЧ-инфекцией в 2017 году составил 795,3 зараженных ВИЧ на 100 тысяч населения России [1]. С 2005 г. в стране регистрируется рост количества новых выявленных случаев заражения ВИЧ, в 2011–2016 гг. ежегодный прирост составлял в среднем 10%. Наиболее высокий уровень пораженности ВИЧ-инфекцией населения наблюдается в группе 30–39 лет, 2,8% российских мужчин в возрасте 35–39 лет живут с установленным диагнозом ВИЧ-инфекции. Женщины инфицируются ВИЧ в более молодом возрасте, уже в возрастной группе 25–29 лет около 1% инфицированы, еще выше доля женщин живущих с ВИЧ в возрастной группе 30–34 г. – 1,6% [1].
Несмотря на то, что число ВИЧ-инфицированных продолжает неуклонно возрастать во всем мире, благодаря созданию препаратов антиретровирусной терапии (АРВТ), в середине 1990-х гг. ВИЧ-инфекция приобрела характер хронического заболевания в развитых странах [2]. Заметно сократилась трансформация бессимптомной и малосимптомной ВИЧ-инфекции в синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД), и соответственно снизилась смертность, обусловленная СПИД-ассоциированными заболеваниями. Лечение включает в себя трехкомпонентную схему АРВТ, целью которой является подавление вируса и снижение количества РНК ВИЧ до неопределяемых значений во всех биологических жидкостях [3]. Внедрение АРВТ и создание новых, более эффективных и безопасных препаратов не только увеличило продолжительность, но и повысило качество жизни людей живущих с ВИЧ. Успехи, достигнутые в сфере снижения рисков вертикальной и горизонтальной передачи ВИЧ, позволили рассматривать возможность безопасной реализации репродуктивной функции парам с ВИЧ-инфекцией одного (серодискордантные) или обоих (конкордантные) партнеров [4].
Самым распространенным способом передачи ВИЧ-инфекции во всем мире является гетеросексуальный половой путь, однако, по данным K. Mayer и соавт., вероятность горизонтальной передачи ВИЧ от мужчины к женщине при однократном половом контакте даже при отсутствии АРВТ составляет лишь 0,2–0,8% [5]. Главным прогностическим критерием передачи ВИЧ-инфекции является уровень вирусной нагрузки в плазме крови и семенной плазме. Доказана эффективность применения АРВТ в снижении уровня РНК ВИЧ в плазме крови и в снижении риска передачи ВИЧ-инфекции [6]. По результатам исследования, проведенного в 2010 г., в котором приняли участие 648 серодискордантных гетеросексуальных пар, было выявлено, что половой путь является основным путем инфицирования ВИЧ-инфекцией [7]. В парах, где ВИЧ-инфицированный партнер принимал АРВТ не наблюдалось заражения серонегативного партнера, в то время как в паре, где партнер не получал АРВТ трансмиссия ВИЧ-инфекции составила 9,8%. В первой группе зарегистрировано более 7000 незащищенных половых актов и наступило 47 естественных беременностей, причем вертикальной передачи ВИЧ не было зарегистрировано. В то же время во второй группе, где имели место 11 000 незащищенных половых актов и наступили 50 естественных беременностей, вертикальная трансмиссия выявлена в 5 случаях. Последние исследования показали, что более длительное применение АРВТ связано с еще более значительным сокращением передачи ВИЧ-инфекции, особенно если ВИЧ положительный партнер имеет ≤550 CD4+ клеток/мл [8, 9].
Большое влияние на консультирование ВИЧ-дискордантных пар, желающих иметь детей, оказали опубликованные в январе 2008 г. рекомендации федеральной комиссии по вопросам СПИДа [10]. В заявлении Швейцарской комиссии по вопросам СПИДа (EKAF) утверждалось, что ВИЧ-положительные мужчины не передают ВИЧ при половых контактах при следующих условиях: 1) ВИЧ-инфицированный пациент получает АРВТ под контролем врача; 2) вирусная нагрузка сохраняется на неопределяемом уровне на протяжении, как минимум 6 месяцев (подавление виремии); 3) отсутствуют другие инфекции, передаваемые половым путем. Заявление EKAF не исключает остаточного риска передачи инфекции, однако он является настолько небольшим, что им можно пренебречь. Основой для данного вывода послужили результаты долгосрочных исследований по гетеросексуальным серодискордантным парам, желающим иметь детей [11]. В ходе этих исследований не было получено сообщений о передаче ВИЧ-инфекции от партнера, получающего АРВТ или имеющего вирусную нагрузку на фоне отсутствия лечения менее 1000 копий/мл. Данная точка зрения подверглась критике со стороны Wilson и соавт., так как риск передачи ВИЧ-инфекции в гетеросексуальных парах при применении АРВТ является низким, но не исключен полностью [12]. Vernazza и соавт., опубликовали протокол химиопрофилактики (PrEP) для минимизации риска ВИЧ-инфицирования, включающий следующие рекомендации: 1) АРВТ в непрерывном режиме; 2) вирусная нагрузка ниже уровня ее индикации с помощью ультрачувствительной полимеразной цепной реакции (ПЦР), то есть концентрации РНК ВИЧ в плазме крови <10 копий/мл; 3) нормальные показатели спермограммы (нормозооспермия); 4) отсутствие симптомов половых инфекций, незащищенных половых контактов с другими партнерами; 5) использование теста на овуляцию; 6) предварительная химиопрофилактика тенофовиром 300 мг (первая доза на пике ЛГ, вторая доза через 24 часа); 7) после шести неудачных попыток необходима оценка фертильности [13]. Не было зарегистрировано ни одного случая заражения ВИЧ-инфекцией. Предварительная химиопрофилактика и своевременное лечение являются потенциальной альтернативой методам ВРТ для фертильных пар.
Впервые в 1985 г. Stewart и соавт. отметил, что трансмиссия ВИЧ может осуществляться посредством спермы, используемой при внутриматочной инсеминации. ВИЧ содержится в сперме инфицированного мужчины в виде: 1) свободных вирусных частиц; 2) в лимфоцитах и макрофагах, которые являются основным резервуаром вируса [14]. Первоначально считалось, что ДНК ВИЧ может присутствовать в сперматозоидах и сперматогониальных стволовых клетках [15]. Однако последующие исследования не выявили наличие рецепторов ВИЧ, необходимых для проникновения в клетку, на поверхности сперматозоидов, а именно CD4, CXCR4 и CCR5 [16].
У мужчин, не получающих АРВТ, концентрация ВИЧ-1 РНК в сперме в 10 раз меньше, чем в плазме крови. В ответ на АРВТ у подавляющего большинства происходит параллельное снижение вирусной нагрузки в спермальной плазме и в крови. Тем не менее, у некоторых пациентов спорадически обнаруживается РНК ВИЧ в сперме, несмотря на стабильный или даже неопределяемый уровень вирусной нагрузки в периферической крови. Persico и соавт., выявили, что 6 из 7 образцов семенной плазмы, в которых обнаружили вирусные РНК ВИЧ, принадлежали пациентам, получавшим АРВТ. У 4 мужчин был повышен уровень вирусной нагрузки, у 3 – неопределяемая виремия [17].
Эти данные подтвердили результаты предыдущих сообщений о несоответствии концентрации РНК ВИЧ в крови и семенной плазме [18]. Такие результаты авторы интерпретируют по разному: 1) частицы ВИЧ могут синтезироваться локально в мужском генитальном тракте, что объясняет наличие отдельных популяций ВИЧ в эпидидимисе и простате [19]; 2) местное воспаление может увеличивать уровни РНК ВИЧ в сперме независимо от концентрации вируса в крови [20].
Несмотря на то, что на сегодняшний день зарегистрировано только два случая вирусной трансмиссии при использовании спермы после центрифугирования, пары, которые принимают участие в программах вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ), должны быть информированы о теоретическом риске заражения [21]. Однако снижение вирусной нагрузки до неопределяемого уровня может быть достигнуто, и это, безусловно, минимизирует риск передачи вируса половым путем.
На сегодняшний день нет однозначных данных относительно воздействия ВИЧ-инфекции на параметры сперматогенеза. Согласно исследованиям случай-контроль, проведенным в 2007 и 2011 году, целью которых было оценить воздействие ВИЧ на параметры сперматогенеза, в основной группе статистически значимо ухудшались такие параметры, как объем, концентрация и общая подвижность сперматозоидов по сравнению с ВИЧ-негативными мужчинами [22, 23]. Однако, данные результаты сомнительны, если учесть тот факт, что группа ВИЧ-инфицированных мужчин включала пациентов принимавших АРВТ. Соответственно, остается неясным, что именно повлияло на параметры спермограммы: сама ВИЧ-инфекция или АРВТ? В ряде других исследований не было выявлено никаких существенных различий в образцах спермы ВИЧ-положительных и ВИЧ-отрицательных мужчин [18, 24–26], за исключением тех случаев, когда резко ухудшалось общее состояние пациентов по причине прогрессирующей иммуносупрессии [26]. E. van Leeuwen в 2004 г. провела продольное исследование, сравнивая параметры сперматогенеза у ВИЧ-инфицированных на протяжении 2 лет. Ни один из параметров статистически значимо не изменился, однако прогрессивная подвижность сперматозоидов была изначально низкой и сохранялась такой на протяжении всего исследования у пациентов с уровнем CD4+ меньше 200 клеток/мм3 [25].
Отсутствует единая точка зрения относительно воздействия АРВТ на показатели сперматогенеза у ВИЧ-инфицированных мужчин. Согласно данным Nicopoullos и соавт., АРВТ может оказывать негативное влияние на показатели сперматогенеза, что проявляется в снижении концентрации, подвижности сперматозоидов, увеличении количества патологических форм [27].
Robbins и соавт., напротив, при оценке качества спермы у 26 мужчин не выявили отрицательного воздействия АРВТ на параметры сперматогенеза [28]. Тем не менее, все чаще появляются сообщения, что прием АРВТ, в частности препаратов старой генерации нуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы (НИОТ), способствует нарушению целостности ДНК сперматозоидов, а также приводит к снижению количества митохондриальной ДНК [29, 30]. Теоретически, проникновение в сперматозоиды препаратов группы НИОТ, может обусловливать митохондриальную токсичность сперматозоидов, что, в свою очередь, приводит к снижению их подвижности. Можно выделить несколько основных механизмов возникновения митохондриальной токсичности [31]: 1) прямое ингибирование митохондриальной ДНК-полимеразы; 2) влияние на цикл Кребса и β-окисление жирных кислот; 3) влияние на эффективность карнитин-зависимого транспорта жирных кислот через мембрану митохондрий; 4) возможное влияние на АМФ-активируемую протеинкиназу, контролирующую энергетический баланс клетки. В настоящее время прямое ингибирование митохондриальной ДНК-полимеразы подробно изучено. Оно характерно для зальцитабина, диданозина, ставудина – препаратов, которые в настоящее время редко применяются, и в гораздо меньшей степени – для широко применяемого ламивудина. Эти препараты, вернее их трифосфорилированные формы, нарушают синтез митохондриальной ДНК и ингибируют эксцизионную репарацию дефектов, возникающих в ее структуре [32]. В результате число митохондрий в клетках уменьшается, при этом ДНК мутирует, делеции и большие вставки практически полностью нарушают экспрессию митохондриальных генов. Токсический эффект, обусловленный этим процессом, не зависит от ткани и может быть полностью устранен только отменой препаратов. Данные литературы, посвященные оценке митохондриального потенциала сперматозоидов немногочислены и весьма противоречивы. Так, согласно исследованиям Pavili и соавт., препараты группы НИОТ снижают число копий митохондриальной ДНК в сперматозоидах [33]. Однако, по данным более современного исследования L. van Leewen и соавт., количество копий митохондриальной ДНК в сперматозоидах ВИЧ-инфицированных мужчин, длительно получающих АРВТ, повышается по сравнению с ВИЧ-инфицированными, никогда не принимавшими АРВТ и серонегативными мужчинами [34].
Для предотвращения передачи ВИЧ-инфекции в серодискордантных парах с ВИЧ-положительным партнером в 1992 г. Sempirini и соавт. разработали метод обработки спермы «gradient/swim up», основанный на отделении инфицированных CD4+, макрофагов и свободных ВИЧ-частиц от подвижных сперматозоидов. Образцы спермы получают посредством мастурбации после 3–5 дней сексуального воздержания [35].
Метод обработки спермы «gradient/swim up», представляет собой трехступенчатую процедуру. На первом этапе сперма подвергается центрифугированию через градиент, образованный, двумя (классический метод) или тремя [36] слоями растворов с возрастающей плотностью (масса/объем), содержащих различные концентрации частиц коллоидного кремния, соответственно разделение компонентов (клеток) эякулята происходит по их удельному весу и плотности. Таким образом, образцы спермы сначала наслаивают на 40-–80% или 90–70–45% [36] градиент плотности, после чего выделенные сперматозоиды подвергают центрифугированию при 400 g в течение 30 минут. Далее супернатант удаляют и чистую фракцию сперматозоидов помещают в питательную среду (3 мл) и центрифугируют при 400 g в течение 10 минут. Супернатант снова удаляют и на обогащенную фракцию сперматозоидов осторожно наслаивают 1 мл питательной среды, после чего пробирку помещают в инкубатор на 1 час при 37°С. После «всплытия» (swim-up) обработанная сперма (около 1 мл) делится на 3 аликвоты: 1-я используется для оценки основных параметров сперматогенеза; во 2-й определяется наличие или отсутствие РНК ВИЧ методом ПЦР; 3-я криоконсервируется, а после получения отрицательных результатов ПЦР размораживается и используется в программах ВРТ. В случае обнаружения РНК ВИЧ аликвота утилизируется.
Метод обработки «gradient/swim up» длительный и требует квалифицированного персонала. Politch и соавт., продемонстрировали, что после данной процедуры около 5% активных фракций сперматозоидов остаются ВИЧ-позитивными, поэтому разработали метод – «двойной трубный градиент», который использует такой же подход, однако градиент формируется внутри трубки [37]. Этот метод является более легким и быстрым в исполнении по сравнению со стандартным, и по мнению авторов, более надежный для элиминации ВИЧ.
Hanabusa и соавт. считают, что обработка спермы с помощью центрифугирования является недостаточной для удаления РНК ВИЧ из спермы и должна сочетаться с дополнительной обработкой на этапе разделения сперматозоидов [38]. В 2005 г. Loskutoff и соавт. опубликовали новый метод [39]. Они выдвинули гипотезу, что важным этапом является удаление слоев верхнего градиента плотности (включающих потенциально инфицированную семенную плазму) путем аспирации. Поэтому они разработали и изготовили новую полипропиленовую трубку, которая позволяет не только получить доступ к очищенным фракциям сперматозоидов без какого-либо риска их контаминации верхними слоями (потенциально инфицированными), но и облегчает наслоение градиентов плотности.
Применение классического метода «gradient/swim up» существенно снижает общую концентрацию сперматозоидов, так в готовом образце остается лишь 5% всех подвижных сперматозоидов, что ограничивает использование данного метода при исходно низких параметрах сперматогенеза. В связи с этим был разработан специальный протокол для пациентов с олиго- или азооспермией, когда сперматозоиды можно извлечь только путем их аспирации из эпидидимиса (МESA) или экстракции из яичка (TESE), где методы их обработки на основе градиентного центрифугирования и флотации совершенно непригодны из-за слишком малого числа выделяемых клеток. В таких случаях некоторыми авторами предлагается отмывать сперматозоиды с применением микроманипулятора, перемещая каждый сперматозоид (с помощью микроинъекционной пипетки микроманипулятора) не менее 4 раз из капли в каплю стерильной отмывочной среды, содержащей 8% раствор [40]. Использование данной технологии расширяет возможности по оказанию помощи ВИЧ-инфицированным мужчинам, поскольку она позволяет достаточно надежно отмывать сперму даже при получении единичных сперматозоидов, что очень актуально для пациентов с крайне тяжелыми формами мужского бесплодия.
С 1992 г. было разработано множество различных методик обработки спермы, большинство из которых основывалось на классическом методе [41–43]. Однако все исследователи едины во мнении, что невозможно гарантировать полное отсутствие вирусных частиц в обработанной сперме.
Так, частота выявления РНК ВИЧ методом ПЦР, по разным данным, колеблется от 4 до 10% при двухградиентном (классическом) методе обработки спермы, и составляет 1,86% при трехградиентном способе обработки спермы [36, 42, 44].
Существует несколько методов определения вирусной нагрузки: 1) ВИЧ-РНК-ПЦР; 2) метод разветвленной ДНК (branch-DNA (bDNA); 3) метод амплификации нуклеиновых кислот (NASBA). Наиболее часто используются ультрачувствительная РНК ПЦР (для крови) с аналитической чувствительностью 5–10 коп/мл и стандартная ПЦР РНК ВИЧ (20–50 коп/мл). Метод основан на выявлении специфического фрагмента РНК ВИЧ в сперме и позволяет провести его количественную оценку [45]. Важно отметить, что сперма является сложным для проведения ПЦР биологическим образцом, в связи с большим количеством различных ингредиентов, мешающих проведению реакции. В 2006 г. Persico и соавт. провели сравнительный анализ двух методов ПЦР – стандартного (in situ) и «вложенной» ПЦР [17]. Характерной особенностью последнего метода является то, что в реакции последовательно участвуют две пары праймеров, при этом вторая пара праймеров участвует в амплифицикации фрагмента ДНК внутри продукта, полученного после завершения цикла реакций с парой внешних праймеров. Авторы пришли к выводу, что в настоящее время метод «вложенной» ПЦР является наиболее чувствительным, так как позволяет обнаружить одну копию РНК/ДНК ВИЧ в исследуемом образце.
Применение программ ВРТ в серодискордантных по ВИЧ супружеских парах показано в следующих случая: 1) при исходном снижении фертильности у одного или обоих супругов [42]; 2) после шести неудачных попыток «естественного зачатия» в овуляторные дни [46, 47]; 3) при исходном желании ВИЧ – отрицательного партнера с целью минимизации рисков горизонтальной передачи ВИЧ [29]. Не стоит забывать, что большинство мужчин, желающих реализовать репродуктивную функцию с установленным диагнозом ВИЧ, находятся в возрасте 35–40 лет и состоят в браке с супругами аналогичного возраста [42]. В данных парах снижается вероятность наступления «естественной» беременности в силу возраста ВИЧ-отрицательных женщин, что и содействует изначальному выбору программ ВРТ. Большинство специалистов отвергают идею естественного зачатия в овуляторные дни и предпочитают сразу применять методы ВРТ с обработанной спермой, включающие, в зависимости от клинической ситуации, внутриматочную инсеминацию (ВМИ) спермой мужа, ЭКО или интрацитоплазматическую инъекцию сперматозоида (ИКСИ) [48, 49]. В разных центрах мира имеются свои собственные критерии для включения ВИЧ-положительного мужчины в программу ВРТ. В некоторых центрах Великобритании [50] и США, критерием включения является стабильность стадии ВИЧ-инфекции в течение 6 месяцев: уровень вирусной нагрузки <50000 копий/мл, количество CD4 клеток >250/мм3 [49]. В других центрах, например в
Милане [44], не существует никаких ограничений в отношении уровней вирусной нагрузки и CD4+ клетках. В Российской Федерации, согласно приказу Минздрава № 107н от 30 августа 2012 г, по эпидемиологическим показаниям ВРТ рекомендуют проводить в дискордантных парах на фоне приема АРВТ, при достижении неопределяемого уровня РНК ВИЧ в крови в двух последовательных исследованиях с интервалом не менее 3 месяцев и после получения консультации врача – инфекциониста Центра по профилактике и борьбе со СПИДом [51].
Впервые программа ВРТ, а именно ВМИ, была предложена серодискордантным парам с ВИЧ-инфицированным мужчиной в Италии в 1992 г. [35].
В Европе и Великобритании имеется огромный опыт ВМИ и ЭКО у серодискордантных пар с ВИЧ-инфекцией [44, 52]. Однако в последние годы ИКСИ является единственным рекомендуемым методом в некоторых странах, таких, как США. Преимущество ИКСИ перед ВМИ состоит в: 1) уменьшении вероятности инфицирования, поскольку в контакт с ооцитом входит единственный сперматозоид, тем более, что достоверных сведений о возможности внутриспермальной локализации вируса нет [41]; 2) частота наступления беременности в программах ЭКО/ИКСИ выше в 3 раза, чем при использовании ВМИ (40–45% против 10–13%) [53]; 3) нет необходимости в большом количестве сперматозоидов, т.к. после обработки их концентрация снижается до 5% исходной, что недостаточно для использования при ВМИ [41]. В то же время в некоторых странах, например в Голландии, применение ИКСИ в серодискордантных парах с инфицированным мужчиной запрещено, поскольку не исключается, что введение возможно зараженного сперматозоида непосредственно в ооцит теоретически может привести к активации продукции ретровируса из эмбриона. Но современные исследования ставят под сомнение такую возможность. Действительно, интеграция ВИЧ в геном была продемонстрирована в исследовании при оплодотворении методом ЭКО ооцитов кошек, но только при очень высоком уровне РНК ВИЧ в эякуляте [54]. Однако при оплодотворении методом ИКСИ не было зарегистрировано ни одного случая диагональной передачи ВИЧ (то есть от отца к ребенку), в независимости от уровня вирусной нагрузки [55]. Следует еще раз подчеркнуть, что во многих других странах, в том числе в России, специалисты считают вполне оправданным и безопасным применение ИКСИ у ВИЧ-инфицированных мужчин и даже рассматривают указанный метод оплодотворения, как «золотой стандарт» оказания помощи таким пациентам [43, 56].
Для анализа эффективности и безопасности методов ВРТ в серодискордантных парах, где мужчина ВИЧ-инфицирован, проведены систематические обзоры [29, 55, 57]. Полученные данные весьма неоднозначны, так частота наступления беременности в программах ВРТ варьирует от 22 до 53,6% [44], а в исследованиях С. Marques сопоставима с серонегативным контролем [58]. Melo и соавт. в 2008 г. провели исследование, целью которого была оценка морфологических особенностей эмбрионов в программе ЭКО/ИКСИ с ВИЧ-положительным мужчиной, в сравнении с серонегативными по ВИЧ мужчинами группы контроля с трубно-перитонеальным фактором бесплодия. Полученные результаты продемонстрировали, что скорость оплодотворения, деления и параметры эмбриогенеза в 1-е и 3-и сутки культивирования эмбрионов не различались в обеих группах. На 5-е сутки культивирования эмбрионы, полученные в серодискордантных по ВИЧ парах, чаще останавливались в развитии, однако не была выявлена разница в количестве криоконсервированных и перенесенных эмбрионов, в частоте наступления имплантации и клинической беременности [59].
За время наблюдений не зарегистрировано ни одного случая сероконверсии в программах ВРТ с использованием метода обработки спермы. Однако рандомизированные контролируемые исследования с целью оценки эффективности использования обработанной спермы до сих пор не проведены по причине существующего риска передачи ВИЧ-инфекции.
Заключение
Таким образом, применение ВРТ у серодискордантных супружеских пар с ВИЧ-положительным мужчиной становится необходимым, главным образом, с целью снижения рисков вертикальной и горизонтальной передачи. Однако, несмотря на большое разнообразие способов обработки спермы, нет ни одного метода, способного полностью элиминировать РНК ВИЧ из спермы инфицированного мужчины.
На сегодняшний день отсутствуют однозначные данные о влиянии ВИЧ-инфекции и АРВТ на фертильность, качество сперматозоидов и их митохондриальный потенциал. Нет однозначных данных о влиянии обработанной спермы на исходы программ ВРТ, остается дискуссионным вопрос относительно исходов программ ВРТ у супружеских пар с ВИЧ-положительным мужчиной. Все это создает предпосылки для дальнейшего изучения этой проблемы, обуславливая необходимость разработки персонифицированного подхода к реализации репродуктивной функции у супружеских пар с ВИЧ-положительным мужчиной.
